一、中华鲟cystatin酵母工程菌的发酵条件和表达产物的纯化（论文文献综述）
孔德荣[1]（2017）在《红鳍东方鲀IFN-γ基因的重组表达及其免疫应答的研究》文中研究说明干扰素γ（interferon-gama,IFN-γ）是一类由特定免疫细胞分泌的多功能蛋白质。IFN-γ属于Ⅱ型干扰素,温度稳定性及耐酸性较差,易失活。但IFN-γ具有抑制肿瘤细胞生长、抗病毒、抗寄生虫感染、调节机体特异性免疫等功能,目前已将重组IFN-γ生物制剂应用于人乙型、丙型肝炎的治疗过程并取得了良好的治疗效果。因此,IFN-γ在治疗病毒性疾病、调节机体免疫力方面具有良好的应用前景。鱼类干扰素研究虽起步相对较晚,但成果较为显着,已通过基因工程等方法获得多种鱼的IFN基因及重组蛋白。本研究是利用基因工程方法构建重组工程菌获得具有生物学活性的重组蛋白。从NCBI获得红鳍东方鲀干扰素γ基因ORF序列,利用生物学软件分析其序列特征,获得成熟肽序列。根据密码子偏爱性对红鳍东方鲀IFN-γ成熟肽序列进行优化。优化后的序列与质粒pPICZαA相连,双酶切鉴定。利用限制性内切酶SacⅠ将重组质粒进行线性化,电转化整合到毕赤酵母GS115基因组中。用含有高浓度Zeocin的培养基进行高拷贝菌株的筛选,BMGY/BMMY液体培养基进行扩大培养及诱导表达,SDS-PAGE电泳检测获得分子量约为24 kDa的重组红鳍东方鲀IFN-γ蛋白粗品。细胞病变抑制法检测重组IFN-γ蛋白活性为2018 U/mL。将不同稀释度的重组蛋白液与标准品分别刺激受病毒感染的WISH细胞,测定各浓度下WISH细胞吸光度值并绘制增殖曲线,结果表明,重组红鳍东方鲀IFN-γ蛋白能够抑制病毒感染并促进WISH细胞增殖,与干扰素标准品具有一致的趋势。利用实验室已有的原核表达菌株进行红鳍东方鲀IFN-γ的重组表达,获得浓度为0.346mg/mL的重组IFN-γ蛋白,并对其效价进行检测,结果证明原核表达的重组IFN-γ蛋白活性效价为1.7×105 U/mL,比真核表达的重组IFN-γ蛋白活性高,该结果为后续免疫实验奠定基础。以不同浓度（25μg/mL rIFNg-γ为实验组1、50μg/mL r IFNg-γ为实验组2）的原核表达的重组IFN-γ蛋白免疫6月龄健康红鳍东方鲀,PBS作为对照组,于腹腔注射后6、12、24、36 h取肾脏组织。Trizol法提取组织总RNA,反转录cDNA第一链,实时定量PCR检测IFN-α、IFN-γ、MHCⅠ、Mx1基因特异性及其在肾脏组织内不同时间的表达量差异。结果显示,红鳍东方鲀免疫后6-36 h,IFN-α基因在实验组1中的表达呈现先上升后下降的趋势,24 h时表达量最高;在实验组2中的表达量在6 h最高,随后呈下降趋势。IFN-γ、MHCⅠ在免疫后6 h表达量都出现最大值且实验组1高于实验组2,随后呈下降趋势。Mx1基因的表达则出现上升趋势,24 h时表达量最高,随后下降。利用RNA-Seq分析红鳍东方鲀PBS组和IFN-γ组肾组织转录组,共测得Raw datas分别为29,939,506和24,630,588。原始数据经过滤后分别得到的Clean reads为29,415,565和23,943,395。通过差异基因筛选得到292个差异基因,其中171个在IFN-γ组肾组织中上调表达。GO、KEGG对差异基因进行分类和富集分析。对转录组进行SNP分析,两组分别得到118,876和114,091个SNP位点,其中转换型数量居多。
高宇[2]（2011）在《中华鲟抗菌肽HEPCIDIN的克隆、表达及其抗菌活性分析》文中提出hepcidin是一类新颖的小分子抗菌多肽,其不仅具有广谱抗菌活性,还被认为是一种关键的铁代谢调节因子,在鱼类中分布广泛。为有效防治养殖鱼类病毒、细菌（特别是耐药菌）和寄生虫感染的疾病,抗菌肽作为可替代抗生素的药物、饲料免疫添加剂等方面的研究已成为很多研究者关注的热点。本实验根据NCBI/GenBank上已登录鱼类hepcidin序列信息,根据序列的保守性,用Primer 5.0软件设计一对兼并引物（F1,R1）；表达引物（F2,R2）加入酶切位点和终止密码子,在上游表达引物F2中加入EcoR I限制性内切酶酶切位点,在下游表达引物R2中加入NotⅠ限制性内切酶酶切位点。利用RT-PCR方法,从中华鲟血液cDNA文库中克隆抗菌肽hepcidin基因；利用表达引物（F2,R2）对重组质粒进行PCR扩增,目的片段与表达载体pPICZaA都经过限制性内切酶EcoR I和NotⅠ分步双酶切后,T4连接酶16℃连接过夜,转化大肠杆菌TOP10,构建真核重组表达质粒pPICZaA-hepcidin,并送华大基因公司测序鉴定。重组表达质粒pPICZaA-hepcidin通过BstXI单酶切线性化、电泳,纯化回收酶切产物。电转化感受态的毕赤酵母工程菌GS115,转化后涂布含ZeocinTM培养基,筛选具有高抗性的转化子。先用BMGY培养液（含甘油）激活培养约24 h,OD600值达2-6时,收集菌液,换BMMY培养液,在28℃,250 rpm条件下开始甲醇诱导表达。每隔24 h,向锥形瓶中加入终浓度为0.8%的甲醇,并补充适量的无菌水,同时诱导pPICZaA空载体酵母菌。72 h后收集上述甲醇诱导表达后的上清液,用饱和度为85%的硫酸铵浓缩酵母诱导菌表达上清,对重组酵母菌表达上清液进行抑菌活性、抑菌效价和热稳定性测定,初步判断抗菌肽hepcidin的生物活性。