一、霍乱毒素B亚单位免疫佐剂的研究进展（论文文献综述）
曹洪恩[1]（2021）在《基于Tween 80复配体系的鼻腔黏膜免疫佐剂研究》文中研究表明对于常驻的传染性病原微生物,通过接种疫苗形成群体免疫从而产生免疫屏障是恢复正常学习、工作和生活状态唯一的办法。鼻腔黏膜免疫具有无需注射、施用方便和免疫效力高的特点,不仅能够诱导系统和黏膜免疫应答,而且还可以激发细胞免疫反应,已成为人们日益青睐的新接种途径。然而,由于重组蛋白和多肽抗原免疫原性弱以及鼻腔特殊的环境和结构特点,导致鼻用疫苗免疫活性低,需要开发新型鼻腔黏膜免疫佐剂,提高鼻用疫苗的免疫应答水平。本论文选择具有增强鼻腔给药作用或潜在免疫调节活性的表面活性剂与促进蛋白折叠的化学伴侣Tween80（T80）形成复配体系,将复配体系与模型抗原卵清蛋白（OVA）配伍,分析了 T80复合体系和OVA的相互作用;根据影响复配体系鼻腔黏膜免疫性能的物理化学性质,以及OVA在复配体系中的结构稳定性优化选择了佐剂的组成;研究了 T80复配体系的溶血活性和OVA模型疫苗的鼻腔黏膜免疫活性,并将具有较强免疫性能的T80复配体系与存在免疫调节活性的硒碳纳米粒子（Se/C）和模拟谷胱甘肽过氧化酶（GSH-Px）活性的二苄基二硒醚（DDSe）联用,实现了佐剂的协同免疫效应。研究结果可用于指导开发安全、高效、价格低廉以及易于生产的鼻腔黏膜免疫佐剂。1.通过佐剂组成的优化选择,得到了 T80与非离子表面活性剂Brij 30（B30）复配的2wt%T80/B30（4:6）小囊泡体系。T80/B30（4:6）总浓度低于cac时,T80/B30单体的烷基链与OVA残基非极性侧链及非极性侧链形成的疏水微区作用,使OVA的三级结构略有变化;T80/B30（4:6）总浓度在cac-cmc*之间时,T80/B30在OVA上的吸附对蛋白三级结构的影响不大;T80/B30（4:6）总浓度高于cmc*时,T80/B30混合胶束与OVA发生作用,对OVA的三级结构产生轻微的影响。2wt%T80/B30（4:6）小囊泡体系的粒径约为30nm,是疫苗佐剂的理想尺寸,且具有较低的表面张力和较小的接触角,有利于疫苗对鼻黏膜的润湿和铺展,OVA在该囊泡体系中的二级结构和三级结构保持相对完整。2 wt%T80/B30（4:6）体系存在较好的溶血安全性,诱导的OVA特异性IgG抗体滴度显着高于对照OVA（p<0.001）,其免疫应答类型是Th2型,介导体液免疫反应。2.选择与第2章中B30疏水尾链相同,但聚氧乙烯链明显较长的聚氧乙烯-9-月桂醚（P9LE）与T80复配。当T80/P9LE（4:6）总浓度在cac-cmc*之间时,OVA的荧光强度随T80/P9LE浓度增加变化很小;当T80/P9LE（4:6）总浓度大于cmc*后,T80/P9LE混合胶束与OVA发生较弱的相互作用,使OVA三级结构发生微小的变化。通过佐剂组成的优化选择获得了 2 wt%T80/P9LE（4:6）混合胶束体系,OVA在该体系中的二级结构和三级均比较稳定,且其溶血活性相对较低,诱导的OVA特异性IgG抗体滴度显着高于对照OVA（p<0.001）,激发Th2型免疫应答。与第2章中2 wt%T80/B30（4:6）相比,虽然2 wt%T80/P9LE（4:6）的鼻腔黏膜免疫活性低于2 wt%T80/B30（4:6）,但其溶血性明显好于2 wt%T80/B30（4:6）,且对抗原蛋白结构的影响很小。3.根据鼻腔黏膜在生理pH条件下带负电荷的特点,引入阳离子表面活性剂氯化十六烷基吡啶（CPC）,通过优化组成得到了 0.5 wt%T80/CPC（8:2）混合胶束体系。T80/CPC（8:2）的总浓度低于cac时,T80/CPC单体主要通过静电作用与OVA结合,OVA的荧光强度略微降低。T80/CPC（8:2）总浓度大于cmc*后,T80/CPC混合胶束与OVA作用,使OVA的三级结构发生轻微的变化。0.5wt%T80/CPC（8:2）体系具有较低的溶血活性,经鼻腔免疫小鼠后,产生的OVA特异性IgG抗体滴度显着高于对照OVA（p<0.001）,与阳性对照霍乱毒素B亚单位（CTB）接近。该体系明显增强了细胞免疫,激发了略偏向Th2型的混合型免疫反应,可在鼻黏膜和肺部诱导高水平的OVA特异性sIgA抗体。0.5 wt%T80/CPC（8:2）诱导的OVA特异性IgG抗体滴度与第2章中的2 wt%T80/B30（4:6）接近,但 sIgA 抗体水平显着高于 2 wt%T80/B30（4:6）（p<0.001）。4.将T80与阳离子电荷密度高、生活物相容性好的新型高分子阳离子表面活性剂PN320复配,通过组成的优化获得了 1 wt%T80/PN320（3:5）混合胶束体系。该体系与OVA复配后,Zeta电势约为20.31 mV,可在鼻腔黏膜较好地吸附,但又不会因过高的阳离子电荷密度产生细胞毒性;OVA在该体系中的α-螺旋结构是纯OVA的97.8%,荧光强度为纯OVA的85.1%（λex=295 nm）,较好地保持了蛋白结构的完整性。1 wt%T80/PN320（3:5）溶血活性低,诱导的IgG抗体滴度略高于第2章的2 wt%T80/B30（4:6）,明显高于第 3 章的 2 wt%T80/P9LE（4:6）（p<0.01）,与第 4 章的 0.5 wt%T80/CPC（8:2）和CTB相近,免疫应答类型为略微偏向于Th2型的混合免疫反应。1 wt%T80/PN320（3:5）在鼻黏膜和肺部产生的sIgA抗体水平显着高于2wt%T80/B30（4:6）（p<0.001）,是非常有潜力的鼻用疫苗佐剂。5.将论文中第2到第5章中具有优良鼻腔黏膜免疫活性的T80复配体系与存在免疫调节功能的Se/C和模拟GSH-Px活性的DDSe混合,实现了佐剂的协同免疫作用。与Se/C混合后,2 wt%T80/B30（4:6）体系和1 wt%T80/PN320（3:5）体系的免疫性能明显增强。1 wt%T80/PN320（3:5）+Se/C的鼻腔黏膜免疫活性明显强于2 wt%T80/B30（4:6）+Se/C,与CTB接近,且Se/C的加入使1wt%T80/PN320（3:5）的免疫应答类型从略偏向于Th2型的混合免疫反应转为略偏向Th1型的混合免疫反应,有效地增强了细胞免疫应答。合成的Se/C新材料还具有较强的抗菌性能,进一步拓展了佐剂的用途,如疫苗防腐和抗药性等。与DDSe联用后,0.5%T80/CPC（8:2）体系诱导的OVA特异性IgG和sIgA抗体水平显着提升,与CTB相近,且免疫应答类型从略偏向于Th2型的混合免疫反应转为略偏向Th1型的混合免疫反应,明显地增强了细胞免疫、体液免疫和黏膜免疫反应。
林丹敏[2]（2019）在《霍乱毒素样抗肿瘤嵌合蛋白佐剂的设计、制备及活性评价》文中认为抗癌疫苗因其能够激活自身免疫系统靶向攻击表达有肿瘤特异性抗原的癌细胞而被广泛关注。含有肿瘤抗原表位肽的亚单位疫苗因其独特的优势而成为抗癌疫苗的研发热点。然而,抗原表位肽免疫原性弱,体内易被降解,常常介导机体耐受,难以达到治疗肿瘤的目的。有效发挥疫苗抗肿瘤效应的关键在于打破免疫耐受,激活体内细胞免疫应答。前列腺癌的微环境中存在多种特异性肿瘤相关抗原（TAAs）,是研究抗癌疫苗的理想目标。使用前列腺癌TAAs作为抗原表位来源设计亚单位疫苗,需要佐剂帮助表位肽激活抗原提呈细胞（APC）,并经交叉提呈途径激活细胞免疫。由于目前常用的佐剂-肽混合物不能确保将二者共定位于同一个APC,因而疫苗的抗肿瘤活性不高。因此,基于完整的霍乱毒素（CT）六聚体的结构,将鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（mGM-CSF）通过基因工程方法融合表达到CTA2（霍乱毒素的A2亚基）的N端,并在霍乱毒素B亚基（CTB）的C端融合人源前列腺特异性膜抗原（PSMA）表位肽片段PSMA624-632,设计了CT样嵌合蛋白,并对其抗前列腺癌活性及机制进行了研究。研究方法:1.CT样嵌合蛋白mGM-CSF-CTA2/（CTB-PSMA624-632）5的获得。构建表达载体,通过大肠杆菌原核表达系统,分别以包涵体形式表达融合蛋白mGM-CSF-CTA2和CTB-PSMA624-632,柱层析纯化后在体外用柠檬酸-Tris碱变复性方法组装六聚体嵌合蛋白。2.CT样嵌合蛋白的生物学活性测定。以骨髓增殖实验和GM1-ELISA实验分别验证嵌合蛋白的mGM-CSF和CTB的活性。3.表达人PSMA的小鼠前列腺癌细胞的构建。以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）为报告基因构建表达人PSMA蛋白的质粒载体,将其转染入小鼠前列腺癌细胞RM-1,获得重组细胞株RM-1-PSMA。