一、包膜蛋白和核心蛋白共突变体对乙型肝炎病毒在Hep G2细胞中表达的抑制作用（论文文献综述）
张孝璐[1]（2021）在《HBV稳定转染后宿主细胞DNA修复系统异常表达的研究》文中进行了进一步梳理乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染可引起慢性肝炎、肝硬化以及肝细胞癌等后果,全球每年约100万人死于HBV引起的肝脏类疾病,目前尚无有效的治愈手段,严重威胁着全球公共健康。HBV感染引起肝癌的过程十分复杂,目前公认的HBV致癌机制主要包括:乙肝表面抗原（HBs Ag）持续存在引发的慢性炎症、乙肝病毒X蛋白（HBx）作为原癌基因激活剂激活宿主细胞原癌基因表达、乙肝病毒DNA（HBV DNA）整合至宿主细胞基因组进而引起染色体不稳定等。近年来,包括本课题组在内的研究人员通过对宿主细胞DNA修复机制的研究发现,HBV感染后宿主细胞DNA修复系统出现异常,可能与后续发生的基因组突变积累、病毒基因组整合、染色体不稳定以及肝癌的发生有关。为进一步探究HBV感染对宿主细胞DNA修复系统的影响,我们以HBV稳定转染细胞系Hep G2.A64、Hep G2.2.15以及其背景细胞系Hep G2为研究对象,利用RNA-seq测序技术对HBV稳定转染前后宿主细胞的转录组进行了分析,结果显示HBV稳定转染后宿主细胞在转录组水平出现了大量差异表达的基因,利用RT-q PCR和Western Blot技术进一步检测,我们发现HBV稳定转染细胞系中DNA同源重组修复相关基因RAD52在m RNA和蛋白水平的表达量均出现了显着下调。随后,我们利用CRISPR/Cas9基因编辑系统和重组荧光素酶表达载体构建了用于检测细胞DNA同源重组修复能力的CRISPR-SSA报告系统,并利用该系统证实了HBV稳定转染后宿主细胞DNA同源重组修复能力出现显着下降。最后,为了验证RAD52基因在宿主细胞DNA修复中发挥的作用,我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术靶向突变了HEK 293T细胞中的RAD52基因,结果显示RAD52基因突变后的HEK 293T细胞系中多个DNA修复相关基因出现表达下调,且宿主细胞DNA同源重组修复能力出现显着下降,提示RAD52基因或在HBV感染所致的DNA修复抑制中发挥了关键作用。1.HBV稳定转染前后对宿主细胞转录组分析为了探究HBV稳定转染前后宿主细胞转录组水平的改变,我们利用RNA-seq测序技术对HBV稳定转染前后的细胞Hep G2、Hep G2.A64、Hep G2.2.15进行了测序分析。结果显示,与Hep G2细胞相比,HBV稳定转染细胞系Hep G2.A64中共有613个基因出现差异表达,另一HBV稳定转染细胞系Hep G2.2.15中共有6085个基因出现差异表达。通过Reactome富集分析发现,这些差异表达的基因富集至细胞各类代谢通路中,值得注意的是,部分表达下调的基因富集在了DNA双链断裂、DNA修复相关通路。利用RT-q PCR方法,我们对DNA修复通路中重点基因进行了验证。结果显示,与Hep G2细胞相比,HBV稳定转染细胞系Hep G2.A64和Hep G2.2.15中的RAD51、ERCC2、PARP1、ATM、DDB1、RPA1等DNA修复相关基因表达量降低,其中RAD52和XRCC2基因的表达量在Hep G2.A64和Hep G2.2.15两个细胞系中均显着降低（在Hep G2.A64和Hep G2.2.15中RAD52表达量分别下降68.96%±7.59%和60.63%±5.04%,XRCC2表达量分别下降69.58%±6.32%和58.87%±9.34%）。利用Western blot方法,我们对DNA修复通路中重点基因进行蛋白表达水平的验证,结果显示,与Hep G2细胞相比,HBV稳定转染细胞系Hep G2.A64和Hep G2.2.15中的RAD52表达量分别下降69.93%±3.88%和85.74%±2.1%。上述结果表明HBV稳定转染细胞系中大量基因出现差异表达,同时,DNA同源重组相关基因RAD52的表达出现显着下调。2.HBV稳定转染前后宿主细胞DNA同源重组修复能力的评价为了进一步探究HBV稳定转染细胞系中DNA同源重组修复能力的变化,我们利用CRISPR/Cas9系统和重组荧光素酶表达载体,自主建立了一套用于检测细胞DNA同源重组修复能力的CRISPR-SSA报告系统。该系统通过在表达荧光素酶的p GL3质粒中引入一段带有同源臂的插入序列,使得正常情况下荧光素酶无法表达,利用靶向插入序列的CRISPR/Cas9系统切割上述荧光素酶重组质粒,荧光素酶重组质粒借助宿主细胞DNA同源重组系统进行修复后表达荧光素酶使得荧光素酶底物发光,并以此反映宿主细胞DNA同源重组修复能力。利用CRISPR-SSA报告系统,我们分别检测了HBV稳定转染前后细胞系Hep G2、Hep G2.A64、Hep G2.2.15的同源重组修复能力,结果显示,在CRISPR-SSA报告系统转染后48小时,Hep G2.A64细胞的同源重组修复能力仅为Hep G2细胞的10.96%±0.39%,Hep G2.2.15细胞的同源重组修复能力仅为Hep G2细胞的28.44%±1.82%,结果表明HBV稳定转染细胞系中DNA同源重组修复能力出现了显着降低。3.RAD52基因与宿主细胞DNA修复系统关系的研究为了深入探究RAD52基因在宿主细胞DNA同源重组修复中的作用以及其与其他DNA修复基因的关系,我们利用CRISPR-Cas9基因编辑技术在HEK 293T细胞系的基础上构建了RAD52基因突变细胞株,该细胞株中RAD52表达量相比野生HEK 293T细胞株下降了97.98%±1.19%。随后,我们利用CRISPR-SSA报告系统评估了RAD52抑制前后HEK 293T细胞中DNA同源重组修复能力。结果显示,相比野生HEK 293T细胞株,RAD52基因抑制后的细胞株中DNA同源重组修复能力下降了31.18%±2.5%。同时,我们利用RT-q PCR技术检测了RAD52基因抑制后的细胞株中其他DNA修复相关基因。结果显示,相比野生HEK 293T细胞株,RAD52基因抑制后的细胞株中ERCC2表达量下降49.07%±0.49%,XRCC2表达量下降49.35%±0.08%,DDB1表达量下降43.93%±3.57%。结果提示RAD52基因的表达下调可引起宿主细胞DNA同源重组修复能力显着下降,同时可抑制宿主细胞DNA修复相关其他基因的表达,该基因可能在宿主细胞DNA修复过程中发挥了关键作用。综上,本研究发现了HBV稳定转染后的细胞系中大量基因出现差异表达,DNA修复相关基因RAD52基因出现表达下调,同时HBV稳定转染细胞系中的DNA同源重组修复能力受到显着抑制。随后,通过实验证实了宿主细胞内RAD52基因的表达下调可引起DNA同源重组修复能力显着下降,同时可抑制宿主细胞DNA修复相关其他基因的表达。上述结果提示,HBV可能通过下调同源重组修复通路中的RAD52基因抑制宿主细胞DNA同源重组修复能力,进而导致宿主基因因无法正常修复发生大量差异表达。本研究探索了HBV与宿主细胞DNA同源重组修复系统的关系,为后续探究HBV与宿主细胞基因组相互作用以及致癌机制提供新的思路。