结果显示：1、从中华鲟血液cDNA文库中成功克隆了抗菌肽hepcidin基因,目的片段长度为327 bp；成功构建了真核重组表达载体pPICZaA-hepcidin,而且该重组表达蛋白能够体外抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌和温和气单胞菌,并对耐药性菌株嗜水气单胞菌也有很好的杀菌效果,但是对枯草芽孢杆菌抑菌效果不明显,对迟缓爱德华氏菌没有抑菌作用。说明本研究成功在毕赤酵母中表达出具有生物活性的hepcidin重组蛋白。2、抑菌结果显示,加入70μL重组抗菌肽hepcidin就可以抑制260μL LB培养基中含有40μL大肠杆菌DH5α的生长,与1μg氨苄青霉素的抑菌效果相当。3、重组抗菌肽hepcidin的热稳定性测定结果显示,重组抗菌肽hepcidin煮沸10min和30 min均有抗菌活性,但是相比未煮沸的重组抗菌肽hepcidin,抗菌活性有所降低；煮沸1 h,重组抗菌肽hepcidin失去抗菌活性。表明该蛋白在预防和治疗鲟科鱼类细菌性疾病方面有潜在的应用价值,诱导表达出具有活性的抗菌肽,并为抗菌肽的应用研究及其大规模生产奠定了基础。
樊英,李天保,杨秀生,王建华,滕达[3]（2010）在《巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的优化策略》文中指出巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统已成为外源蛋白最理想的表达系统之一,诸多的优点体现了其广泛的研究价值和应用价值。综述了P.pastoris表达外源蛋白时在载体选择与利用、外源基因改造、翻译后修饰及表达稳定性等方面的优化策略,以加速其应用。
黄君,张昌毅,赵述淼,梁运祥[4]（2008）在《黑曲霉内切β-1,4-葡聚糖酶在毕赤酵母中的高效表达》文中指出利用RT-PCR技术,提取黑曲霉（Aspergillusniger）L3的总RNA进行反转录,并通过PCR扩增得到去除天然信号肽的β-1,4-葡聚糖酶基因egⅠ,将其插入到毕赤酵母表达载体pPIC9k上,使之位于α-因子信号肽下游,并与之同框,构建重组表达质粒pPIC9k-egⅠ,电击转化毕赤酵母GS115,经MM、MD、CMC-Na和G418平板筛选,得到重组毕赤酵母工程菌1#和5#,在摇瓶中β-1,4-葡聚糖酶酶活分别达到1456U/mL和1928U/mL。重组酶最适温度为70℃,最适pH为5.0。
黄君[5]（2008）在《黑曲霉内切β-1，4-葡聚糖酶基因的克隆，优化及在毕赤酵母中的表达研究》文中认为内切β-1,4-葡聚糖酶（EC3.2.1.4）是一种重要的工业用酶,广泛应用于饲料工业,酿造业等领域。随着生产的发展,β-1,4-葡聚糖酶需求量日益增加。本实验的主要目的就是,从分泌热稳定性的β-1,4-葡聚糖酶的黑曲霉高产菌株中,克隆该基因,利用基因工程手段实现高效表达,满足工业生产的需求。实验首先是利用RT-PCR技术,提取黑曲霉（Aspergillus niger）L3的总RNA进行反转录,并通过PCR扩增得到去除天然信号肽的β-1,4-葡聚糖酶基因egⅠ,将其插入到毕赤酵母表达载体pPIC9k上,使之位于α-因子信号肽下游,并与之同框,构建重组表达质粒pPIC9k-egⅠ,电击转化毕赤酵母GS115,经MM、MD、CMC-Na和G418平板筛选,得到重组毕赤酵母工程菌1-1#和1-5#,在摇瓶发酵水平上,以0.5%的β-葡聚糖为底物检测,酶活分别达到1 456 U/mL和1 928 U/mL。重组酶最适pH为5.0,最适反应温度为70℃,在70℃时保温30 min后仍然具有90%以上的活力。为了进一步提高表达量,根据毕赤酵母偏爱的密码子优化来源于A.niger L3的内切β-1,4-葡聚糖酶的DNA序列,共改变193个碱基,G+C%由54%下降到44.22%。设计了14对寡聚核苷酸引物,采用重叠延伸PCR三步法获得全长基因序列共改变。将其插入到毕赤酵母表达载体pPIC9K上,构建重组表达质粒pPIC9k-syn-egⅠ,电击转化毕赤酵母GS115,经MM、MD、CMC-Na和G418平板以及摇瓶筛选,得到重组毕赤酵母工程菌2-7#。摇瓶发酵条件下,以0.5%的葡聚糖和1%的CMC-Na为底物检测,酶活分别达到3 658 U/mL和591.9 U/mL;采用50 L发酵罐进行发酵,酶活则分别达到65 649.6 U/mL和39 728.32 U/mL。
高春生[6]（2008）在《淇河鲫肌肉营养成分分析及生长激素基因cDNA克隆和表达的研究》文中指出淇河鲫（Carassius auratus gibelio var）原产于河南省淇河,以生长快、味道美和效益高等优点而久负盛名,河南省人民政府已正式行文将其列入《河南省重点保护野生动物名录》并以第一名予以公布。为了繁荣市场,丰富人民生活,发展池塘养殖已变得日益迫切,对淇河鲫的生物学特性、生长变化规律等方面的研究已成为重要的课题。而动物的生长和发育受多种因素的调节和控制,包括遗传,营养,环境和内分泌等。在内分泌系统中,生长激素（GH）占据着中心调节作用的位置,它是由脑垂体间叶细胞分泌的一种多肽激素,具有调节生长发育,参与体内代谢调节,增进食欲,提高食物转化率等作用,然而垂体中GH含量极低,分离纯化比较困难,使得GH生理功能的进一步研究和应用受到限制。随着现代生物技术的发展,已有研究表明基因重组的GH与天然的GH一样具有生物活性,基因重组GH应用于研究和生产已经成为可能。