4.体内实验评估CT样嵌合蛋白的抗肿瘤活性。C57BL/6J小鼠滴鼻免疫CT样嵌合蛋白5次后接种RM-1-PSMA细胞,观察小鼠肿瘤生长情况及小鼠生存状态,测定荷瘤小鼠血清细胞因子IFN-γ的水平。5.CT样嵌合蛋白帮助增强PSMA624-632肽免疫原性的效果测定。小鼠免疫5次后,分离脾淋巴细胞,体外加入PSMA624-632肽进行刺激,观察脾淋巴细胞受刺激后的增殖能力。6.CT样嵌合蛋白诱导DC细胞成熟的效果测定。制备骨髓源DC细胞,体外经CT样嵌合蛋白诱导刺激后,通过形态学和流式细胞术检测成熟DC细胞的数量和表型比例,探索免疫激活的机制。7.嵌合蛋白激活CTL细胞的效果测定。过继回输成熟DC至C57BL/6J小鼠,处死小鼠后纯化脾T细胞并将其诱导为抗原特异性CTL（效应细胞）,通过LDH试剂盒检测效应细胞与靶细胞（RM-1-PSMA细胞）的杀伤活性,测定培养上清液中分泌细胞因子IFN-γ的水平。研究结果:1.成功制备了CT样嵌合蛋白。2.CT样嵌合蛋白与市售mGM-CSF具有同样刺激髓系细胞增殖的能力,且保留有CTB亚基结合GM1的能力。3.成功构建了RM1-PSMA-EGFP细胞株,成为评估嵌合蛋白抗肿瘤效果的模式细胞。4.在动物模型上验证了CT样嵌合蛋白的抗肿瘤活性。5.机理研究证明,CT样嵌合蛋白增强了抗原肽PSMA624-632的免疫原性,使用该嵌合蛋白刺激DC后能有效激活DC细胞的成熟,显着增强其产生诱导CTL杀伤靶细胞和刺激IFN-γ分泌的能力。结论:本研究设计制备的CT样嵌合蛋白,可以显着提高其所含肿瘤抗原表位肽的免疫原性,增强其诱导DC细胞成熟,激活CTL细胞的能力,为肿瘤亚单位疫苗佐剂的开发提供了新的策略,所构建的表达人PSMA蛋白的小鼠前列腺癌细胞可以用于其他抗肿瘤疫苗活性筛选。
郭芸芸[3]（2019）在《支原体纤毛黏附因子P97、鞭毛蛋白-CTB联合使用增强FMD灭活疫苗免疫原性的研究》文中研究说明口蹄疫（foot-and-mouth disease,FMD）是一种烈性传染病,由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus,FMDV）引起,发病急,传播方式多样。注射疫苗仍是现阶段防控口蹄疫的有效措施。因单独的灭活口蹄疫病毒大多免疫原性低,急需合适的佐剂提升其免疫效力。P97作为猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp）纤毛粘附因子,诱导以黏膜免疫和细胞免疫为主的免疫应答。鞭毛蛋白（Flagellin,F）是天然免疫应答的诱导剂,以偶联或融合形式作为佐剂已被频繁报道。霍乱毒素B亚基（Cholera toxin B subunit,CTB）具有良好免疫佐剂活性,黏膜途径免疫其效果更佳。本研究以P97、F7-CTB为佐剂,与口蹄疫灭活病毒或口蹄疫灭活疫苗混合的形式免疫接种小鼠及猪,通过检测特异性Ig G抗体、Ig A抗体滴度、脾脏淋巴细胞亚型比例和细胞因子的表达,评估对疫苗的免疫增强效力,以期筛选针对FMD疫苗的良好佐剂。主要研究内容分为以下4部分:1、猪肺炎支原体纤毛粘附因子P97对O型口蹄疫灭活疫苗免疫增强的研究将pET32a-P97-R1重组质粒转化至Trans5α感受态细胞,提取的质粒经限制性内切酶消化,测序正确后将目的质粒再转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,体外诱导表达重组蛋白。SDS-PAGE分析,重组蛋白分子量为26.5k D,证明重组P97获得成功表达。将25只6周龄的Balb/c小鼠随机分为5组,分别接种PBS、口蹄疫灭活疫苗、P97+口蹄疫灭活疫苗、灭活FMDV、和P97+灭活FMDV以评价它们诱导免疫应答的能力。结果显示:经过2次免疫后,相比PBS阴性对照组,所有免疫组Ig G均有不同程度的升高。其中,P97试验组与相应对照组略有差异;Ig A抗体:除PBS组外,其余组别都有上升。首免21d,P97+灭活FMDV是灭活FMDV的4倍。随后持续升高;脾脏淋巴细胞CD3+CD4+和CD3+CD8+比例:P97试验组及相应对照组的CD3+CD4+淋巴细胞比值略高于PBS阴性对照,而在CD3+CD8+变化上,试验组均略低于对照组0.03%-1%不等;细胞因子的表达水平:含P97的试验组在干扰素（Interferon,IFN）-γ表达水平上与相应对照组处于持平或略低的状态。检测白介素（Interleukin,IL）-4含量,P97+灭活FMDV为53.75pg/ml,其略高于灭活FMDV（50.93pg/ml）。测定的肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor,TNF）-α浓度,除PBS组外,4个免疫组差异最大仅有9.36ng/L。本次试验表明,Mhp纤毛黏附因子P97在诱导Ig G、Ig A、CD3+CD4+/CD3+CD8+亚型比例和IFN-γ、IL-4、TNF-α表达水平上,免疫增强效力较弱。2、F7-CTB对O型口蹄疫灭活疫苗免疫增强作用的研究酶切消化前期构建的pCold-I-F7和pUC57-CTB重组质粒,后将T4 DNA ligase连接的产物转化Trans5α感受态细胞,通过酶切及测序双重鉴定正确后,得到重组质粒p Cold I-F7-CTB。转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,进行诱导表达,SDS-PAGE显示,分子量为74.65 k D,证明重组F7-CTB获得成功表达。将25只6周龄的Balb/c小鼠随机分为5组,皮下注射。即PBS、灭活FMDV、F7-CTB+灭活FMDV、口蹄疫灭活疫苗和F7-CTB+口蹄疫灭活疫苗免疫组,评价F7-CTB诱导免疫应答的能力。结果为:从Ig G滴度看,除PBS对照组外,剩余试验组抗体都有产生。首免35d,P97+灭活FMDV是灭活FMDV的10.42倍（P<0.01）,首免49d,为5倍（P<0.05）,仍保持优势。间接ELISA测得粪便中Ig A,相比PBS对照组,4个免疫组存在不同程度的升高,且在首免35d达到最高值。首免35d,F7-CTB+口蹄疫灭活疫苗滴度是口蹄疫灭活疫苗的3.17倍。流式细胞仪检测后,发现比PBS组,其余各组CD3+CD4+淋巴细胞比例上升0.07%-0.57%不等。脾脏淋巴细胞CD3+CD8+比例,4个免疫组相对PBS阴性对照组小幅降低0.03%-1.23%。测定细胞因子水平,IFN-γ和TNF-α的浓度在免疫组别间最大差异仅是136.23ng/L和1.58ng/L。而P97+灭活FMDV的IL-4含量为55.54pg/ml,略高于灭活FMDV。本次试验表明,F7-CTB能更好地促进Ig G应答,且具有较弱的诱导Ig A、CD3+CD4+/CD3+CD8+亚型比例和IFN-γ、IL-4、TNF-α表达水平的作用。3、猪肺炎支原体纤毛粘附因子P97和F7-CTB对O型口蹄疫灭活疫苗免疫增强效果的研究将30只6周龄的Balb/c小鼠随机分为6组,即皮下途径免疫:P97+口蹄疫灭活疫苗、F7-CTB+口蹄疫灭活疫苗和P97+F7-CTB+口蹄疫灭活疫苗免疫组;腹腔途径免疫:P97+口蹄疫灭活疫苗PBS、F7-CTB+口蹄疫灭活疫苗和P97+F7-CTB+口蹄疫灭活疫苗免疫组。经2次免疫,评估不同免疫途径对体液免疫应答的影响,及皮下免疫途径组别两种重组蛋白免疫应答的联合作用。结果:首免35d和49d,P97+口蹄疫灭活疫苗的皮下注射途径显着高于对应腹腔免疫途径组（P<0.05）。亦有F7-CTB+口蹄疫灭活疫苗及P97+F7-CTB+口蹄疫灭活疫苗皮下免疫途径比腹腔途径Ig G抗体滴度分别高216和1318.5（P<0.05）,因此后续试验研究皮下接种组别。首免35d,P97+F7-CTB试验组Ig G抗体是P97试验组的3.26倍（P<0.05）;首免49d,P97+F7-CTB试验组是F7-CTB试验组的2.86倍（P<0.05）。Ig A水平在首免49d,P97免疫组、F7-CTB免疫组和联合应用组别存在一定的协同作用。脾脏淋巴细胞亚型比例显示,3个免疫组的CD3+CD4+差别在1.47%-5.33%,CD3+CD8+差别最大在2%。细胞因子表达的浓度:免疫组IFN-γ、IL-4和TNF-α的表达浓度差别最大分别为49.99ng/L、3.54pg/ml和2.7ng/L。