张君[2]（2021）在《Na+/K+ ATPaseβ3亚基对乙型肝炎病毒抑制作用及机制的研究》文中研究表明乙型肝炎病毒（HBV）感染导致全世界超过2.5亿人罹患多种肝病。每年有140万人死于与HBV相关的疾病,包括肝硬化,肝衰竭和肝细胞癌。目前,仅核苷酸类似物和干扰素（IFN）被批准用于治疗HBV感染的患者。HBV的基因组是一个3.2kb的部分双链松弛环状DNA基因组（rc DNA）,感染后,HBV基因组被传递到细胞核中并转化为共价闭合的环状DNA（ccc DNA）。ccc DNA依次形成一个微染色体,并用作转录不同病毒转录本的模板,包括3.5kb pre C mRNA和前基因组RNA（pg RNA）,两个包膜mRNA（2.4kb和2.1kb）和X mRNA（0.7kb）。在病毒转录物中,pre C mRNA编码前核心蛋白。pg RNA可翻译为病毒HBc和Pol蛋白,也可作为HBV基因组复制的模板。2.4kb和2.1kb的包膜mRNA编码LHBs,MHBs和SHBs蛋白。此外,0.7kb X mRNA可翻译产生HBx蛋白。四个启动子S1P,S2P,XP和CP调节和控制病毒前基因组RNA和蛋白质的转录。在宿主细胞质中发生病毒RNA转化为HBV蛋白后,病毒pg RNA被封装到核心颗粒中。在核心颗粒内部,pg RNA进一步逆转录为病毒DNA（ss DNA和ds DNA）。然后,将含有HBV DNA的成熟病毒颗粒包裹起来并从宿主细胞中释放出来。乙肝病毒颗粒和亚病毒颗粒是乙肝病毒复制过程中产生的主要病毒颗粒。乙型肝炎e抗原（HBe Ag）是HBc Ag的另一种形式,易位进入内质网腔进行蛋白水解加工,并以可溶性蛋白的形式分泌。虽然目前HBe Ag的功能仍然不明确,但是HBs Ag和HBe Ag被认为对HBV传播和临床诊断很重要。ATP1B3（也称为CD298）,是Na+/K+ATPase的三个调节性β亚基之一,于1998年被首次发现和鉴定。先前的研究表明,ATP1B3不仅参与了Na+/K+泵的活性,还可以调节T细胞活化的独立Na+/K+ATPase活性。近期研究表明Na+/K+ATPase的β亚基与某些病毒感染有关。例如ATP1B1被鉴定为人类巨细胞病毒（HCMV）UL136蛋白以及甲型和乙型流感病毒的M2蛋白的伴侣。此外,ATP1B3还可以减少Hela细胞中BST-2介导的人类免疫缺陷病毒1产生的限制。并且近期研究表明ATP1B3与肠病毒71（EV71）的3A蛋白相互作用,并通过增强I型干扰素的产生来抑制EV71复制。与此同时,BST-2被鉴定为是一种可诱导IFN的抗病毒蛋白,它阻止了各种包膜病毒的释放,例如HIV,Lassa,Marburg和埃博拉病毒。现有研究证明BST-2将新生的HBV病毒粒子束缚在质膜上。同时,通过酵母双杂交筛选鉴定了ATP1B3和BST-2存在相互作用。那么ATP1B3是否参与HBV的传播?以及ATP1B3和BST-2之间的关系是否与HBV的传播有关?本研究探讨ATP1B3对HBV复制的影响,并得出了以下的实验结果及结论:1.ATP1B3能够抑制HBV抗原的分泌。本研究将HBV感染性克隆质粒转染进Hep G2细胞中,同时转染ATP1B3表达质粒,通过ELISA的方法检测上清中HBs Ag的含量。通过与对照组对比,实验组HBs Ag含量明显减少。在Hep G2.2.15和Hep AD38细胞中过表达ATP1B3,同样能够减少细胞培养上清中HBs Ag的产生。相对地,在细胞中使用小干扰RNA和短发夹RNA介导ATP1B3的沉默,能够增加上清中HBs Ag的含量。同时,ATP1B3并未下调细胞内HBV复制中间体（HBV DNA）和转录本（HBV RNA）的含量。它表明ATP1B3能损害病毒蛋白的表达,但不能损害病毒复制和转录。以上结果说明,ATP1B3能够抑制HBV抗原的分泌。2.ATP1B3激活Hep G2细胞中的NF-κB信号传导通路。通过双萤光素酶报告基因检测Hep G2细胞中ATP1B3对NF-κB活化的影响。观察到ATP1B3以剂量依赖性方式激活NF-κB信号通路。核质分离实验证实ATP1B3诱导NF-κB亚基P65转运进核内。TAK1蛋白可以激活NF-κB。将TAK1转染到sh RNA介导的ATP1B3沉默的Hep G2中,NF-κB的激活受到强烈抑制。使用NF-κB抑制剂Bay11-7082证实了抑制NF-κB活性能显着降低HBs Ag的表达。推测ATP1B3可以通过激活NF-κB以抑制HBV。3.ATP1B3诱导IFN-α/ISGs和IL-6抑制HBV。ATP1B3上调Hep G2细胞中IFN-α和IL-6的表达。实时定量PCR的结果表明ATP1B3可以明显诱导OAS2和BST-2,但不能诱导ISG-15和ISG-56的表达。这些研究结果表明ATP1B3诱导的BST-2的表达可有助于对HBV抗原的抑制功能。进一步研究发现,与HEK293T细胞相比,Hep G2细胞中BST-2的表达被IFN-α显着上调。因此,以上研究表明,ATP1B3可以通过NF-κB/IFNs诱导BST-2,从而促进肝细胞对HBV的抑制。4.ATP1B3与BST-2合作促进HBs Ag限制抑制HBV。为了证明ATP1B3和BST-2在限制HBV方面的协同作用,我们研究了ATP1B3在BST-2阴性细胞HEK293T中对HBV的抑制作用。结果显示ATP1B3对BST-2阳性细胞Hep G2的HBs Ag产生的抑制作用强于BST-2阴性HEK293T细胞,表明BST-2可能是ATP1B3限制肝细胞中HBs Ag的合作者。5.ATP1B3促进蛋白酶体依赖的细胞内HBs Ag的降解。蛋白质印迹显示ATP1B3的过表达显着降低了LHBs,MHBs的细胞内蛋白水平,SHBs略有减少,Core蛋白则没有显示出任何下降。CHX追踪分析证实了ATP1B3的表达加速了细胞中HBs的降解。蛋白酶体抑制剂MG132能够明显抑制ATP1B3诱导的降解,并且呈剂量依赖性。6.ATP1B3与LHBs和MHBs在细胞中相互作用并共定位。通过免疫荧光分析研究了ATP1B3与HBV蛋白的共定位。作为跨膜蛋白,ATP1B3单独位于细胞膜上。当与LHBs和MHBs共表达时,ATP1B3在核周区域周围呈点状分布,并与LHBs和MHBs一起在细胞质中扩散,而HBc表现出聚集的胞质分布并且几乎与ATP1B3共定位。我们推测,ATP1B3由于与HBs相互作用将其从膜扩散到细胞质,从而被强力降解。ATP1B3跨膜区的缺失几乎导致ATP1B3不再与LHBs,MHBs和SHBs共定位。我们推测跨膜区域可能是负责HBs结合和降解的功能域。通过免疫共沉淀进一步确认了ATP1B3与HBs之间存在相互作用。7.ATP1B3诱导LHBs和MHBs的多聚泛素化。用泛素或靶向蛋白抗体染色时,当存在ATP1B3时,LHBs和MHBs的多泛素化程度要强于不存在ATP1B3的情况。我们还发现了在48位（K48）仅包含一个赖氨酸的泛素突变体足以用于ATP1B3介导的HBs泛素化。在使用阴性的泛素突变体后,完全阻断了ATP1B3介导的LHBs和MHBs的降解,这进一步证实ATP1B3介导的HBV包膜蛋白降解是蛋白酶体依赖性方式。综上所述,本研究运用分子生物学、病毒学等研究手段,证明了ATP1B3对HBV的抑制作用,并揭示了ATP1B3通过核因子κB（NF-κB）/IFN-α和NF-κB/白介素-6（IL-6）途径成为HBV复制的新型宿主限制子。此外,本研究证明了ATP1B3诱导其结合蛋白BST-2拮抗Hep G2细胞中的HBs Ag。同时,ATP1B3促进了蛋白酶体依赖性的HBV包膜蛋白的降解,并且通过第48位赖氨酸泛素化促使HBs加速降解。我们得出结论,ATP1B3作为一种新型抗病毒因子,可以采用多种机制来对抗HBV。我们的工作突出了ATP1B3可以作为HBV感染的潜在治疗靶标。