因此,我们以淇河鲫作为研究对象,通过含肉率测定、肌肉生化成分分析,对其品质、营养价值作出初步评定,为淇河鲫营养生理的研究提供理论基础;用RT-PCR和RACE技术从淇河鲫垂体总RNA中扩增获得了淇河鲫GH全长cDNA序列,并对核苷酸和氨基酸序列进行了分析,构建了淇河鲫GH基因的原核和真核表达载体,获得了相应的重组基因工程菌,并对基因工程菌进行了诱导表达研究,为下一步开展淇河鲫GH的生物活性检测、转基因鱼研究以及研制开发成为安全、高效的新型调节鱼类生长的基因制剂奠定坚实的基础。主要结果如下:1)淇河鲫肌肉营养成分分析及营养价值评定淇河鲫是含肉率（65.72%）较高的鱼类;肌肉水分、蛋白质、脂肪、灰分含量分别为75.56%、19.39%、2.96%、1.17%;氨基酸分析表明,淇河鲫肌肉氨基酸总量（18.22%）、必需氨基酸量（7.37%）均较高,必需氨基酸占氨基酸总量的百分比（40.45%）和必需氨基酸与非必需氨基酸的比值（0.68）均符合WHO/FAO提出的40%左右和在0.60以上的要求,而且必需氨基酸含量高于婴儿需要量为底限的WHO/FAO评分模式;尤其是赖氨酸含量较丰富,达到鸡蛋蛋白质评分模式标准,较WHO/FAO评分模式高出30.0%,可以认为淇河鲫是一种营养丰富的优质鱼。2)克隆并获得了淇河鲫GH全长cDNA序列淇河鲫GH cDNA序列全长1191 bp,其中含Poly（A） 14 bp, 5’端非编码区长55 bp （含有在真核生物中高度保守的Kozak序列）,阅读框长633 bp,3’端非编码区长503bp（含真核生物mRNA前体3’剪切和加poly（A）尾的信号ATTAAA序列）,共编码210个氨基酸;编码的蛋白的分子量为23.78 ku。蛋白质结构分析表明淇河鲫GH信号肽为前22个氨基酸,成熟肽为188个氨基酸,成熟肽中有四个半胱氨酸（C）,形成两个二硫键,对GH的正常折叠、维持空间结构以发挥有效的生理功能有着重要作用。3)分析并揭示了淇河鲫GH基因结构和脊椎动物进化的关系通过对不同分类地位脊椎动物GH基因的核苷酸序列和氨基酸序列深入分析发现:①GH家族有三个非常保守的区域,以淇河鲫GH氨基酸序号为标准,第28位到第44位、第70位到第111位、第180位到第210位;特别是从第180位到第210位这个区域高度保守,含有的非极性氨基酸达10个（其中3个半胱氨酸）,为分子的疏水区,与GH分子的结构及稳定性有关;此外,除去信号肽部分,有30个氨基酸在所比较的动物中完全相同,可以认为这30个氨基酸残基对GH专一性、生物活性及空间构象有重要的作用。②成熟的GH是从一个共同的祖先进化而来,随着生物的进化过程,GH趋异进化成不同物种的GH分子;淇河鲫和鲤形目鱼类GH分歧较早,鲶形目鱼类的GH分歧次之,鲑鳟鱼类的GH分歧较晚,两栖类、禽类和哺乳类动物GH分歧最晚。4)构建了淇河鲫GH基因的原核表达载体并获得了重组蛋白本研究在原核表达载体pQE30上成功插入了淇河鲫GH基因,成功构建获得了pQE30-GH原核表达载体,通过测序验证构建的表达载体结构和序列正确无误。该载体经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳检测在约24 ku处获得了表达产物,经薄层扫描分析重组蛋白表达量较低,占菌体蛋白的6.6%。5)构建了淇河鲫GH基因毕赤酵母真核表达载体pPIC9K-GH,并获得了基因工程菌和重组蛋白。构建了淇河鲫GH基因真核表达载体pPIC9K-GH,该载体经电转化获得了整合有淇河鲫GH基因的重组毕赤酵母基因工程菌,重组菌经甲醇诱导后,成功获得了重组蛋白;表达条件优化试验结果表明,培养液的pH值、甲醇诱导浓度、诱导时间均对重组蛋白的表达有较大影响,其中诱导重组菌表达的适宜甲醇浓度为0.5～0.75%,适宜在弱偏碱性的培养液中表达,表达的最适pH值为7.0～7.5;诱导2天即达到最大表达量。
熊孝勇,劳海华,叶星,白俊杰[7]（2005）在《基因重组cystatin对鲢鱼糜肌球蛋白的保护作用初探》文中提出研究了基因重组中华鲟半胱氨酸蛋白酶抑制剂（recombinantChinesesturgeoncystatin）基因在毕赤酵母中的表达和以鲢为原料制作鱼糜过程中添加与未添加recombinantcystatin情况下肌球蛋白的含量变化趋势。结果表明重组cystatin对木瓜蛋白酶具有较强的抑制活性,曲线方程为y=0.0234x+0.0059。SDS PAGE电泳和分析结果表明添加重组cystatin可使鱼糜肌球蛋白具缓和内源性蛋白酶降解作用,具有明显的保护作用。
马冬梅,白俊杰,简清,劳海华,叶星,罗建仁[8]（2003）在《中华鲟cystatin酵母工程菌的发酵条件和表达产物的纯化》文中认为为进一步开展重组中华鲟（Acipenser sinensis）半胱氨酸蛋白酶抑制剂cystatin功能分析和应用研究,进行了诱导方式、诱导时间和培养基pH值对该重组菌的表达量的影响研究。结果表明,用直接诱导法,在诱导72 h、pH值为6.5、甲醇终浓度为0.5％的条件下,对重组酵母进行诱导最为合适,重组cystatin表达量可达每升培养基215 mg,约占培养基上清总蛋白量的76.3％。经离子交换层析法纯化,重组cystatin的纯度可达94.2％。生物活性检测试验表明。该方法提取的重组cystatin对木瓜蛋白酶的活性具有明显的抑制作用。
马冬梅,白俊杰,简清,劳海华,叶星,罗建仁[9]（2003）在《中华鲟半胱氨酸蛋白酶抑制剂在毕赤酵母中的表达和活性分析》文中研究说明为研究鱼类半胱氨酸蛋白酶抑制剂 （Cystatin）的功能并探索其在水产加工和病害防治中的应用潜力 ,将PCR改造后的编码成熟肽中华鲟 （Acipensersinensis）cystatin基因亚克隆到毕赤酵母整合型表达载体pPICZαA ,氯化锂法转化毕赤酵母菌株GS115 ,构建表达cystatin的酵母基因工程菌。经甲醇诱导、SDS PAGE检测培养基上清液 ,表明中华鲟cystatin在毕赤酵母中实现了高效表达 ,重组cystatin表达量约为 2 15mg·L- 1 。纯化后重组蛋白纯度达94 .2 %。生物活性检测结果表明 ,1μg重组中华鲟cystatin约能抑制 15 μg木瓜蛋白酶的水解活性