本次试验表明,P97及F7-CTB联合应用皮下途径能更好地促进Ig G应答,在诱导Ig A、CD3+CD4+/CD3+CD8+亚型比例和IFN-γ、IL-4、TNF-α表达水平的作用较弱。4、猪肺炎支原体纤毛粘附因子P97和F7-CTB联合应用增强FMDV疫苗猪体免疫效果的研究将10头FMDV抗体检测呈阴性的60日龄猪,随机分为2组,即P97（125μg）+F7-CTB（125μg）+商品化灭活疫苗和商品化灭活疫苗。肌肉注射,免疫1次,首免后第30d采血,检测血清中Ig G和Ig A。结果:在首免30d,P97（125μg）+F7-CTB（125μg）+商品化灭活疫苗产生较高的Ig G水平,4/5头猪达到99%保护状态;商品化灭活疫苗组平均Ig G抗体滴度略低于P97（125μg）+F7-CTB（125μg）+商品化灭活疫苗,1/5处于99%保护,但两组差异不显着（P>0.05）。Ig A抗体:商品化灭活疫苗只能产生少量的Ig A抗体,而P97（125μg）+F7-CTB（125μg）+商品化灭活疫苗产生高水平的Ig A（P<0.05）。综上所述,F7-CTB在小鼠FMD特异性IgG水平上可显着增强。而佐剂P97和F7-CTB具有协同作用,通过皮下途径免疫,大幅提高FMD特异性Ig G水平,Ig A存在小幅升高,CD3+CD4+/CD3+CD8+T淋巴细胞比值和IFN-γ、IL-4、TNF-α表达增强幅度较弱,显示其具有良好的应用前景。由此推测,佐剂P97和F7-CTB的联合应用可能在小鼠和猪体内能有效地促进FMDV诱导的体液免疫应答,某种程度上加强对猪的免疫保护,其中还能增强猪体的黏膜免疫应答。本研究P97和F7-CTB的协同作用,为FMDV疫苗新型疫苗猪的研制提供新的思路。
齐文静[4]（2018）在《细粒棘球绦虫EgM123重组霍乱毒素B亚单位构建及其免疫特性鉴定》文中研究说明包虫病是由棘球绦虫的幼虫引起的人兽共患疾病,呈世界性分布。中国是包虫病高发区,25个省/自治区有病例报道,其中新疆、甘肃、宁夏、陕西、内蒙古、青海、四川和西藏为包虫病高发区,严重影响我国农牧区的经济发展和群众健康。霍乱毒素B亚单位（CTB）是一种新型的免疫佐剂,通过构建细粒棘球绦虫成虫特异表达基因EgM123与霍乱毒素B亚基融合重组为CTB-EgM123融合蛋白,并在大肠杆菌中表达为亚单位疫苗,通过免疫接种小鼠确定其免疫原性。为了构建表达系统,通过PCR扩增细粒棘球绦虫的EgM 123基因,并将其连接到含有CTB片段的下游构建为CTB-EgM123融合原核表达质粒载体pET28a-CTB-EgM123。在通过IPTG诱导,并用吸附标签-His的亲和柱纯化,通过SDS-PAGE鉴定重组蛋白分子量为35kDa。Western blotting结果显示重组蛋白被抗EgM123血清特异识别。纯化的EgM123和CTB-EgM123蛋白分别用于免疫接种小鼠。在三次接种后,通过ELISA测量针对EgM123的抗体,其滴度为（血清滴度>320,000）,ELISA也被用于测量免疫小鼠血清中的抗体IgG亚类,结果显示,免疫后1周后,IgG1,IgG2a和IgG2b为主要的抗体存在于血清中。然而,在免疫后第6周,IgG2a和IgG2b在小鼠血清中占优势;同时,在小肠组织中可以检测到IgG2a、IgG2b和IgG3抗体的表达。免疫接种后小鼠血浆中的细胞因子用流式细胞的方法测定,结果显示,CTB-EgM123免疫小鼠细胞因子IL-17A,TNF,IL-4,IL-6和IFN-γ表达上调,并且在免疫一周后,这些细胞因子在血浆中的含量高于正常对照小鼠（P<0.05）。仅接种CTB蛋白可以增加血浆中细胞因子IL-17A,IL-6和IFN-γ的水平,提示CTB作为佐剂可明显影响Th1/Th2免疫应答的平衡。然而,与正常对照小鼠中的这些细胞因子相比,EgM123蛋白仅上调细胞因子TNF和IL-6,并下调IL-4（P<0.05）,提示EgM123可在早期接种时诱导Th1应答。免疫6周后,接种CTB-EgM123的小鼠中细胞因子IL-17A和IL-6仍然高于正常对照小鼠血浆中的这些淋巴因子（P<0.05）。然而,接种EgM123的小鼠在免疫6周后诱导血浆中高水平的IL-17A,TNF,IL-6和IFN-γ,与对照组相比,差异显着（P<0.05）,表明EgM123可以诱导Th1和Th2免疫应答。本研究用流式细胞技术分析了免疫小鼠的淋巴细胞群。结果显示,免疫后第1周时,EgM123和CTB-EgM123均降低CD8+T细胞百分比,增加CD4+T细胞百分比（P<0.01）。然而,与正常对照小鼠中的细胞相比,免疫后第6周脾脏B细胞,CD4+T细胞和CD8+T细胞上调（P<0.05）,表明EgM123诱导很强的细胞免疫。本研究结果表明,重组蛋白EgM123和CTB-EgM123可以作为候选疫苗蛋白,CTB-EgM123诱导了很强的Th1和Th2免疫反应,为研发犬抗细粒棘球绦虫疫苗奠定了基础。
王侨[5]（2018）在《水性佐剂在猪乙型脑炎减毒活疫苗中应用的初步评估》文中进行了进一步梳理目前,我国部分养猪场常将灭活疫苗（含水性疫苗佐剂）稀释活疫苗后同时免疫动物,达到降低疫苗免疫次数和提升免疫效果的目的,例如猪圆环灭活疫苗稀释猪繁殖与呼吸综合征活疫苗、猪支原体灭活疫苗稀释猪繁殖与呼吸综合征活疫苗、副猪嗜血杆菌灭活疫苗稀释猪瘟活疫苗。但水性疫苗佐剂能否影响活疫苗的免疫效果以及如何产生影响目前尚不清楚,为此,本论文将水性疫苗佐剂（MONTANIDE?Gel 01 ST,卡波姆、黄芪多糖、左旋咪唑和壳聚糖）和SCYA201201株JEV减毒株作为研究对象开展相关实验,以阐明水性佐剂对活疫苗免疫原性的影响以及影响机理。实验第一部分是筛选商品化水性疫苗佐剂（MONTANIDE?Gel 01 ST）的最适浓度和SCYA201201株JEV减毒株的最佳滴度混合后免疫小鼠,开展免疫指标检测、攻毒保护、不同基因型（基因Ⅰ型和Ⅲ型）间交叉保护、抗体消长规律及环境温度对疫苗免疫效果影响等实验。结果显示,Gel 01 ST佐剂最适浓度为10%,减毒株最佳滴度为107.0PFU/mL,此时保护率为100%（10/10）。相比于单独免疫减毒株,佐剂的加入可以诱导更高的IgG1/IgG2a抗体（p<0.01）以及中和抗体（p<0.01）,并且显着提高淋巴细胞增殖水平（p<0.01）和细胞因子含量,尤其是干扰素伽马（INF-γ）含量（p<0.01）。佐剂也能够增强不同基因型强毒株间的交叉保护率（分别为90%和100%）,并且从免疫第5天开始为小鼠提供较高的抗体水平（p<0.01）和保护率（≥80%）。甚至减毒株在室温（25℃）放置部分病毒失活后,与佐剂联用仍然能够提供66.7%以上的保护率,高于单独免疫减毒株组。研究结果表明,Gel 01 ST能够用于JEV活疫苗的免疫,且能通过提高机体的各项免疫指标提升疫苗的免疫效果。实验第二部分是将配制的卡波姆、黄芪多糖、左旋咪唑和壳聚糖佐剂单独或复合后与JEV减毒株混合免疫小鼠,然后开展抗体水平检测和攻毒保护实验,探究配制的水性佐剂对SCYA201201株JEV减毒株免疫效果的影响。实验结果显示,四种佐剂单独使用时,只有4mg/mL浓度的卡波姆对减毒株免疫后的抗体水平有微弱的增强,其余佐剂均无效果;而佐剂混合使用时,抗体水平和攻毒保护率均低于单独免疫减毒株的实验组。研究结果表明,自制的水性佐剂不能增强JEV减毒株的免疫效果反而具有免疫抑制作用,这提示我们活疫苗在临床应用时,需要避免一些药物（或化学复合物）对活疫苗免疫效果产生不利影响。