孙瑜雪[3]（2021）在《靶向HBV核心启动子转录活性的化合物筛选与鉴定》文中提出目的:现有慢性乙型肝炎治疗药物虽能有效控制病情,但尚难以获得治愈,因而开发新型抗乙肝药物十分必要。靶向乙型肝炎病毒（HBV）核心启动子转录过程开发药物,是一种很有吸引力但尚未充分开发的抗病毒策略。本研究中,我们利用重组慢病毒,在HepG2细胞上构建了由HBV核心启动子驱动的Gaussia荧光素酶稳定表达细胞系（HepG2-Pcore-Gluc）,该细胞系利用检测到的荧光素酶数值大小来说明核心启动子的活性变化情况,便于表征化合物对核心启动子转录活性的影响。本研究利用该模型从一个包含1,450种小分子化合物库中,筛选影响HBV核心启动子转录活性的候选药物。方法:在HepG2细胞上以重组慢病毒的方式构建由HBV核心启动子驱动的Gaussia荧光素酶稳定表达细胞系（HepG2-Pcore-Gluc）,利用该模型将一个包含1,450种小分子的化合物库进行初步筛选;将第一轮的筛选得到的能够影响荧光素酶活性的化合物进行第二轮的剂量依赖性测试;在剂量依赖性测试中那些效果相对稳定且显微镜下无明显毒性的化合物保留进行下一步验证;在HBV复制细胞模型中通过Southern blot、荧光定量PCR等实验评估候选化合物对HBV RNA、HBV DNA的影响;利用Western blot实验来评估候选化合物对核心启动子活性或核心蛋白翻译的影响;利用ELISA实验来评估候选化合物对乙肝病毒表面抗原和E抗原分泌水平的影响;利用分段荧光素酶报告质粒瞬时转染实验来进一步探索候选化合物的作用区段。结果:利用HepG2-Pcore-Gluc细胞模型从一个包含1,450种小分子的化合物库中初步筛选到41种化合物能影响荧光素酶活性两倍以上;将初筛得到的41种化合物进行第二轮的剂量依赖性测试后最终保留了两种化合物（Reversine（逆转素）、SCH58261）进行下一步的验证;经后续验证发现,Reversine在HepG2和HepG2.2.15细胞中,能够有效抑制HBV RNA的转录、HBV DNA的复制以及乙肝表面抗原、乙肝E抗原的分泌。结论:本研究构建了一种新的细胞模型,可用于筛选靶向乙肝病毒核心启动子转录的药物,该模型基于一种由核心启动子驱动的荧光素酶稳定表达细胞系（HepG2-Pcore-Gluc）。利用该模型我们从一个1,450种小分子的化合物库中最终筛选到一种化合物Reversine,通过多轮验证提示该化合物能够通过抑制HBV核心启动子的转录活性从而抑制HBV RNA的转录,因此,该模型可作为一种新型高效的抗乙肝药物初筛细胞模型,所筛选到的小分子化合物Reversine也可以作为进一步开发新型抗乙肝病毒活性药物的基础。
刘俊叶[4]（2021）在《基于GRP78的新型抗HBV抑制剂的研究》文中进行了进一步梳理目的:纵然疫苗的接种、人类卫生意识的提高和抗病毒药物的逐渐开发降低了乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）的感染,但迄今为止,HBV的消除仍是一大难题。主要原因是现有的抗乙肝药物难以完全消除共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA,ccc DNA）,因此迫切需要寻找新的靶点。HBV的生命周期大致概括为:入胞、ccc DNA的形成、核衣壳的组装、包膜化及分泌等几个关键环节。除了病毒分泌环节,以上各关键环节均有相应的抗病毒药物,主要原因是目前对HBV分泌调控机制尚不清晰,尚未找到合适的分泌相关靶点。我们研究小组早期利用质谱鉴定、转录组高通量测序、细胞及动物实验等发现人78 k D的葡萄糖调节蛋白（the 78k Da glucose-regulated protein,GRP78）与HBV的分泌有关,进而以GRP78为靶蛋白,噬菌体展示技术为手段,筛选出抑制HBV分泌的小分子物质,并进行实验验证,为HBV的治愈提供新策略。方法:（1）以GST-PreS1为诱饵蛋白,通过pull-down、质谱鉴定分析后发现目的蛋白GRP78,免疫共定位、等温滴定量热法（isothermal titration calorimetry,ITC）实验探讨PreS1与GRP78间是否存在相互作用;（2）转录组高通量测序寻找GRP78与HBV生命周期的哪个环节有关;（3）分别对Hep G2.2.15细胞进行Ad-GRP78感染及si RNA转染处理后,采用particle gel对上清中的HBV Dane颗粒进行检测,验证GRP78对HBV分泌的作用;（4）为了获得纯度较好的GRP78蛋白,我们将构建好的重组p ET-28a-GRP78质粒转入E.coli BL21予以原核表达和Ni-NTA纯化;（5）为了得到与GRP78相互作用的小肽,我们选用噬菌体展示技术为工具;（6）借助ITC实验体外验证GRP78与合成小肽间的相互作用;（7）QPCR、particle gel实验用于筛选具有HBV分泌抑制作用的小肽,ELISA及capsid实验探究小肽的具体作用机制。结果:（1）质谱鉴定结果发现,GRP78与PreS1存在特异性相互作用;（2）转录组高通量测序暗示GRP78可能与HBV的分泌环节有关;（3）particle gel结果证明GRP78可以提升HBV的分泌水平;（4）以镍柱为工具,纯化后获得浓度、纯度均较高的重组GRP78蛋白;（5）噬菌体展示技术筛选出了60种可与GRP78结合的小肽,经分析,委托公司合成了6种频数较高的小肽;（6）ITC结果证明除GBP-67外,其余5种小肽与GRP78均存在相互作用;（7）细胞实验提示GBP-68可以抑制HBV的分泌;（8）对GBP-68的抗病毒机理进行了初步分析。结论:该研究前期发现了与HBV分泌相关的靶分子——GRP78蛋白,进一步实验证实GRP78可以促进HBV的分泌后,选择GRP78蛋白为靶点,以噬菌体展示技术为手段,筛选出抑制HBV完整病毒颗粒分泌的小肽（GBP-68）,且该抑制作用主要是通过抑制HBV病毒颗粒的包膜化过程来实现的。