二、中华鲟cystatin酵母工程菌的发酵条件和表达产物的纯化（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、中华鲟cystatin酵母工程菌的发酵条件和表达产物的纯化（论文提纲范文）
（1）红鳍东方鲀IFN-γ基因的重组表达及其免疫应答的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 干扰素简介 |
| 1.1.1 干扰素的分类 |
| 1.1.2 干扰素的来源及功能 |
| 1.1.3 干扰素研究现状 |
| 1.2 干扰素 γ |
| 1.2.1 干扰素 γ 结构 |
| 1.2.2 IFN-γ 受体 |
| 1.2.3 IFN-γ 功能 |
| 1.2.4 IFN-γ 作用机制 |
| 1.2.5 IFN-γ 研究进展 |
| 1.2.6 红鳍东方鲀IFN-γ 研究现状 |
| 1.3 几种鱼类免疫因子研究概述 |
| 1.3.1 Mx蛋白 |
| 1.3.2 TNF |
| 1.3.3 趋化因子 |
| 1.3.4 MHC |
| 1.4 毕赤酵母表达系统研究进展 |
| 1.4.1 基因工程表达系统 |
| 1.4.2 毕赤酵母表达系统研究概述 |
| 1.4.3 鱼类基因在毕赤酵母中的表达 |
| 1.5 鱼类转录组分析 |
| 1.5.1 转录组和RNA-seq |
| 1.5.2 RNA-seq在鱼类中的研究进展 |
| 1.6 本研究目的与意义 |
| 第二章 红鳍东方鲀IFN-γ 真核表达及活性检测 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株与细胞 |
| 2.1.2 试剂及配方 |
| 2.1.3 仪器与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 真核表达载体的构建 |
| 2.2.2 毕赤酵母感受态细胞制备 |
| 2.2.3 电转化 |
| 2.2.4 高拷贝菌株的筛选 |
| 2.2.5 毕赤酵母高拷贝菌株的鉴定 |
| 2.2.6 蛋白诱导表达 |
| 2.2.7 重组蛋白活性验证 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 重组表达载体的构建 |
| 2.3.2 真核表达载体双酶切及线性化鉴定 |
| 2.3.3 毕赤酵母工程菌的鉴定 |
| 2.3.4 重组蛋白的表达 |
| 2.3.5 细胞培养与活性验证 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 红鳍东方鲀IFN-γ 相关免疫基因的实时定量分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 试剂盒、菌株、工具酶 |
| 3.1.3 仪器与设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 原核重组红鳍东方鲀IFN-γ 蛋白的制备 |
| 3.2.2 体内免疫试验及组织取样 |
| 3.2.3 干扰素相关免疫基因引物设计 |
| 3.2.4 组织RNA提取 |
| 3.2.5 反转录 |
| 3.2.6 实时定量PCR |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 重组蛋白在大肠杆菌中的表达 |
| 3.3.2 原核重组蛋白活性鉴定 |
| 3.3.3 组织总RNA提取及反转录 |
| 3.3.4 实时定量PCR引物检验 |
| 3.3.5 免疫基因的组织表达 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 红鳍东方鲀肾组织RNA-seq分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 组织RNA提取及检测 |
| 4.2.2 文库构建及上机测序 |
| 4.2.3 转录组生物信息学分析 |
| 4.3 结果及分析 |
| 4.3.1 转录组测序数据质量分析 |
| 4.3.2 测序数据比对到参考基因组(Mapping) |
| 4.3.3 基因表达量分析 |
| 4.3.4 差异基因的表达分析 |
| 4.3.5 SNP及可变剪接分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 RNA-Seq数据分析 |
| 4.4.2 鱼类对重组IFN蛋白的免疫应答 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（2）中华鲟抗菌肽HEPCIDIN的克隆、表达及其抗菌活性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 氨基酸及其缩写 |
| 第1章 文献综述 |
| 1 抗菌肽的分类 |
| 2 抗菌肽的结构与功能 |
| 2.1 α螺旋型抗菌肽 |
| 2.2 β折叠型抗菌肽 |