李图帅[6]（2016）在《O型口蹄疫病毒VP1蛋白GH loop表位表面展示策略与免疫原性研究》文中进行了进一步梳理口蹄疫（Foot-and-mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus,FMDV）引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。该病毒主要感染牛、羊等偶蹄动物并可造成严重的经济损失。目前,我国国产的FMDV疫苗均是由灭活口蹄疫病毒,配用油佐剂制备而成,临床副反应大,免疫保护还有待进一步提高,同时在疫苗生产过程中存在灭活不完全而造成强毒逃逸的风险。因此,选择有效表面展示系统,利用基因工程技术展示FMDV抗原表位,进而制备FMDV亚单位疫苗,对于提升国产疫苗质量及安全性,具有很大的实际应用价值。VP1蛋白是FMDV主要的抗原,它含有的GH环第141-160位氨基酸为线性B细胞抗原表位,也是诱导机体产生中和抗体的免疫表位,可以诱导产生保护性免疫应答,因此是研究口蹄疫疫苗的理想抗原,基于口蹄疫VP1蛋白GH loop表位的合成肽疫苗目前在国内已成功上市。PCV2 Cap蛋白病毒样颗粒表面展示系统是国内外近年发展起来的一种外源抗原表位展示系统。该技术是利用外源肽段取代Cap蛋白内部的loop环,表达重组Cap蛋白,然后60个重组Cap蛋白可在体外自我组装为病毒样颗粒完成对外源抗原表位的展示。霍乱毒素B亚单位展示系统是利用外源抗原表位采取同源重组技术替换霍乱毒素B亚单位中KNG氨基酸基因片段,表达重组CTB蛋白,然后5个重组CTB蛋白可在体外聚集为五聚体结构进而完成对外源抗原表位的展示。本研究选择了 PCV2 Cap蛋白病毒样颗粒及霍乱毒素B亚单位作为展示FMDV抗原表位的载体系统,成功展示FMDV VP1的GH loop抗原表位,并以此为基础制备了 FMDV-PCV2二联亚单位疫苗及FMDV亚单位疫苗,初步评价其免疫保护效力,为研制高效FMDV疫苗奠定了良好的基础。本文主要研究内容如下:1.基因替换构建以PCV2 Cap为骨架展示FMDV GHloop的嵌合VLPs本试验以O型FMDV VP1主要B细胞表位GH loop为外源基因,在PCV2 Cap蛋白内部鉴定获得4个位置,以基因替换方式构建嵌合基因,构建成功的嵌合基因与PQZ表达载体相连后在大肠杆菌中成功诱导表达,SDS-PAGE鉴定表明,获得的重组蛋白大小分别为27 kDa左右,均为可溶性蛋白;Western-bloting分析显示,6种重组蛋白均能与PCV2 阳性血清及O型FMDV 阳性血清反应;透射电镜观察表明,重组Cap蛋白体外形成大量直径在20 nm左右的病毒样颗粒。50 μg/只纯化后重组蛋白自制疫苗免疫小鼠证实能够引发机体产生特异性细胞免疫和体液免疫应答,其中以Cap-loop4免疫效果最好。2.基因插入构建以PCV2 Cap为骨架展示FMDV GH loop的嵌合VLPs在前期研究基础上依次将FMDV GH loop基因片段插入PCV2 Cap蛋白内部鉴定获得4个位置处,以基因替换方式构建嵌合基因,构建成功的嵌合基因与PQZ表达载体相连后在大肠杆菌中成功诱导表达。SDS-PAGE鉴定表明,获得的重组蛋白大小分别为35 kDa左右,均为可溶性蛋白;Western-bloting分析显示,4种重组蛋白均能与PCV2阳性血清及O型FMDV血清呈阳性反应;透射电镜观察表明,重组Cap蛋白体外形成大量直径在20 nm左右的病毒样颗粒。50 μg/只纯化后重组蛋白自制疫苗免疫小鼠证实能够引发机体产生特异性细胞免疫和体液免疫应答,其中以Cap-iloop1免疫效果最好。3.以CTB为载体展示FMDV GH loop抗原表位方法的研究探讨以霍乱毒素B亚单位为载体制备猪O型口蹄疫亚单位疫苗的可行性。将FMDV GH loop基因片段取代CTB氨基酸的KNG肽段基因序列,基因替换方式构建嵌合基因,构建成功的嵌合基因与PQZ表达载体相连后在大肠杆菌中诱导表达。SDS-PAGE结果表明重组蛋白获得高效表达且具有良好可溶性;Western-blot分析结果显示重组蛋白能够与FMDV 阳性血清发生反应;神经节苷脂GM1抗原包被板鉴定表明,重组CTB蛋白能够形成五聚体结构;200 μg/头份重组蛋白制备疫苗免疫试验猪能够产生较高的抗体水平与细胞免疫反应。以上结果表明重组蛋白具有针对FMDV良好的免疫原性,为研究口蹄疫亚单位疫苗提供了新思路。
施金谷[7]（2013）在《大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位（LTB）对罗非鱼链球菌口服疫苗免疫增强效果的初步研究》文中进行了进一步梳理口服免疫是一种简单而有效诱导粘膜免疫的免疫方式,但由于缺乏良好的运输系统和吸收系统,很大程度上限制了口服疫苗的发展。大肠毒素不耐热肠毒素B亚单位（LTB）是一个强有力的调节免疫的信号和载体分子,因而通常被作为佐剂应用于口服疫苗。为了研究LTB对罗非鱼链球菌口服疫苗的免疫增强效果,本研究通过对已构建的LTB重组酵母进行诱导表达,探索重组LTB最佳表达时间并检测其安全性,并建立罗非鱼抗体检测间接ELISA方法,为罗非鱼抗体的检测奠定了基础,最后将LTB与链球菌口服疫苗联合口服免疫罗非鱼,研究LTB对罗非鱼的免疫增强效果,为链球菌口服疫苗免疫佐剂开发利用提供数据参考。本实验通过对已构建的重组LTB KM71毕赤酵母进行诱导表达以及LTB毒性实验,探讨重组LTB的最佳表达时间以及表达量,检测了LTB对罗非鱼的安全性。实验显示,重组LTB在毕赤酵母中得到有效表达,最佳的表达时间为96h,表达量为2.716mg/mL。LTB对罗非鱼在灌胃初期具有轻微刺激性,但能够作为罗非鱼肠道粘膜佐剂使用。在罗非鱼血清及粘膜抗体水平间接ELISA检测方法建立的实验中发现,罗非鱼血清抗体间接ELISA检测的最佳反应温度为22℃,抗原包被浓度为5.5μg/mL,待测血清、多抗的稀释度和酶标二抗的稀释度分别为1/400、1/2000和1/8000。在对LTB的免疫增强效果研究的试验中,以罗非鱼链球菌口服疫苗0.2×109cells/尾、0.2×108cells/尾和0.2×107cells/尾三个口服剂量水平以及LTB口服剂量1.68μg／尾、0.84μg／尾和0.17μg／尾3个处理水平设计联合疫苗,并通过口服免疫罗非鱼,评价LTB的免疫增强效果及联合疫苗相对保护率。结果表明,LTB能够促进血清以及肠道粘膜抗体水平,对链球菌口服疫苗有佐剂效应。当疫苗口服剂量为0.2×108cells/尾,LTB口服剂量为0.84μg／尾的组合时达到最佳免疫效果,该组合能在免疫后期稳定持续高效的提高血清和肠道粘膜抗体应答水平,并且使罗非鱼在免疫后第10d、20d和30d相对保护率分别达到65.00%、68.42%和64.71%。肠道粘膜抗体水平和LTB的含量成正比,但在免疫期内同一LTB含量实验组的抗体水平波动幅度较大。检测LTB对罗非鱼非特异性免疫效应的影响,发现LTB可显着提高溶菌酶和碱性磷酸酶水平,对酸性磷酸酶无显着影响,但对超氧化物歧化酶表现出抑制作用。实验结果表明,LTB虽然对罗非鱼灌胃前期具有微弱刺激性,但总体可提高鱼体的免疫力,与罗非鱼链球菌口服疫苗联合时,可明显提高50g～60g罗非鱼链球菌口服疫苗的免疫效果,提高血清和肠道粘膜免疫水平,是一种具有潜力的口服疫苗免疫佐剂。
严小芳,张佩,董硕[8]（2009）在《霍乱毒素无毒B亚单位（CTB）黏膜免疫佐剂的研究进展》文中研究表明霍乱毒素（CT）具有很强的黏膜免疫佐剂活性,是当今研究热点之一,但CT的黏膜免疫佐剂效应机理尚未完全弄清。本文主要就霍乱毒素无毒B亚单位（CTB）的黏膜免疫佐剂作用进行综述。
马海利[9]（2008）在《O型FMDV复合表位/CTB重组枯草芽孢杆菌构建与实验免疫》文中研究表明在分析FMDV抗原表位和免疫特性的基础上,结合FMD的流行特点,设计了O型FMDV复合表位与CTB的融合基因CTB-Th2-VP1和CTB-VP1-2A-Epi,将其克隆入表达载体pGEX-6P-1,在BL21中获得诱导表达,表达的融合蛋白以包涵体形式存在,具有O型FMDV和CTB双重反应原性。融合蛋白复性后具有CTB的生物活性,腹腔接种小鼠后可诱导产生特异性的体液、细胞和黏膜免疫,其中CTB-VP1-2A-Epi融合蛋白产生的免疫水平高于或接近灭活疫苗。将CTB-VP1-2A-Epi融合基因克隆到枯草芽孢杆菌表达载体pBC38C中,构建了CTB-VP1-2A-Epi重组枯草芽孢杆菌,免疫小鼠可产生O型FMDV特异性的细胞免疫和黏膜免疫。将重组枯草芽孢杆菌与重组鸡痘病毒vUTAL3CP1、核酸疫苗pIRES3CP1及O型FMDV灭活苗以不同的组合方式联合免疫小鼠。结果显示,重组枯草芽孢杆菌能够增强这三种疫苗的免疫效果,其中以核酸疫苗首免、重组鸡痘病毒加强免疫,结合重组枯草芽孢杆菌灌服的免疫策略的免疫效果最佳,可诱导机体产生较高水平的细胞免疫、体液免疫和黏膜免疫。研究结果表明设计和表达的CTB-VP1-2A-Epi融合蛋白具有良好的FMDV免疫原性和CTB佐剂作用,为研制和使用新型、高效的FMD基因工程疫苗奠定基础。
王晓乾,万春云,姬茜茜[10]（2007）在《大肠杆菌热敏性肠毒素综述》文中研究指明大肠杆菌肠毒素是引起腹泻的主要致病因子,可以分为热敏性肠毒素和耐热性肠毒素两类[1]。本文就热敏性肠毒素的理化性质、分子结构和生物学功能、免疫原性、免疫佐剂作用以及国内外对其免疫原性与佐剂效应的应用研究进行了综述。
二、霍乱毒素B亚单位免疫佐剂的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、霍乱毒素B亚单位免疫佐剂的研究进展（论文提纲范文）