王晴[5]（2021）在《SIRT1在乙型肝炎病毒蛋白X（HBx）促进肝细胞癌发生发展中的作用及其机制研究》文中提出背景:肝细胞癌（HCC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一,慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染与HCC的发展密切相关。乙肝相关性肝癌的发病机制尚未完全清楚,但有证据表明,病毒蛋白HBx可通过参与宿主基因转录、细胞信号转导以及细胞周期和凋亡等过程,促进乙肝相关性肝癌的发生发展。但HBx促进乙肝相关性肝癌的分子机制尚未完全阐明。因此,探究HBx在乙肝相关性肝癌中的作用机制十分必要。Sirtuin 1（SIRT1）作为Sirtuin家族的一员,被证实可促进HBV的复制;同时多项研究发现SIRT1还可以促进HCC的增殖和转移。但SIRT1是否可以与病毒蛋白HBx相互作用进而促进HCC发生发展尚不清楚。深入探究SIRT1在乙肝相关性肝癌中的作用以及SIRT1和HBx之间的潜在关联,有利于解析乙肝相关性肝癌的作用机制,为乙肝相关性肝癌的治疗提供理论依据。目的:探讨SIRT1在乙肝相关性肝癌中的表达水平,进一步分析HBx与SIRT1之间的相互调控关系,最后充分解析SIRT1/HBx调控乙肝相关性肝癌的分子机制,为乙肝相关肝癌的治疗提供新的思路。方法:1.明确SIRT1与乙肝相关性肝癌转移的关系:收集10例乙肝相关性肝癌患者的肝组织,根据肿瘤是否转移将其分为两组。分别采用real-time PCR和Western blot检测组织中SIRT1的mRNA和蛋白质水平;Western blot法检测组织中上皮-间充质转化相关标志物（E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白和波形蛋白）的蛋白质水平。2.探讨SIRT1与HBV的关系:利用real-time PCR和Western blot检测HBV表达的肝癌细胞中SIRT1的mRNA和蛋白质水平。3.探究SIRT1与病毒蛋白的关系:将HBx、HBc、HBs和HBp过表达质粒瞬时转染至肝癌细胞Huh-7中,real-time PCR和Western blot检测细胞中SIRT1的mRNA和蛋白质水平;在表达HBx的肝癌细胞Huh-7和HepG2中过表达及沉默SIRT1后,Western blot检测细胞中HBx的蛋白质水平。4.阐明SIRT1在HBx诱导的肝癌中的功能作用:在Hep AD38及表达HBx的肝癌细胞Huh-7和HepG2中过表达及沉默SIRT1,利用Western blot、细胞增殖实验、伤口愈合实验和转移侵袭实验等检测SIRT1对HBx诱导的肝癌增殖、迁移和侵袭的影响。5.评估SIRT1抑制剂烟酰胺的抗肿瘤作用:MTT法检测烟酰胺在Hep AD38、HepG2及Huh-7细胞中的毒性作用;细胞增殖实验、伤口愈合实验分析烟酰胺对表达HBx的肝癌细胞Huh-7和HepG2增殖和迁移的影响。结果:1.SIRT1与乙肝相关性肝癌的转移密切相关:与非转移组患者相比,转移组患者的肿瘤肝组织中SIRT1的表达明显增加;同时上皮标志物E-钙粘蛋白的表达减少而间充质标志物N-钙粘蛋白和波形蛋白的表达增加。2.HBV可上调SIRT1的表达:与对照组相比,HBV表达的肝癌细胞中SIRT1的mRNA和蛋白质水平均明显升高。3.SIRT1与HBx之间存在正向调节关系:过表达HBx可以增加SIRT1的mRNA和蛋白质水平;过表达SIRT1可以增加HBx的蛋白水平。4.HBx通过调节SIRT1促进HCC发生发展:功能学研究显示,过表达SIRT1可显着增强Hep AD38及表达HBx的肝癌细胞HepG2和Huh-7的增殖、迁移和侵袭,沉默SIRT1时则相反。5.SIRT1抑制剂烟酰胺具有抗肿瘤作用:烟酰胺在Hep AD38、HepG2和Huh-7细胞中的CC50分别为58.3m M、52.9m M和55.7m M;烟酰胺可呈剂量依赖性的抑制表达HBx的肝癌细胞的增殖及迁移。结论:本研究证实了SIRT1在乙肝相关性肝癌中表达水平明显升高,阐明了SIRT1可促进HBx诱导的肝癌的增殖以及转移侵袭。
胡杰[6]（2021）在《SAMHD1蛋白的O-GlcNAc修饰抑制HBV复制的机制研究》文中进行了进一步梳理目的:乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染是一个全球性的公共卫生问题,全球范围内有大约2.4亿人感染乙肝病毒[1],乙肝病毒慢性感染可导致肝硬化、肝衰竭和肝癌[1]。目前两类HBV感染的治疗药物（干扰素类（Interferon）和核苷/核苷酸类似物（NAs））的疗效十分有限（1年期治疗HBs Ag阴转率通常<5%,延长治疗HBs Ag阴转率通常亦<10%）[2],加之HBV耐药突变株的出现,核苷酸类似物治疗效果常常不能持久;因此寻找新的抗病毒靶点具有非常重要的意义。代谢是生命活动中生物化学过程的总称,病毒在细胞内完成复制和包装等生活周期必然伴随着代谢的变化。细胞代谢重编程在激活免疫系统和炎症反应中起着关键的作用。一方面,在应对病原体感染或组织损伤时,激活的免疫反应向代谢系统发出反馈信号,诱导代谢重编程,增强分解代谢,从而向其他系统传递应激信号,引发一系列恢复性应激反应。另一方面,分解代谢的增强可以满足快速有效的免疫应答如免疫细胞迁移、吞噬和细胞因子产生等对生物分子和能量的需求。病毒感染诱导的代谢重编程不仅涉及代谢通路的改变,代谢酶和代谢产物还可以直接参与免疫调控[3-5]。最近的研究表明己糖胺生物合成途径（hexosamine biosynthesis pathway,HBP）在宿主先天免疫中发挥重要作用。大约2%-5%的进入细胞的葡萄糖被转化为HBP的最终产物尿苷二磷酸N-乙酰氨基葡萄糖（UDP-GlcNAc）[6],并作为O-连接的β-N-乙酰氨基葡萄糖（O-GlcNAc）修饰的供体[7]。HBP及其介导的蛋白O-GlcNAc修饰在宿主抗水泡性口炎病毒（VSV）[8]、流感病毒[9]和丙型肝炎病毒[10]的抗病毒免疫中起积极作用。包含SAM和HD结构域的I型蛋白（SAMHD1）是一种干扰素诱导的限制宿主因子,在先天性免疫反应中发挥重要的抗病毒作用[11]。宿主限制因子SAMHD1具有d GTP/GTP依赖的三磷酸水解酶活性（d NTP水解酶活性）,通过降低细胞内d NTP浓度,限制HIV-1的复制[12];同时SAMHD1蛋白还具有核酸酶活性,能够直接降解病毒RNA基因组,抑制病毒的复制和转录。研究发现SAMHD1的d NTP水解酶活性可以特异性抑制HBV DNA的合成和病毒复制,但不影响HBV ccc DNA的转录和基因表达[13,14]。对SAMHD1蛋白的翻译后修饰研究发现,SAMHD1可以发生磷酸化、乙酰化、氧化和泛素化修饰等,可能对其抗病毒功能发挥多重调控作用。我们之前的研究已经证明,Cyclin E2-CDK2可以介导SAMHD1磷酸化以消除其对HBV复制的抑制作用[14]。然而,目前尚不清楚SAMHD1是否可以发生O-GlcNAc修饰,以及SAMHD1的O-GlcNAc修饰是否影响其抗病毒功能。本研究将首先在HBV感染细胞模型和临床标本中检测糖代谢、HBP途径以及O-GlcNAc修饰的变化,观察干预O-GlcNAc修饰对HBV复制的影响,深入探讨HBV感染后上调HBP途径和O-GlcNAc修饰的分子机制,并进一步阐明病毒感染通过代谢重编程促进宿主限制因子SAMHD1的O-GlcNAc修饰,在抗病毒天然免疫中的作用机理。方法:1.HBV感染细胞糖代谢、HBP途径以及O-GlcNAc修饰的变化:我们在HepG2细胞中过表达Ad HBV1.3,或者HBV感染的HepG2-NTCP细胞收集细胞代谢物,采用非靶标和靶标代谢物分析,检测葡萄糖和UDP-GlcNAc水平。同时通过Western blot检测HBV感染后蛋白O-GlcNAc修饰水平和HBP关键酶GFPT1,OGT,OGA的蛋白表达变化,通过q RT-PCR和免疫荧光检测HBV感染后葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）的表达水平。2.