| 2.3 环状型抗菌肽 |
| 2.4 线型抗菌肽 |
| 2.4.1 富含脯氨酸抗菌肽 |
| 2.4.2 富含甘氨酸抗菌肽 |
| 3 抗菌肽的生物学功能 |
| 3.1 具有广谱抗菌活性 |
| 3.2 具有抗病毒作用 |
| 3.2.1 HSV |
| 3.2.2 HIV |
| 3.2.3 IVA |
| 3.3 具有抗原虫作用 |
| 3.4 抗肿瘤活性 |
| 3.5 免疫佐剂 |
| 4 鱼类抗菌肽其他方面的研究进展 |
| 5 抗菌肽基因的表达策略 |
| 5.1 原核表达系统 |
| 5.2 真核表达系统 |
| 5.2.1 哺乳动物细胞表达系统 |
| 5.2.2 杆状病毒表达系统 |
| 5.2.3 巴斯德毕赤酵母表达系统 |
| 6 本研究的目的,意义及内容 |
| 第2章 中华鲟抗菌肽hepcidin的克隆、表达及其抗菌活性分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验鱼 |
| 1.2 菌体与载体 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 溶液与培养基 |
| 1.4 实验仪器 |
| 1.5 引物 |
| 2 方法 |
| 2.1 中华鲟hepcidin的PCR扩增、克隆与鉴定 |
| 2.1.1 实验鱼的处理 |
| 2.1.2 Trizol法提取总RNA |
| 2.1.3 cDNA第一条链的合成及PCR扩增 |
| 2.1.4 PCR产物回收与纯化 |
| 2.1.5 目的基因的克隆与筛选 |
| 2.1.6 重组质粒的PCR鉴定 |
| 2.1.7 基因序列的测定与分析 |
| 2.2 重组真核表达载体pPICZαA-hepcidin的构建 |
| 2.2.1 目的基因的PCR扩增 |
| 2.2.2 PCR产物回收与纯化 |
| 2.2.3 目的基因的克隆与筛选 |
| 2.2.4 重组质粒的鉴定 |
| 2.2.5 基因序列的测定与分析 |
| 2.2.6 pMD19-hepcidin质粒与表达载体pPICZαA的分步双酶切 |
| 2.2.7 目的基因与真核表达载体的连接 |
| 2.2.8 重组质粒的转化 |
| 2.2.9 重组真核表达质粒的PCR鉴定 |
| 2.2.10 测序鉴定与分析 |
| 2.3 重组真核表达载体在毕赤酵母中的表达与抗菌活性分析 |
| 2.3.1 重组表达质粒pPICZαA-hepcidin的提取 |
| 2.3.2 重组质粒的线性化 |
| 2.3.3 酵母感受态细胞的制备 |
| 2.3.4 线性化重组质粒电转化酵母感受态细胞 |
| 2.3.5 阳性酵母菌落的筛选 |
| 2.3.6 高拷贝阳性菌株的诱导表达 |
| 2.3.7 体外抑菌实验 |
| 2.3.8 重组抗菌肽hepcidin的抑菌效价测定 |
| 2.3.9 重组抗菌肽hepcidin的杀菌效价测定 |
| 2.3.10 重组抗菌肽hepcidin的热稳定性检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 中华鲟hepcidin基因的鉴定 |
| 3.1.1 中华鲟RNA提取结果 |
| 3.1.2 中华鲟hepcidin基因的RT-PCR结果 |
| 3.1.3 中华鲟hepcidin基因的菌液PCR鉴定 |
| 3.1.4 中华鲟hepcidin基因的测序鉴定 |
| 3.2 中华鲟hepcidin真核表达载体的构建 |
| 3.2.1 重组表达质粒pPICZαA-hepcidin的双酶切结果 |
| 3.2.2 重组真核表达质粒的PCR鉴定 |
| 3.2.3 重组真核表达质粒的测序鉴定 |
| 3.3 中华鲟hepcidin基因的序列分析 |
| 3.3.1 中华鲟hepcidin核苷酸序列同源性分析 |
| 3.3.2 中华鲟hepcidin核苷酸序列构建系统发育树 |
| 3.3.3 表达载体的构建及测序结果分析 |
| 3.4 重组质粒pPICZαA-hepcidin的线性化 |
| 3.5 阳性重组酵母菌落的PCR鉴定 |
| 3.6 生物学活性检测 |
| 3.6.1 表达产物抗菌活性检测 |
| 3.6.2 重组抗菌肽hepcidin的抑菌效价 |
| 3.6.3 重组抗菌肽hepcidin的杀菌效价 |
| 3.6.4 重组抗菌肽hepcidin的热稳定性 |
| 4 讨论 |
| 4.1 引物设计与载体的选择 |
| 4.2 EcoR Ⅰ和Not Ⅰ双酶切位点的选择 |
| 4.3 目的基因内部结构对表达量的影响 |
| 4.4 诱导时间、温度和甲醇浓度对酵母表达的影响 |
| 4.5 重组抗菌肽hepcidin生物活性的测定 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间论文发表情况 |
| 附录 |
（3）巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的优化策略（论文提纲范文）
| 1 载体的选择与利用 |
| 1.1 启动子的选择 |
| 1.2 信号肽的选择与改造 |
| 1.3 载体选择标记、整合位点和方式 |
| 2 外源基因优化改造 |
| 2.1 密码子优化 |
| 2.2 调整GC/AT含量 |
| 2.3 优化基因5′-UTR组成及末端序列 |
| 2.4 基因剂量 |
| 2.5 基因融合 |
| 3 翻译后修饰 |
| 4 表达产物稳定性提高措施 |
| 5 结语 |