（1）基于Tween 80复配体系的鼻腔黏膜免疫佐剂研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 疫苗与佐剂简述 |
| 1.1.1 疫苗的作用 |
| 1.1.2 疫苗的分类 |
| 1.1.3 佐剂的作用 |
| 1.1.4 佐剂的分类 |
| 1.2 具有免疫调节活性的两亲分子 |
| 1.2.1 普通表面活性剂 |
| 1.2.2 生物表面活性剂 |
| 1.2.3 肺表面活性物质 |
| 1.2.4 皂苷 |
| 1.2.5 单磷酞脂A |
| 1.3 胶束佐剂系统 |
| 1.3.1 γ-PGA |
| 1.3.2 两亲性聚酸酐 |
| 1.3.3 阳离子两亲性聚合物 |
| 1.3.4 POE-POP-POE |
| 1.3.5 其它两亲性聚合物 |
| 1.3.6 混合胶束 |
| 1.4 基于两亲分子的鼻腔黏膜佐剂系统 |
| 1.4.1 两亲分子 |
| 1.4.2 胶束 |
| 1.4.3 囊泡 |
| 1.4.4 乳液 |
| 1.4.5 凝胶 |
| 1.5 鼻腔黏膜免疫佐剂活性的优化 |
| 1.5.1 尺寸 |
| 1.5.2 形态 |
| 1.5.3 表面电性 |
| 1.5.4 表面亲疏水性 |
| 1.6 含硒物质的保健、免疫调节功能和抗菌活性 |
| 1.6.1 含硒物质的保健、免疫调节功能 |
| 1.6.2 含硒材料的抗菌活性 |
| 1.7 本论文选题依据、研究内容与创新点 |
| 第2章 Tween 80/Brij 30复配体系的鼻腔黏膜免疫活性研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.2.2 T80/B30复配体系和OVA模型疫苗的制备 |
| 2.2.3 表面张力和接触角 |
| 2.2.4 荧光光谱 |
| 2.2.5 等温滴定量热 |
| 2.2.6 三元相图的绘制 |
| 2.2.7 粒径的测定 |
| 2.2.8 冷冻蚀刻电镜 |
| 2.2.9 圆二色光谱 |
| 2.2.10 溶血活性 |
| 2.2.11 免疫和样本采集 |
| 2.2.12 ELISA检测OVA特异性抗体IgG、IgG1、IgG2a和sIgA |
| 2.2.13 体外细胞摄取 |
| 2.2.14 淋巴结内树突状细胞摄取抗原 |
| 2.2.15 鼻腔的组织学分析 |
| 2.2.16 统计学分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 T80/B30复配体系与OVA的相互作用 |
| 2.3.2 T80/B30复配体系的物理化学性质研究及佐剂组成的优化选择 |
| 2.3.3 T80/B30复配体系的溶血活性 |
| 2.3.4 T80/B30复配体系的鼻腔黏膜免疫活性 |
| 2.3.5 抗原的体外和体内细胞摄取 |
| 2.3.6 鼻腔的组织学分析 |
| 2.3.7 T80/B30囊泡的免疫机理探讨 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 Tween 80/聚氧乙烯-9-月桂醚复配体系的鼻腔黏膜免疫活性研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验试剂 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 T80/P9LE复配体系与OVA的相互作用 |
| 3.3.2 T80/P9LE复配体系的物理化学性质研究及佐剂组成的优化选择 |
| 3.3.3 T80/P9LE复配体系的溶血活性 |
| 3.3.4 T80/P9LE复配体系的鼻腔黏膜免疫活性 |
| 3.3.5 抗原的体外和体内细胞摄取 |
| 3.3.6 鼻腔的组织学分析 |
| 3.3.7 T80/P9LE混合胶束的免疫机理探讨 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 Tween 80/氯化十六烷基吡啶复配体系的鼻腔黏膜免疫活性研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 实验试剂 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 T80/CPC复配体系与OVA的相互作用 |
| 4.3.2 T80/CPC复配体系的物理化学性质研究及佐剂组成的优化选择 |
| 4.3.3 T80/CPC复配体系的溶血活性 |
| 4.3.4 T80/CPC复配体系的鼻腔黏膜免疫活性 |
| 4.3.5 抗原的体外和体内细胞摄取 |
| 4.3.6 鼻腔的组织学分析 |
| 4.3.7 T80/CPC混合胶束的免疫机理探讨 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 Tween 80/PN320复配体系的鼻腔黏膜免疫活性研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 实验试剂和实验动物 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 T80/PN320复配体系与OVA的相互作用 |
| 5.3.2 T80/PN320复配体系的物理化学性质研究及佐剂组成的优化选择 |
| 5.3.3 T80/PN320复配体系的溶血活性 |
| 5.3.4 T80/PN320复配体系的鼻腔黏膜免疫活性 |
| 5.3.5 抗原的体外和体内细胞摄取 |
| 5.3.6 鼻腔的组织学分析 |
| 5.3.7 T80/PN320混合胶束的免疫机理探讨 |
| 5.3.8 不同Tween 80复配体系鼻腔黏膜免疫活性的比较 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 Tween 80复配体系与含硒物质鼻腔黏膜免疫的协同效应研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验部分 |
| 6.2.1 实验试剂 |
| 6.2.2 实验方法 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 Se/C的合成与表征 |
| 6.3.2 T80复配体系与Se/C鼻腔黏膜免疫的协同效应 |
| 6.3.3 免疫调节剂DDSe的合成与表征 |
| 6.3.4 T80复配体系与DDSe鼻腔黏膜免疫的协同效应 |
| 6.4 本章小结 |
| 第7章 结论与展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的研究成果 |
| 致谢 |
（2）霍乱毒素样抗肿瘤嵌合蛋白佐剂的设计、制备及活性评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 亚单位疫苗在前列腺癌中的应用 |
| 1.1.1 前列腺癌与免疫治疗 |
| 1.1.2 亚单位疫苗的研究现状 |
| 1.1.3 亚单位疫苗在前列腺癌中的应用 |
| 1.2 免疫佐剂的应用 |
| 1.2.1 免疫佐剂的功能 |
| 1.2.2 许可的人用免疫佐剂 |
| 1.2.3 在研的免疫佐剂 |
| 1.3 霍乱毒素在免疫佐剂中的应用 |
| 1.3.1 霍乱毒素的分子结构与生物学功能 |
| 1.3.2 霍乱毒素与免疫反应 |
| 1.3.3 霍乱毒素作为免疫佐剂的递送途径 |
| 1.4 选题目的及意义 |
| 第二章 CT样嵌合蛋白的表达、纯化与鉴定 |
| 2.1 实验目的 |
| 2.2 实验试剂与仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 溶液配制 |
| 2.3.2 重组蛋白mGM-CSF-CTA2和CTB-PSMA624-632 的表达 |
| 2.3.3 重组蛋白mGM-CSF-CTA2和CTB-PSMA624-632 的纯化 |
| 2.3.4 重组蛋白mGM-CSF-CTA2和CTB-PSMA624-632 的鉴定 |
| 2.3.5 CT样嵌合蛋白的制备 |
| 2.3.6 CT样嵌合蛋白的鉴定 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 质粒pET22b-mGM-CSF-CTA2和p ET28a-CTB-PSMA624-632 的构建 |
| 2.4.2 含目的蛋白表达质粒的工程菌的生长曲线绘制 |