干预O-GlcNAc修饰对HBV复制的影响:通过GLUT1抑制剂WZB117,GFPT1抑制剂DON,OGT抑制剂ST045849,以及OGA抑制剂Thiamet G处理HBV感染的Hep AD38、HepG2-NTCP和HepG2细胞,Western blot检测O-GlcNAc修饰水平,q PCR或Southern blot检测HBV DNA。我们还将在上述HBV感染复制细胞模型中采用shRNA分别敲低GFPT1,OGT,OGA,Western blot检测O-GlcNAc修饰水平,q PCR或Southern blot检测HBV DNA的变化水平。3.鉴定HBV感染后发生O-GlcNAc修饰的关键分子及其在抗病毒天然免疫中的作用:裂解去掉四环素的Hep AD38细胞,加入O-GlcNAc抗体孵育,富集可能有O-GlcNAc修饰的蛋白,通过LC-MS/MS鉴定可能发生O-GlcNAc修饰的蛋白。通过GO分析筛选与免疫相关的蛋白。进一步通过Co-IP实验和免疫荧光实验检测与OGT发生相互作用的蛋白,并筛选与OGT相互作用蛋白的主要区段。通过IP实验和LC-MS/MS鉴定发生O-GlcNAc的位点并再次通过IP实验及s WGA实验验证其O-GlcNAc修饰位点。通过寡聚化实验检测HBV感染对SAMHD1四聚化的作用,通过HPLC实验检测原核表达的SAMHD1WT及S93A蛋白的d NTPase活性。我们将SAMHD1野生型WT或S93A变体转染到SAMHD1基因敲除的Hep AD38,HepG2以及HepG2-NTCP细胞中。提取HBV DNA后,通过荧光定量PCR,Southern blot检测S93A突变后对HBV复制的影响。将SAMHD1野生型WT或S93A突变体转染到SAMHD1基因敲除的THP-1细胞中,加入带有荧光素酶表达基因的HIV-1的单轮复制的假病毒,通过荧光素酶实验检测SAMHD1 S93A突变对HIV-1的抑制作用。4.在HBV转基因小鼠和临床标本中验证SAMHD1的O-GlcNAc修饰:通过LC-MS/MS检测慢性HBV感染者血浆中的UDP-GlcNAc水平。通过Western blot检测HBV转基因小鼠及慢性HBV感染者的O-GlcNAc修饰,s WGA实验检测慢性HBV感染者肝组织SAMHD1的O-GlcNAc修饰。结果:1.通过非靶标和靶标代谢检测发现HBV感染后Glucose和UDP-GlcNAc显着升高:Western blot检测发现HBV感染后HBP途径和蛋白O-GlcNAc修饰是显着增强的。HBV感染后,HBP关键酶GFPT1,OGT,OGA的蛋白水平没有明显变化,通过q PCR和免疫荧光发现HBV感染后上调了肝细胞表面葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）的表达,促进了葡萄糖摄取,为HBP合成UDP-GlcNAc提供了底物,导致蛋白O-GlcNAc修饰增加。2.GLUT1抑制剂WZB117,GFPT1抑制剂DON,OGT抑制剂ST045849处理细胞后,O-GlcNAc修饰降低,并促进HBV复制。而OGA抑制剂Thiamet G处理细胞后O-GlcNAc修饰增强,能够显着抑制HBV的复制。shGFPT1,shOGT处理细胞后,O-GlcNAc修饰降低,并促进HBV复制。而shOGA处理细胞后O-GlcNAc修饰增强,能够显着抑制HBV的复制。3.通过LC-MS/MS鉴定可能发生O-GlcNAc修饰的蛋白有1034种。通过GO分析筛选与免疫相关的蛋白SAMHD1。进一步通过Co-IP实验和免疫荧光实验检测SAMHD1与OGT发生相互作用,并筛选与OGT相互作用的区段为1-150aa。通过IP实验和LC-MS/MS鉴定SAMHD1的Ser93为O-GlcNAc修饰的位点,并通过IP实验及s WGA发现S93A突变后O-GlcNAc修饰降低,说明SAMHD1的Ser93为主要的O-GlcNAc修饰位点。通过寡聚化实验检测HBV感染后SAMHD1四聚化增强,通过HPLC实验检测原核表达的SAMHD1 S93A蛋白的d NTPase活性降低。SAMHD1 S93A突变后丧失了对HBV复制的抑制作用,SAMHD1 S93A突变对HIV-1的抑制作用也消失了。4.通过LC-MS/MS检测慢性HBV感染者血浆中的UDP-GlcNAc水平升高。通过Western blot检测HBV转基因小鼠及慢性HBV感染者的O-GlcNAc修饰增高,s WGA实验检测慢性HBV感染者肝组织SAMHD1的O-GlcNAc修饰显着升高。结论:HBV感染促进HBP途径,使UDP-GlcNAc底物显着升高,并增强O-GlcNAc修饰。而HBP介导的高的O-GlcNAc修饰水平能够抑制HBV的复制,质谱检测到靶蛋白宿主限制性因子SAMHD1有O-GlcNAc修饰,进一步检测到Ser93位点为其发生O-GlcNAc修饰的关健位点,且SAMHD1的Ser93位O-GlcNAc正向调节宿主体内外抗HBV免疫应答。这些发现揭示了HBP、O-GlcNAc修饰和以SAMHD1为靶点的先天抗病毒免疫之间的联系。
孟诗敏[7]（2020）在《半乳糖凝集素-3结合蛋白作为正向调节因子参与IFN-γ介导的抗HBV作用》文中研究表明乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染是严重的全球公共健康问题之一,人体肝脏长期被HBV侵袭会导致不同程度的肝纤维化、肝硬化,甚至发展成肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）。临床常用的抗病毒治疗药物包括干扰素和核苷/核苷酸类似物。IFN-γ属于Ⅱ型干扰素,除了能发挥抗病毒功能外,还有抗肿瘤、调节机体免疫反应和维持机体自身稳定等多重功能。与IFN-α相比,IFN-γ还有较好的抗纤维化作用,能更好地预防肝细胞的恶性发展,但IFN-γ的抗病毒机制迄今尚未十分明确。通过文献调查和前期预实验,我们发现IFN-γ能引起细胞中半乳糖凝集素-3结合蛋白（Galectin-3-binding protein,LGALS3BP）表达量的增高。LGALS3BP是一种在人体内普遍存在且功能多样的分泌型糖蛋白,在人血清和其他生物体液中均能被检测出来。有文章报道LGALS3BP与机体的免疫功能有紧密联系,且能对抗多种病毒的感染。而IFN-γ抗HBV的分子机制尚不清楚,本研究提出科学假设,LGALS3BP能否作为辅助因子参与IFN-γ介导的抗HBV作用。本研究以瞬时转染1.1×HBV质粒（p CH9-3091）的Hep G2和包含HBV基因组的Hep G2.215二种细胞系为模型,首先,发现IFN-γ刺激后能引起Hep G2中LGALS3BP内源性表达量增加,接着,在这二种细胞系中证明了IFN-γ具有直接的抗HBV作用。随后成功构建了LGALS3BP基因的过表达质粒pc DNA3.1-LGALS3BP和干扰质粒p SUPER-sh-LG,通过瞬时转染进入细胞,实现了对细胞中LGALS3BP基因表达水平的正反向调节。最后,我们在对细胞中LGALS3BP过表达或敲低的基础上,用40ng/ml浓度的IFN-γ处理两种细胞,用ELISA方法检测感染病毒的细胞分泌到培养液中HBV HBe Ag和HBs Ag的水平,采用q PCR的方法检测细胞内病毒核衣壳中新生的HBV DNA的复制水平,采用q RT-PCR的方法检测细胞内HBV m RNAs转录水平。实验结果表明40ng/ml的IFN-γ对细胞没有毒性,能下调细胞内病毒核衣壳中HBV DNA和细胞内HBV m RNAs水平,抑制细胞分泌至培养液中HBV HBs Ag的水平,但对HBe Ag分泌水平影响不明显。总之,在LGALS3BP过表达的情况下,IFN-γ对HBV的抑制作用增强。反之,当LGALS3BP的表达量被敲低时,IFN-γ对HBV的抑制作用被削弱。因此,我们得到结论,LGALS3BP作为正向调节因子参与IFN-γ介导的抗HBV过程。