（4）黑曲霉内切β-1,4-葡聚糖酶在毕赤酵母中的高效表达（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株与质粒 |
| 1.2 工具酶与试剂 |
| 1.3 培养基 |
| 1.4 黑曲霉中egⅠ基因的分离 |
| 1.5 酵母重组表达载体的构建 |
| 1.6 毕赤酵母的转化及筛选 |
| 1.7 重组EGⅠ在酵母中的诱导表达 |
| 1.8 SDS-PAGE电泳 |
| 1.9 酶活检测 |
| 1.10 重组EGⅠ最适pH的测定 |
| 1.11 重组EGⅠ最适温度及温度稳定性测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 黑曲霉egⅠ基因的克隆 |
| 2.2 表达载体的构建 |
| 2.3 转化毕赤酵母重组子的筛选和鉴定 |
| 2.4 重组毕赤酵母表达产物的分析 |
| 2.5 重组EGⅠ最适pH的测定 |
| 2.6 重组EGⅠ最适作用温度和耐热性的测定 |
| 3 讨 论 |
（5）黑曲霉内切β-1，4-葡聚糖酶基因的克隆，优化及在毕赤酵母中的表达研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 β-葡聚糖概述 |
| 1.2 纤维素概述 |
| 1.3 β-1,4-葡聚糖酶 |
| 1.3.1 性质与分布 |
| 1.3.2 结构特征 |
| 1.3.3 基因工程研究 |
| 1.4 毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统 |
| 1.4.1 表达载体 |
| 1.4.2 宿主菌株 |
| 1.4.3 优化表达的策略 |
| 1.4.4 发酵条件优化 |
| 1.5 研究目的: |
| 第二章 黑曲霉来源的内切β-1,4-葡聚糖酶基因克隆及其在毕赤酵母中的表达 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 工具酶 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.1.4 培养基和部分溶液的配制 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 黑曲霉中菌丝RNA的提取 |
| 2.2.2 反转录 |
| 2.2.3 葡聚糖酶基因的克隆 |
| 2.2.4 序列测定 |
| 2.2.5 酵母重组表达载体的构建 |
| 2.2.7 重组酵母的构建 |
| 2.2.9 重组酵母的产酶发酵 |
| 2.2.10 酶活检测 |
| 2.2.11 SDS-PAGE电泳 |
| 2.2.12 重组酶的酶学性质 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 葡聚糖酶基因的克隆 |
| 2.3.2 葡聚糖酶基因序列的测定 |
| 2.3.3 表达质粒的构建及验证 |
| 2.3.4 重组酵母的筛选 |
| 2.3.5 重组酵母工程菌的产酶发酵 |
| 2.3.6 重组酶的酶学性质 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 内切β-1,4-葡聚糖酶基因优化及其在毕赤酵母中的表达 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌株与质粒 |
| 3.1.2 工具酶 |
| 3.1.3 试剂 |
| 3.1.4 培养基和部分溶液的配制 |
| 3.1.5 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 内切β-1,4-葡聚糖酶基因(egⅠ)密码子优化 |
| 3.2.2 密码子优化的内切β-1,4-葡聚糖酶基因的合成 |
| 3.2.3 重组表达载体的构建 |
| 3.2.4 重组表达载体pPIC9K-syn-eg Ⅰ的抽提和验证 |
| 3.2.5 重组酵母的构建 |
| 3.2.6 重组酵母的筛选 |
| 3.2.7 发酵条件的优化 |
| 3.2.8 发酵条件的优化 |
| 3.2.9 重组酵母发酵罐水平高密度发酵 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 密码子优化的内切β-1,4-葡聚糖酶基因syn-eg Ⅰ的合成 |
| 3.3.2 密码子优化的内切β-1,4-葡聚糖酶基因syn-eg Ⅰ的序列测定 |
| 3.3.3 重组表达载体的验证 |
| 3.3.4 重组酵母的筛选 |
| 3.3.5 发酵条件的优化 |
| 3.3.6 发酵罐水平的高密度发酵 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 密码子优化 |
| 3.4.2 基因合成技术 |
| 3.4.3 发酵条件的优化 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录1 Vector NTI Suite软件比对测序结果 |
| 附录2 硕士期间发表的论文情况 |
（6）淇河鲫肌肉营养成分分析及生长激素基因cDNA克隆和表达的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 鱼类生长激素的研究概况 |
| 1.1 淇河鲫简介 |
| 1.1.1 分类地位 |
| 1.1.2 生物学特性 |
| 1.1.3 生态习性 |