| 2.4.3 目的蛋白表达优化的条件参数确定 |
| 2.4.4 目的蛋白的表达与纯化鉴定 |
| 2.4.5 BCA法定量蛋白浓度 |
| 2.4.6 嵌合蛋白的制备与鉴定 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 CT样嵌合蛋白的体外生物活性评价 |
| 3.1 实验目的 |
| 3.2 实验试剂与仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 动物 |
| 3.3.2 溶液配制 |
| 3.3.3 细胞培养 |
| 3.3.4 小鼠髓样细胞增殖实验 |
| 3.3.5 GM1-ELISA实验 |
| 3.3.6 统计分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 MTT比色法检测CT样嵌合蛋白对小鼠髓样细胞增殖影响 |
| 3.4.2 间接ELISA法检测CT样嵌合蛋白结合GM1 活性 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 表达人PSMA的小鼠前列腺癌细胞的构建 |
| 4.1 实验目的 |
| 4.2 实验试剂与仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 溶液配制 |
| 4.3.2 重组质粒pEF1-myc-his-PSMA-EGFP的构建 |
| 4.3.3 重组质粒pEF1-myc-his-PSMA-EGFP的中量提取 |
| 4.3.4 重组质粒pEF1-myc-his-PSMA-EGFP浓缩 |
| 4.3.5 重组质粒pEF1-myc-his-PSMA-EGFP的琼脂糖凝胶电泳 |
| 4.3.6 重组质粒pEF1-myc-his-PSMA-EGFP转染RM-1 细胞 |
| 4.3.7 阳性细胞RM-1-PSMA-EGFP的筛选及EGFP-PSMA表达鉴定 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 重组质粒pEF1-myc-his-PSMA-EGFP的构建与鉴定 |
| 4.4.2 G418 最佳筛选浓度的确定 |
| 4.4.3 转染质粒的鉴定 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 CT样嵌合蛋白的抗肿瘤活性 |
| 5.1 实验目的 |
| 5.2 实验试剂与仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 嵌合蛋白体内抗肿瘤活性研究 |
| 5.3.2 ELISA检测血清中细胞因子IFN-γ分泌 |
| 5.3.3 统计分析 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 小鼠肿瘤测量与称重 |
| 5.4.2 小鼠体重变化 |
| 5.4.3 血清IFN-γ的含量测定 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 抗肿瘤活性机制研究 |
| 6.1 实验目的 |
| 6.2 实验试剂与仪器 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 溶液配制 |
| 6.3.2 小鼠BMDCs的分离和培养 |
| 6.3.3 流式细胞术检测BMDCs表面分子 |
| 6.3.4 DC细胞过继治疗作用研究 |
| 6.3.5 小鼠脾淋巴细胞的制备 |
| 6.3.6 尼龙毛柱纯化小鼠脾脏淋巴细胞 |
| 6.3.7 流式细胞术检测T细胞纯度 |
| 6.3.8 抗原特异性CTLs细胞的制备 |
| 6.3.9 CTLs体外杀伤活性的研究 |
| 6.3.10 ELISA检测细胞上清液中细胞因子IFN-γ的分泌 |
| 6.3.11 脾淋巴细胞增殖性实验 |
| 6.3.12 统计分析 |
| 6.4 结果与分析 |
| 6.4.1 小鼠BMDCs的形态观察 |
| 6.4.2 小鼠BMDCs纯度和表面标记物的检测 |
| 6.4.3 过继转移DCs和 T细胞纯度检测 |
| 6.4.4 诱导抗原特异性CD8+T细胞反应 |
| 6.4.5 脾T细胞增殖反应 |
| 6.5 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（3）支原体纤毛黏附因子P97、鞭毛蛋白-CTB联合使用增强FMD灭活疫苗免疫原性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 口蹄疫病毒免疫学研究进展 |
| 1 病原学特征 |
| 1.1 分类 |
| 1.2 形态特征及理化性质 |
| 2 FMDV的分子生物学特征 |
| 2.1 病毒基因组结构 |
| 2.2 病毒毒力 |
| 2.3 发病机制 |
| 3 疫苗 |
| 3.1 灭活疫苗 |
| 3.2 亚单位候选疫苗 |
| 3.3 合成肽疫苗 |
| 3.4 核酸疫苗 |
| 3.5 空农壳疫苗 |
| 3.6 基因缺失疫苗 |
| 4 免疫接种 |
| 5 佐剂 |
| 6 P97 蛋白 |
| 7 鞭毛蛋白 |
| 8 霍乱毒素B亚基(CTB) |
| 9 结论和展望 |
| 第二章 猪肺炎支原体纤毛粘附因子P97 对O型口蹄疫灭活疫苗免疫增强的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 pET32a-P97-R1 重组质粒酶切鉴定结果 |
| 2.2 P97 蛋白的表达及Western-blot检测结果 |
| 2.3 P97 纯化、浓度测定及内毒素去除和检测 |
| 2.4 FMDV特异性抗体水平检测 |
| 2.5 免疫小鼠CD3~+CD4~+和CD3~+CD8~+T淋巴细胞变化 |
| 2.6 小鼠细胞因子的检测 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 F7-CTB对O型口蹄疫灭活疫苗免疫增强作用的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 p Cold I-F7-CTB重组质粒酶切鉴定结果 |
| 2.2 F7-CTB蛋白的表达及Western-blot检测结果 |
| 2.3 F7-CTB纯化、浓度测定及内毒素去除和检测 |
| 2.4 生物学活性检测 |
| 2.5 FMDV特异性抗体水平检测 |
| 2.6 免疫小鼠CD3~+CD4~+和CD3~+CD8~+T淋巴细胞变化 |
| 2.7 小鼠细胞因子的检测 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 猪肺炎支原体纤毛粘附因子P97和F7-CTB对 O型口蹄疫灭活疫苗免疫增强效果的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 FMDV特异性抗体水平检测 |
| 2.2 免疫小鼠CD3~+CD4~+和CD3~+CD8~+T淋巴细胞变化 |
| 2.3 小鼠细胞因子的检测 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 猪肺炎支原体纤毛粘附因子P97和F7-CTB联合应用增强FMDV疫苗猪体免疫效果的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 FMDV特异性抗体水平检测 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（4）细粒棘球绦虫EgM123重组霍乱毒素B亚单位构建及其免疫特性鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 包虫病的研究概况 |
| 1.2 包虫病的检测技术 |
| 1.3 包虫病的免疫机理 |
| 1.4 包虫病的疫苗进展 |
| 1.5 包虫病的治疗 |
| 1.6 霍乱毒素B亚单位的研究进展 |
| 1.7 研究的目的与意义 |