刘悦[8]（2020）在《宿主限制性因子SERINC5对乙型肝炎病毒的抑制作用及机制的研究》文中提出乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染是严重的公共卫生健康问题,是导致肝硬化及原发性肝细胞癌的主要原因。世界范围内有超过2.4亿人感染乙型肝炎病毒,我国形势尤其严峻,有超过8000万成年人为HBV携带者,控制HBV感染的要求十分迫切。目前抗HBV的药物主要为干扰素类药物及核苷酸类似物,虽能取得一定疗效,但由于其治愈率仍旧较低,以及各种副作用（如骨髓抑制、神经精神症状加重等）和耐药性的产生,使得大多数患者需要接受无限期的治疗。因此,进一步研究HBV感染与人体相互作用机制,寻找新的治疗靶点,具有重要的临床意义和价值。乙型肝炎病毒是一种具有包膜的嗜肝性病毒,是最小的通过逆转录进行复制的部分双链环状DNA病毒,基因组长度约3.2kb。在HBV病毒感染细胞过程中,其疏松的环状DNA（rc DNA）进入细胞核修复成高度稳定的共价闭合环状DNA（ccc DNA）,之后以ccc DNA为模板转录出各种HBV病毒的RNA,包括前基因组RNA（pg RNA）。HBV的包膜蛋白包括大蛋白（LHBs）、中蛋白（MHBs）、小蛋白（SHBs）三种形式,在HBV的生活周期中起到重要的作用。病毒与宿主间复杂的相互作用关系,提示我们深入地研究病毒与宿主之间相互作用机制,通过机制揭示,可以为开发针对HBV的创新型药物提供更多的新的药物作用靶点。在对人免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus,HIV）的研究中,人们发现了人体内一系列能够拮抗HIV的宿主蛋白,称为宿主限制性因子。作为科学家们竞相研究的前沿热点科学问题,宿主限制性因子主要包括APOBEC3家族,TRIM5α,BST-2,SAMHD1,Mx2,GBP5等。宿主限制性因子能够干扰包括病毒脱衣壳、核酸进入、基因组复制、病毒粒子释放及融合等在内的病毒复制各个阶段,并且其抗病毒能力往往具有广谱性。2015年,科学家发现了一种新的限制性因子—丝氨酸整合因子5（serine incorporator 5,SERINC5）对HIV病毒感染的抑制作用。证明了HIV辅助蛋白Nef缺失的情况下,分布在细胞膜上的SERINC5会在HIV子代病毒释放过程中整合入病毒粒子包膜,使其在进入下一个靶细胞时受阻,从而降低HIV的感染性,抑制HIV病毒的复制。而Nef则通过将SERINC5限制在核周的囊泡阻止其包装入子代病毒包膜,帮助病毒逃避SERINC5的限制。鉴于宿主限制性因子抗病毒的广谱性,结合SERINC5是通过影响HIV包膜蛋白的组成结构从而降低HIV感染性的机制,那么SERINC5对其它具有包膜的病毒粒子是否具有类似影响?本研究将SERINC5应用于同样具有包膜的HBV,探讨SERINC5对HBV复制的调控作用,得出了以下实验结果及结论:1.SERINC5能够抑制HBV的分泌;本研究在Hep G2细胞中转染HBV感染性克隆质粒,同时呈剂量梯度分别共转SERINC5、SERINC3和SERINC1质粒,用ELISA方法检测上清中HBV表面抗原（HBs Ag）的含量。与对照组相比,SERINC5组细胞上清中HBV HBs Ag明显减少,而SERINC3组及SERINC1组无此现象。同时,本研究用免疫共沉淀的方法提纯上清中HBV完整病毒粒子,并使用实时定量PCR检测病毒粒子DNA水平,发现SERINC5组上清中HBV完整病毒粒子明显减少。那么,SERINC5是在HBV复制的哪一个阶段发挥了抑制作用呢?本研究使用Southern blot及Northern blot技术分别检测发现细胞内HBV核心颗粒DNA及整体RNA的含量均未受到影响。这说明,SERINC5抑制了HBV完整病毒粒子及表面抗原的分泌。本研究同时使用RNA干扰技术,在Hep G2细胞中下调SERINC5的表达,发现上清中HBs Ag及HBV完整病毒粒子的含量均有所增加,而细胞内HBV核心颗粒DNA及整体RNA含量均无变化。在Hep G2.2.15细胞中过表达SERINC5,得到与Hep G2细胞中相同的结果。本研究同时建立了感染体系,在Hep G2-NTCP细胞中过表达SERINC5,并用Hep AD38产生的HBV病毒进行感染,同样得到SERINC5抑制HBs Ag及HBV完整病毒粒子分泌的结果。以上结果说明,SERINC5能够抑制HBV的分泌。2.SERINC5影响HBV包膜蛋白包括大蛋白（LHBs）、中蛋白（MHBs）、小蛋白（SHBs）的糖基化修饰;为了探究SERINC5抑制HBV分泌的机制,本研究考察了SERINC5对HBV各种功能蛋白的影响。发现SERINC5能够影响HBV包膜蛋白包括LHBs、MHBs、SHBs的糖基化修饰,使其糖基化形式减少,而非糖基化形式增加。3.SERINC5通过影响HBV包膜蛋白糖基化修饰,达到抑制HBV病毒粒子分泌的作用本研究设计了HBV包膜蛋白糖基化位点突变体,发现SERINC5对HBV包膜蛋白糖基化修饰的影响与包膜蛋白糖基化位点突变体相似,同时也与衣霉素对LHBs,MHBs和SHBs糖基化的抑制作用相似。根据前人研究已经指出的包膜蛋白去糖基化严重损害HBV病毒粒子的分泌,本研究又使用p HBV1.3-ENV-质粒,野生型LHBs质粒及LHBs N146A糖基位点突变质粒,设计病毒合成包装分泌实验,考察SERINC5对HBV分泌的影响。确定SERINC5是通过影响HBV包膜蛋白的糖基化修饰,抑制HBV病毒粒子分泌这一观点。4.SERINC5与LHBs共定位在细胞的高尔基体;蛋白质糖基化修饰过程中,翻译后的蛋白质首先在内质网腔内或内质网膜被连接上糖链,随后被运送到高尔基体中,经过一系列糖基转移酶及糖苷酶继续添加糖链并对合成的糖链进行剪切等进一步修饰,最后成为成熟的糖蛋白。为了进一步探究SERINC5影响HBV包膜蛋白糖基化修饰的机制,本研究选用了免疫荧光共定位技术,分析SERINC5与LHBs在Hep G2细胞中的亚细胞定位。发现当LHBs单独存在时,其在细胞质中均匀分布,但在SERINC5存在的情况下,LHBs则与SERINC5完全定位在高尔基体中而不是内质网。并且免疫共沉淀技术证实SERINC5能够分别与LHBs、MHBs、SHBs结合。因此,本研究分析认为SERINC5影响了HBV包膜蛋白在细胞中的定位,从而影响其糖基化修饰。5.对SERINC5抑制HBV功能区进行鉴定。SERINC5属于膜蛋白,据推测具有10个跨膜螺旋结构。本研究设计了不同的SERINC5截短体、磷酸化突变体及糖基化突变体,目的是鉴定SERINC5抑制HBV分泌的功能区。实验发现SERINC5的第四至第六穿膜结构域对于其抑制HBV的功能是不可或缺的。对预测的SERINC5两处磷酸化位点S34、T333分别进行突变后,其抑制HBV的功能有轻度的减低。但由于SERINC5分别缺失34和333的两个截短体（145-461和1-311）仍保留完整的抗HBV活性,说明这两个点突变并不是通过影响磷酸化修饰来影响SERINC5抗HBV活性。另外两个SERINC5保守的糖基化位点N133和N294与其对HBV的抑制作用无关。综上所述,本研究运用病毒学、分子生物学及细胞生物学手段,证明了SERINC5对HBV分泌的抑制作用,并揭示了SERINC5通过与HBV包膜蛋白结合,改变其亚细胞定位,使其重新分布在高尔基体,从而影响HBV包膜蛋白糖基化修饰,抑制HBV病毒分泌的这一机制。SERINC5是一种潜在的抗HBV内在因子,对SERINC5的深入研究可能为我们提供一条抗HBV的新途径,并对研究其他病毒起到启示作用。