| 1.2 鱼类 GH 的研究进展 |
| 1.2.1 GH 及其家族 |
| 1.2.2 GH 的结构 |
| 1.2.3 GH 的合成、分泌和释放 |
| 1.2.4 GH 的生理功能 |
| 1.2.5 GH 的作用机制 |
| 1.2.6 GH 基因的分离、克隆、表达与序列分析 |
| 1.2.7 GH 的表达调控 |
| 1.2.8 GH 的测定方法 |
| 1.2.9 外源 GH 引入鱼体的途径和方法研究进展 |
| 1.2.10 GH 在水产养殖中的应用 |
| 1.3 本文研究的目的和意义 |
| 第二章 淇河鲫肌肉营养成分分析及营养价值评定 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验鱼 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 器具和仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 含肉率的测定 |
| 2.2.2 生化成分分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 含肉率 |
| 2.3.2 常规营养成分及含量 |
| 2.3.3 肌肉中氨基酸的组成及含量 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 淇河鲫和其它鱼类含肉率的比较 |
| 2.4.2 淇河鲫和其它鱼类常规营养特性的比较分析 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 淇河鲫生长激素基因CDNA 的克隆与序列分析 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 克隆质粒和菌株 |
| 3.1.2 主要药品和试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.1.4 培养基 |
| 3.1.5 溶液 |
| 3.1.6 试验鱼 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 引物的设计和合成 |
| 3.2.2 淇河鲫垂体总 RNA 的提取和检测 |
| 3.2.3 淇河鲫脑垂体总 RNA 的反转录 |
| 3.2.4 淇河鲫 GH cDNA 部分片段的扩增 |
| 3.2.5 淇河鲫 GH cDNA 3’端（下游区）片段的扩增 |
| 3.2.6 淇河鲫 GH cDNA 5’端（上游区）片段的扩增 |
| 3.2.7 目的片段的回收纯化 |
| 3.2.8 回收后 PCR 产物的连接反应 |
| 3.2.9 大肠杆菌感受态细胞的制备及其转化 |
| 3.2.10 重组质粒的筛选、克隆及保菌 |
| 3.2.11 重组质粒DNA 的少量提取 |
| 3.2.12 重组质粒的鉴定 |
| 3.2.13 重组质粒DNA 序列测定、DNA 序列分析和氨基酸序列的比较及系统进化树的构建 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 淇河鲫垂体总 RNA 的提取 |
| 3.3.2 淇河鲫 GH cDNA 部分片段的扩增 |
| 3.3.3 淇河鲫 GH cDNA 3’端序列的克隆 |
| 3.3.4 淇河鲫 GH cDNA 5’端序列的克隆 |
| 3.3.5 淇河鲫 GH cDNA 碱基序列与其它动物的同源性比较 |
| 3.3.6 淇河鲫 GH 氨基酸成分分析 |
| 3.3.7 不同动物 GH 氨基酸序列的同源性比较分析 |
| 3.3.8 鱼类 GH 和其它脊椎动物 GH 的进化分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 淇河鲫生长激素基因在大肠杆菌中的表达研究 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 菌株与质粒 |
| 4.1.2 主要药品和试剂 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.1.4 培养基 |
| 4.1.5 常用溶液及缓冲液 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 构建淇河鲫GH 基因原核表达载体的PCR 引物设计 |
| 4.2.2 淇河鲫GH 成熟肽序列的PCR 扩增 |
| 4.2.3 低溶点琼脂糖凝胶电泳回收、纯化、PCR 产物连接至pMD19-T 载体、转化及蓝白斑筛选、克隆及保菌 |
| 4.2.4 菌落PCR，检测菌落中插入片段的长度 |
| 4.2.5 将阳性菌落提取质粒DNA |
| 4.2.6 淇河鲫GH 基因原核表达载体的构建 |
| 4.2.7 重组工程菌的诱导表达 |
| 4.2.8 SDS-PAGE 电泳检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 淇河鲫GH 成熟肽PCR 扩增 |
| 4.3.2 菌落PCR，检测菌落中插入片段的长度 |
| 4.3.3 淇河鲫GH 原核表达质粒PQE30－GH 的构建及检测 |
| 4.3.4 重组菌的诱导表达 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 淇河鲫生长激素基因在毕赤酵母菌中的表达研究 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.1.1 菌株与质粒 |