| 第2章 细粒棘球绦虫EgM123重组霍乱毒素B亚单位的构建表达纯化及小鼠抗血清的制备 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 细粒棘球绦虫重组亚单位蛋白CTB-EgM123免疫的免疫原性研究——T淋巴细胞反应 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 细粒棘球绦虫重组亚单位蛋白CTB-EgM123免疫的免疫原性研究—系统免疫和组织免疫 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（5）水性佐剂在猪乙型脑炎减毒活疫苗中应用的初步评估（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 佐剂机理研究进展 |
| 1.1 抗原储存库效应 |
| 1.2 调控细胞因子和趋化因子 |
| 1.3 提呈作用 |
| 1.4 靶向作用 |
| 1.5 诱导CD8+细胞毒T细胞(CTL)应答 |
| 1.6 激活炎症小体 |
| 2 佐剂的分类介绍 |
| 2.1 传统佐剂 |
| 2.1.1 铝佐剂 |
| 2.1.2 油乳佐剂 |
| 2.2 新型佐剂 |
| 2.2.1 微生物来源佐剂 |
| 2.2.2 微粒抗原递送体系类佐剂 |
| 2.2.3 多糖 |
| 2.2.4 疱疹病毒VP22蛋白 |
| 2.2.5 天然来源佐剂 |
| 2.2.6 水溶性佐剂 |
| 3 Gel 01佐剂在动物疫苗中的应用 |
| 3.1 Gel 01佐剂在脑心肌炎疫苗中的应用 |
| 3.2 Gel 01佐剂在支原体肺炎疫苗中的应用 |
| 3.3 Gel 01佐剂在猪圆环病毒疫苗中的应用 |
| 3.4 Gel 01佐剂在马红球菌分泌蛋白中的应用 |
| 3.5 Gel 01佐剂在猪繁殖与呼吸综合症病毒疫苗中的应用 |
| 4 本实验研究目的与意义 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第一章 商品化水性疫苗佐剂(Gel 01 ST)对猪源乙型脑炎病毒弱毒株免疫原性的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 试验毒株 |
| 1.1.2 细胞系与实验动物 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要溶液的配制 |
| 1.1.5 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒的收获 |
| 2.2 蚀斑实验 |
| 2.3 不同浓度佐剂对活病毒存活的影响 |
| 2.4 Gel 01 ST佐剂浓度的优化 |
| 2.5 JEV减毒株滴度的优化 |
| 2.6 免疫指标的测定 |
| 2.6.1 血清中IgG1和IgG2a水平的测定 |
| 2.6.2 中和抗体水平的测定 |
| 2.6.3 小鼠脾脏淋巴细胞的提取 |
| 2.6.4 小鼠脾脏淋巴细胞增殖实验 |
| 2.6.5 细胞因子检测 |
| 2.7 免疫早期的抗体水平和攻毒保护实验 |
| 2.8 不同基因型攻毒保护实验 |
| 2.9 小鼠免疫后三个月内抗体水平变化 |
| 2.10 疫苗常温放置5h内的免疫攻毒保护率 |
| 2.11 数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 不同浓度佐剂对活病毒的影响 |
| 3.2 佐剂浓度优化结果 |
| 3.3 病毒滴度优化结果 |
| 3.4 相关免疫指标结果 |
| 3.4.1 IgG1和IgG2a检测结果 |
| 3.4.2 中和抗体效价 |
| 3.4.3 淋巴细胞增殖实验结果 |
| 3.4.4 细胞因子检测 |
| 3.5 免疫早期的抗体水平和攻毒保护结果 |
| 3.6 基因Ⅰ型和基因Ⅲ型攻毒保护实验结果 |
| 3.7 小鼠免疫后3个月内抗体水平检测结果 |
| 3.8 减毒株常温放置5h内的免疫攻毒保护效率 |
| 4 讨论 |
| 4.1 水性佐剂对病毒存活的影响和优化 |
| 4.2 水性佐剂对减毒株免疫指标的影响 |
| 4.3 水性佐剂对攻毒保护率和抗体水平的影响 |
| 4.4 减毒株常温放置5h内的免疫攻毒保护效率 |
| 第二章 自制不同水性佐剂对JEV攻毒保护率和抗体水平的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 试验毒株 |
| 1.1.2 佐剂与实验动物 |
| 2 方法 |
| 2.1 不同浓度佐剂的配备 |
| 2.1.1 卡波姆 |
| 2.1.2 黄芪多糖 |
| 2.1.3 左旋咪唑 |
| 2.1.4 壳聚糖 |
| 2.2 不同浓度佐剂混合弱毒株免疫小鼠后攻毒保护和抗体检测实验 |
| 2.3 复合佐剂混合弱毒株攻毒保护实验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 佐剂单独使用的抗体水平和攻毒保护结果 |
| 3.2 佐剂复合使用的抗体水平和攻毒保护结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（6）O型口蹄疫病毒VP1蛋白GH loop表位表面展示策略与免疫原性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 上篇 第一章文献综述 |
| 1 口蹄疫病毒疫苗研究进展 |
| 1.1 FMD病原学及分子生物学研究 |
| 1.2 FMDV疫苗研究现状 |
| 1.3 FMDV疫苗存在的问题 |
| 1.4 展望 |
| 2 抗原表位表面展示系统研究进展 |
| 2.1 VLPs表面展示系统研究进展 |
| 2.2 CTB表面展示系统研究进展 |
| 2.3 其他几种常见的表面展示系统 |
| 3 猪圆环病毒2型疫苗研究进展 |
| 3.1 PCV2病原学及分子生物学研究 |
| 3.2 PCV2 Cap蛋白结构研究进展 |
| 3.3 PCV2疫苗研究现状 |
| 3.4 展望 |
| 参考文献 |
| 下篇 试验研究 |
| 第二章 基因替换构建PCV2 Cap为骨架展示FMDV GH loop的嵌合VLPs |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组质粒PQZ-Cap-GH loop重组表达质粒的鉴定 |
| 2.2 重组蛋白Cap-loops的表达和可溶性鉴定 |
| 2.3 重组蛋白Cap-GH loop免疫原性的鉴定 |
| 2.4 病毒样颗粒的组装 |
| 2.5 重组蛋白浓缩纯化的鉴定 |
| 2.6 动物实验结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 基因插入构建PCV2 Cap为骨架展示FMDVGH loop的嵌合VLPs |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组表达质粒pQZ-Cap-iGH loop的鉴定 |
| 2.2 重组蛋白Cap-iGH loop的表达和可溶性鉴定 |
| 2.3 重组蛋白Cap-iGH loop免疫原性的鉴定 |
| 2.4 嵌合病毒样颗粒组装 |
| 2.5 重组蛋白浓缩纯化的鉴定 |
| 2.6 动物实验结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 以CTB为载体展示FMDVGH loop抗原表位方法的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组表达质粒的鉴定 |
| 2.2 重组蛋白的表达和可溶性鉴定 |
| 2.3 重组菌表达产物的Western-blot分析 |
| 2.4 重组蛋白五聚体形成鉴定 |
| 2.5 重组蛋白免疫动物体液免疫反应 |
| 2.6 淋巴细胞增殖检测结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 攻读硕士学位期间研究成果 |
| 致谢 |
（7）大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位（LTB）对罗非鱼链球菌口服疫苗免疫增强效果的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 口服疫苗的研究进展 |
| 1.1.1 人用口服疫苗的研究进展 |
| 1.1.2 兽用口服疫苗的研究进展 |
| 1.1.3 水产口服免疫研究进展 |
| 1.2 水产口服免疫佐剂 |
| 1.2.1 口服疫苗免疫佐剂作用机理 |