陈欢[9]（2020）在《肝细胞内质网应激对HBV复制及恩替卡韦抗病毒作用的影响》文中研究说明目的:内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）是多种肝脏疾病中一种常见病理现象,可被乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）等多种因素所诱导,在前期研究中我们发现肝细胞ERS明显降低细胞外HBV DNA及相关抗原水平,然而ERS对肝细胞内HBV DNA复制及其抗原合成的影响尚不清楚,另外,肝细胞ERS对抗病毒药物的影响尚无研究。本课题旨在初步探讨ERS对HBV复制及恩替卡韦（entecavir,ETV）抗病毒作用的影响。方法:以HBV稳定转染人肝癌细胞株Hep G2.2.15细胞为研究对象,用毒胡萝卜素（thapsigargin,TG）诱导细胞发生ERS,以建立ERS细胞模型。应用流式细胞术检测TG对细胞凋亡的影响。应用蛋白免疫印迹（western blot,WB）法检测葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein 78,GRP78）、磷酸化真核起始因子2α（phosphorylated eukaryotic initiation factor 2 alpha,p-e IF2α）和内质网甘露糖甙酶-Ⅰ样蛋白（ER degradation-enhancingα-mannosidase-like protein,EDEM）;实时荧光定量逆转录聚合酶连反应（real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction,q RT-PCR）检测肌醇酶1（inositol requiring enzyme-1,IRE1）、活化转录因子6（activating transcription factor 6,ATF6）、蛋白激酶R样内质网激酶（protein kinase R-like ER kinase,PERK）、GRP78 m RNA判断肝细胞ERS。通过实时荧光聚合酶链反应（real-time fluorescent polymerase chain reaction,PCR）、酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）、q RT-PCR、化学发光微粒子免疫检测法及WB检测细胞培养上清中的HBV DNA、HBs Ag、HBe Ag水平,细胞内的HBV DNA、3.5kb HBV m RNA、HBV-s m RNA及HBs Ag水平,初步探讨TG诱导的ERS对HBV复制的影响。随后用q RT-PCR检测法尼酯X受体（farnesoid X receptor,FXR）、肝细胞核因子1（hepatocyte nuclear factor 1,HNF1）、核因子κB（nuclear factor kappa B,NF-κB）等14种影响HBV复制的转录因子的m RNA水平,初筛出TG诱导的ERS影响HBV复制的转录因子;最后用ETV对TG诱导Hep G2.2.15 ERS进行干预,观察TG诱导的ERS对ETV抗病毒作用的影响。结果:1.流式细胞仪检测细胞凋亡率发现,0.5μM TG作用于Hep G2.2.15细胞24 h、48 h、72 h并未引起明显的细胞凋亡。2.0.5μM TG作用Hep G2.2.15细胞24h、48h、72h后,GRP78、PERKATF6IRE1 m RNA水平显着上调,GRP78、EDEM蛋白水平及e IF2α磷酸化水平显着增加。以上结果证实TG显着诱导Hep G2.2.15细胞发生ERS并激活内质网相关降解途径（ER-associated degradation,ERAD）。3.0.5μM TG作用Hep G2.2.15细胞24、48、72h,细胞培养上清中的HBs Ag、HBe Ag显着降低;细胞内HBV DNA、3.5kb m RNA、HBV-s m RNA及HBs Ag和HBc Ag蛋白水平显着升高。4.0.5μM TG作用Hep G2.2.15细胞48h,诱导细胞ERS,发现促进HBV复制的11种转录因子,只有FXR上调,其余均呈不同程度的下调;抑制HBV复制的转录因子NF-κB显着性下调。5.TG诱导Hep G2.2.15细胞ERS,并用10μM ETV干预4天,观察TG诱导的ERS对ETV抗病毒作用的影响。结果提示,ETV显着下调Hep G2.2.15细胞上清液中的HBV DNA、HBe Ag和HBs Ag及细胞内的HBV DNA、3.5kb m RNA、HBV-s m RNA及HBs Ag、HBc Ag蛋白;经TG诱导Hep G2.2.15细胞ERS后,ETV同样显着下调细胞内外的HBV相关指标;TG处理Hep G2.2.15细胞,经ETV干预后细胞上清液中的HBV DNA、HBe Ag和HBs Ag较未经TG处理的Hep G2.2.15细胞显着降低,然而细胞内的HBV DNA、3.5kb m RNA、HBV-s m RNA及HBs Ag、HBc Ag蛋白却较未经TG处理的Hep G2.2.15细胞显着升高。以上结果表明TG诱导的ERS抬高了HBV复制基线,延长了细胞内HBV清除所需的时间。6.TG诱导Hep G2.2.15细胞ERS,并用10μM ETV干预4天。通过抗病毒治疗后,TG处理的Hep G2.2.15细胞内的GRP78、PERK、ATF6、IRE1 m RNA显着下调,GRP78蛋白表达及e IF2α磷酸化水平也显着下调。结论:1.TG诱导的Hep G2.2.15细胞ERS引起HBV DNA、HBs Ag胞内积累与HBV复制作用加强和HBV DNA、HBs Ag分泌减少有关;2.TG诱导的Hep G2.2.15细胞ERS促进HBV复制,可能与FXR促进作用增强、NF-κB抑制作用减弱有关;3.TG诱导的Hep G2.2.15细胞ERS延长了ETV处理后细胞内HBV清除所需的时间;4.ETV抗病毒作用后可部分缓解细胞ERS。