| 5.1.2 主要药品和试剂 |
| 5.1.3 主要仪器设备 |
| 5.1.4 储液和培养基 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 构建淇河鲫GH 基因真核表达载体的PCR 引物设计 |
| 5.2.2 淇河鲫GH 成熟肽序列的PCR 扩增 |
| 5.2.3 低溶点琼脂糖凝胶电泳回收、纯化、PCR 产物连接至pMD19-T 载体、转化及蓝白斑筛选、克隆及保菌 |
| 5.2.4 菌落PCR，检测菌落中插入片段的长度 |
| 5.2.5 将阳性菌落提取质粒DNA |
| 5.2.6 表达质粒pPIC9k－GH 的构建 |
| 5.2.7 重组毕赤酵母工程菌的制备 |
| 5.2.8 重组毕赤酵母工程菌的诱导表达条件筛选 |
| 5.2.9 表达产物的纯化和活性检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 淇河鲫GH 成熟肽PCR 扩增 |
| 5.3.2 菌落PCR，检测菌落中插入片段的长度 |
| 5.3.3 淇河鲫GH 基因真核表达载体构建 |
| 5.3.4 重组毕赤酵母工程菌的诱导表达 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 附图 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（7）基因重组cystatin对鲢鱼糜肌球蛋白的保护作用初探（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料、试剂及主要仪器 |
| 1.1.1 试验材料 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.1.3 试验设备 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 基因重组cystatin的制备 |
| 1.2.2 重组cystatin活性分析 |
| 1.2.3 鱼糜样品的制作 |
| 1.2.4 温浴处理 |
| 1.2.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 1.2.6 凝胶扫描及图像处理 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 重组cystatin在酵母中的表达 |
| 2.2 重组cystatin活性测定 |
| 2.3 鱼糜样品SDS-PAGE电泳结果 |
| 2.3.1 重组cystatin对鲢鱼肌球蛋白的保护作用 |
| 2.3.2 AlphaeaseFCTM软件分析SDS-PAGE结果 |
| 2.3.3 MHC含量变化趋势图 |
| 3 分析与讨论 |
| 4 展望 |
（9）中华鲟半胱氨酸蛋白酶抑制剂在毕赤酵母中的表达和活性分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 中华鲟cystatin基因改造及表达载体的构建: |
| 1.2.2 转化酵母细胞: |
| 1.2.3 阳性克隆的筛选: |
| 1.2.4 重组酵母Mut表型鉴定: |
| 1.2.5 重组菌的诱导表达及SDS-PAGE检测: |
| 1.2.6 表达产物离子交换层析纯化: |
| 1.2.7 表达产物的活性分析: |
| 2 结 果 |
| 2.1 重组质粒的构建和鉴定 |
| 2.2 重组质粒转化酵母及阳性克隆的筛选和鉴定 |
| 2.3 重组菌的诱导表达及SDS-PAGE检测 |
| 2.4 表达产物的离子交换层析纯化 |
| 2.5 表达产物的活性分析 |
| 3 讨 论 |
四、中华鲟cystatin酵母工程菌的发酵条件和表达产物的纯化（论文参考文献）
- [1]红鳍东方鲀IFN-γ基因的重组表达及其免疫应答的研究[D]. 孔德荣. 大连海洋大学, 2017(04)
- [2]中华鲟抗菌肽HEPCIDIN的克隆、表达及其抗菌活性分析[D]. 高宇. 华中农业大学, 2011(08)
- [3]巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的优化策略[J]. 樊英,李天保,杨秀生,王建华,滕达. 生物技术通报, 2010(12)
- [4]黑曲霉内切β-1,4-葡聚糖酶在毕赤酵母中的高效表达[J]. 黄君,张昌毅,赵述淼,梁运祥. 华中农业大学学报, 2008(05)
- [5]黑曲霉内切β-1，4-葡聚糖酶基因的克隆，优化及在毕赤酵母中的表达研究[D]. 黄君. 华中农业大学, 2008(02)
- [6]淇河鲫肌肉营养成分分析及生长激素基因cDNA克隆和表达的研究[D]. 高春生. 西北农林科技大学, 2008(11)
- [7]基因重组cystatin对鲢鱼糜肌球蛋白的保护作用初探[J]. 熊孝勇,劳海华,叶星,白俊杰. 南方水产, 2005(04)
- [8]中华鲟cystatin酵母工程菌的发酵条件和表达产物的纯化[J]. 马冬梅,白俊杰,简清,劳海华,叶星,罗建仁. 华中农业大学学报, 2003(06)
- [9]中华鲟半胱氨酸蛋白酶抑制剂在毕赤酵母中的表达和活性分析[J]. 马冬梅,白俊杰,简清,劳海华,叶星,罗建仁. 生物工程学报, 2003(05)