| 1.2.2 几种主要的水产口服免疫佐剂 |
| 1.2.3 细胞因子 |
| 1.2.4 其他口服免疫佐剂 |
| 1.3 LTB的研究进展 |
| 1.3.1 LT的结构和组成 |
| 1.3.2 LT的免疫原性及机理 |
| 1.3.3 LTB的佐剂作用 |
| 1.4 研究的目的及意义 |
| 2 大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的表达纯化及其毒性研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细菌 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要试剂及材料 |
| 2.1.5 主要试剂及培养基的配置 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的表达纯化 |
| 2.2.2 大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的毒性研究 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 重组LTB蛋白的最佳表达时间 |
| 2.3.2 重组LTB的纯化浓缩结果 |
| 2.3.3 LTB的毒性 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 LTB的表达 |
| 2.4.2 LTB的毒性 |
| 3 罗非鱼抗体检测间接ELISA方法的建立 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验鱼 |
| 3.1.2 细菌 |
| 3.1.3 疫苗 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.1.5 主要试剂及材料 |
| 3.1.6 主要溶液的配置 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 罗非鱼IgM的纯化及多克隆抗体的制备 |
| 3.2.2 罗非鱼抗体间接ELISA方法的建立 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 提纯后IgM的浓度 |
| 3.3.2 罗非鱼提纯IgM SDS-PAGE电泳以及Westen Blotting结果 |
| 3.3.3 抗原浓度测定结果 |
| 3.3.4 最适反应温度 |
| 3.3.5 抗原最适包被时间 |
| 3.3.6 抗原及待测血清浓度的最佳稀释度 |
| 3.3.7 兔抗罗非鱼及酶标二抗的最佳稀释度 |
| 3.3.8 粘膜抗体检测抗体检测条件的优化 |
| 3.3.9 最终ELISA优化结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 关于罗非鱼IgM的提纯 |
| 3.4.2 ELISA方法的建立 |
| 4 LTB对罗非鱼链球菌疫苗的免疫增强效应研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 实验鱼 |
| 4.1.2 LTB |
| 4.1.3 联合疫苗的制作 |
| 4.1.4 细菌 |
| 4.1.5 实验试剂 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 罗非鱼的免疫 |
| 4.2.2 免疫保护率的检测 |
| 4.2.3 血清及粘膜抗体采集及检测 |
| 4.2.4 血清非特异性免疫指标检测 |
| 4.2.5 数据分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 免疫保护率结果 |
| 4.3.2 血清抗体检测结果 |
| 4.3.3 肠道粘膜抗体检测结果 |
| 4.3.4 溶菌酶活力检测结果 |
| 4.3.5 LTB对超氧化物歧化酶(SOD)的影响 |
| 4.3.6 LTB对酸性磷酸酶(ACP)的影响 |
| 4.3.7 LTB对碱性磷酸酶(AKP)的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 LTB的佐剂活性 |
| 4.4.2 关于LTB的非特异性免疫效应研究 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（8）霍乱毒素无毒B亚单位（CTB）黏膜免疫佐剂的研究进展（论文提纲范文）
| 1 CT和CTB结构与作用机制 |
| 2 CTB黏膜免疫佐剂研究现状 |
| 2.1 天然CTB的免疫佐剂活性 |
| 2.2 重组CTB的免疫活性 |
| 2.3 CT突变体 |
| 3 霍乱毒素B亚单位的应用 |
| 3.1 载体蛋白 |
| 3.2 免疫佐剂 |
| 3.3 口服免疫蛋白 |
| 4 研究方向 |
（9）O型FMDV复合表位/CTB重组枯草芽孢杆菌构建与实验免疫（论文提纲范文）
| 提要 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 动物新型疫苗研究进展 |
| 1 现代分子生物学技术与新型疫苗研究 |
| 2 新型免疫原与疫苗 |
| 3 载体与疫苗 |
| 4 结语 |
| 第二章 霍乱毒素研究进展 |
| 1 CT 的结构特性 |
| 2 CTB 黏膜免疫佐剂研究 |
| 3 小结 |
| 第三章 口蹄疫疫苗研究进展 |
| 1 口蹄疫传统疫苗研究 |
| 2 口蹄疫新型疫苗研究 |
| 3 展望 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 O 型FMDV 复合表位与CTB 融合基因的分子设计 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 O 型FMDV 复合表位与CTB 融合基因的构建与表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 O 型FMDV 复合表位与CTB 融合蛋白的实验免疫 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 O 型FMDV 复合表位/CTB 重组枯草芽孢杆菌 构建与实验免疫 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 O 型FMDV 复合表位/CTB 重组枯草芽孢杆菌 与多种FMDV 基因重组体联合实验免疫 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表论文 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| CURRICULUM VITAE |
四、霍乱毒素B亚单位免疫佐剂的研究进展（论文参考文献）
- [1]基于Tween 80复配体系的鼻腔黏膜免疫佐剂研究[D]. 曹洪恩. 扬州大学, 2021
- [2]霍乱毒素样抗肿瘤嵌合蛋白佐剂的设计、制备及活性评价[D]. 林丹敏. 广东工业大学, 2019(02)
- [3]支原体纤毛黏附因子P97、鞭毛蛋白-CTB联合使用增强FMD灭活疫苗免疫原性的研究[D]. 郭芸芸. 西藏大学, 2019(12)
- [4]细粒棘球绦虫EgM123重组霍乱毒素B亚单位构建及其免疫特性鉴定[D]. 齐文静. 新疆农业大学, 2018(05)
- [5]水性佐剂在猪乙型脑炎减毒活疫苗中应用的初步评估[D]. 王侨. 四川农业大学, 2018(02)
- [6]O型口蹄疫病毒VP1蛋白GH loop表位表面展示策略与免疫原性研究[D]. 李图帅. 南京农业大学, 2016(05)
- [7]大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位（LTB）对罗非鱼链球菌口服疫苗免疫增强效果的初步研究[D]. 施金谷. 广西大学, 2013(03)
- [8]霍乱毒素无毒B亚单位（CTB）黏膜免疫佐剂的研究进展[J]. 严小芳,张佩,董硕. 生命科学, 2009(01)
- [9]O型FMDV复合表位/CTB重组枯草芽孢杆菌构建与实验免疫[D]. 马海利. 吉林大学, 2008(11)
- [10]大肠杆菌热敏性肠毒素综述[J]. 王晓乾,万春云,姬茜茜. 养殖与饲料, 2007(06)