魏杰[10]（2020）在《Id1通过E2F4实现对HBV转录和复制的抑制作用及其机制研究》文中研究说明目的:乙型肝炎病毒（HBV）是一种小病毒基因组的部分双链DNA病毒,HBV导致的慢性乙肝仍然是一个全球公共卫生问题,即使得益于乙肝疫苗和抗病毒药物的临床应用,目前全世界仍超过2亿人患有慢性乙肝,乙肝的长期发展又会导致肝硬化和肝癌的发生,对人类的身体健康造成严重威胁。Id1蛋白是分化抑制因子（Id1-4）中的一员,属于bHLH转录因子家族,由于Id1缺少了与DNA结合的碱性（basic）区,导致Id1蛋白通过与其他bHLH转录因子结合形成异源二聚体从而抑制了bHLH转录因子对下游靶基因的调控。Id1的功能主要与促进细胞增殖和抑制分化相关,许多参与调控细胞增殖的基因,同样参与HBV的表达调控,此外如E2F4转录因子也属于H（helix）超家族,已被报道与Id2存在相互作用,而该因子在HBV的复制调控中的作用还未见报道。因此本文重点研究了宿主因子Id1及相互作用的转录因子E2F4在HBV复制和转录过程中的调控作用及其分子机制,其研究结果进一步丰富宿主因子对HBV的调控网络,并有助于基于该机制研发新的抗病毒药物。方法:1,在临床样本中,运用qRT-PCR和western blot实验分析HBV相关的肝细胞肝癌中癌旁与肿瘤的HBV pgRNA的转录水平以及Id1和HBV核心蛋白的表达水平。2,在细胞水平和动物水平,同样应用western blot实验比较HBV复制阳性和HBV复制阴性的细胞以及HBV转基因小鼠和非转基因小鼠中Id1的表达水平。3,进一步应用western blot分析HBV四种蛋白（HBc/p/s/x）对Id1的影响以及研究HBV在HepG2-NTCP感染模型中对Id1的作用。4,运用Id1Ad感染HBV复制的细胞（HepG2.2.15,HepAD38和HepG2-HBV1.1）实现Id1蛋白的过表达,分别应用Southern blot实验,ELISA和western blot检测HBV DNA,HBeAg和HBc水平变化;应用qPCR检测HepG2.2.15细胞中HBV cccDNA和pgRNA的变化。5,运用pCDNA3.1-Id1转染HBV感染HepG2-NTCP模型,应用qPCR检测其中HBV DNA的变化。6,应用靶向Id1的shRNA1/2干扰序列降低HepG2.2.15和HepG2-HBV1.1细胞中的Id1水平,分别应用Southern blot实验,ELISA和western blot检测HBV DNA,HBeAg和HBc水平变化。7,通过尾静脉注射Id1Ad感染HBV-TgM,在体内小鼠过表达Id1,同样应用Southern blot和qPCR检测小鼠肝脏组织中HBV DNA的变化,应用western blot和IHC检测肝组织细胞Id1和HBc蛋白的变化,采用ELISA检小鼠血清中HBeAg的变化。8,通过qRT-PCR和western blot筛查Id1过表达对调控HBV的经典宿主因子的影响。9,通过qRT-PCR筛查HBV复制的细胞中的mRNA水平发生改变的HLH转录因子。10,构建潜在的发生变化的HLH因子的过表达质粒,通过筛查它们对HBV Cp启动子的影响,特别是E2F4发挥了对Cp启动子活性显着的促进作用。11,进一步研究比较了E2F4在HBV复制的HepG2.2.15,HepAD38和HepG2-HBV1.1细胞中以及25对临床样本中癌组织和癌旁组织的各自表达情况。12,利用E2F4Ad感染HepG2.2.15和HepG2-NTCP细胞过表达E2F4,应用qPCR检测其中HBV DNA和pgRNA的变化。13,免疫荧光试验,免疫共沉淀实验和GST-pulldown实验检测E2F4与Id1之间的相互作用。14,胞浆胞核蛋白分离联合western blot试验检测HBV复制和Id1对细胞中E2F4的核内外分布的影响。15,HepG2.2.15分别在过表达E2F4和干扰Id1以及过表达Id1和干扰E2F4之后,Southern blot检测HBV DNA的复制水平。16,ChIP实验检测Cp启动子是否招募E2F4蛋白,Id1对该招募的影响。17,应用体外EMSA实验检测Cp启动子和E2F4蛋白是否存在直接相互作用。18,根据E2F4的二级结构和识别位点规律,生物信息学进行分析E2F4在Cp启动子上存在的潜在识别位点,构建相应的启动子突变体,应用荧光素酶活性实验验证潜在位点的缺失是否导致E2F4对HBV的调控受阻。19,体外SPR实验和ITC实验检测E2F4截短蛋白和Cp启动子DNA链的相互结合作用。20,根据潜在位点构建相应的HBV1.3倍体突变体,通过ChIP实验检测突变的Cp启动子对E2F4的招募情况。21,在Huh7细胞中转染HBV1.3倍体突变体,qPCR检测该细胞分别感染E2F4Ad和Id1Ad后HBV DNA的变化,ELISA检测细胞上清中HBeAg的变化。22,生物信息学比对分析常见的四种HBV基因型（Gt A/B/C/D）中E2F4潜在识别位点的保守性,进而应用southern blot和qPCR检测E2F4和Id1对四种HBV复制调控作用的普适性。结果:1,在25对HBV相关的肝癌与癌旁组织样本中,癌旁样本的pgRNA整体表达水平大约是肝癌组织的两倍（P<0.05）,其中20对样本的HBc的蛋白水平在癌旁组织中明显高于癌组织,有18对样本的Id1的蛋白表达水平在肝癌组织中明显高于癌旁。2,在HBV稳定复制的细胞和HBV瞬时转染的细胞中Id1 mRNA和蛋白水平均明显低于非HBV复制的对照肝癌细胞。3,在HBV感染细胞模型中,HBV的感染导致Id1的蛋白水平明显减少,过表达HBV相关蛋白HBp和L-HBs同样导致Id1蛋白水平的降低,HBV转基因小鼠的肝组织中,Id1蛋白水平也显着低于普通C57小鼠。4,Id1过表达可显着抑制HBV复制细胞（HepG2.2.15,HepAD38和HepG2-HBV1.1细胞）中HBV DNA复制中间体,pgRNA和HBc的表达水平,上清中HBeAg的分泌水平（P<0.01）,此外过表达Id1也显着下调HepG2.2.15细胞中HBV cccDNA的复制水平和Cp启动子的活性（P<0.05）。5,下调Id1的表达可显着促进HBV复制细胞（HepG2.2.15和HepG2-HBV1.1细胞）中HBV DNA复制中间体和HBc的表达水平,上清中HBeAg的分泌水平（P<0.05）。6,Id1过表达可显着抑制HBV转基因小鼠肝组织中HBV DNA复制水平和HBc的表达水平,也导致血清HBeAg分泌水平的显着下降（P<0.05）。7,在HepG2.2.15细胞中,Id1过表达没有导致经典的HBV调控因子发生明显变化,但HBV的复制导致4种HLH因子mRNA（E2F4,TCF3,E40和USF1）发生显着上调和2种HLH因子（Clock和HIF1α）的显着下调。8,E2F4过表达可以显着促进HBV Cp启动子活性和上调HBV pgRNA,HBV DNA的复制。9,在HBV复制的细胞中E2F4蛋白水平明显高于对照肝癌细胞;在HBV相关的肝癌临床样本中,E2F4的整体蛋白水平在癌旁组织中明显高于癌组织（P<0.05）。10,通过IP和GST-pulldown实验表明E2F4和Id1存在相互作用,Id1的过表达减弱了HBV复制引起的p130和E2F4的核转移。11,过表达E2F4可以进一步促进干扰Id1导致HBV DNA的上调,相反过表达Id1并没有显着抑制干扰E2F4导致HBV DNA的下调。12,ChIP实验证实E2F4能被Cp启动子招募,Id1的过表达同样也阻止了Cp启动子对E2F4的招募作用。13,EMSA实验中,随着E2F4截短蛋白(E2F41-180)的增加,Cp启动子的迁移速率明显下降,并且Cp冷探针可以竞争结合E2F4截短蛋白。14,生物信息学表明E2F4在Cp上存在潜在的识别位点5’-1758TTAAAGGTC1766-3’,该位点的缺失导致E2F4对HBV Cp启动子活性的促进作用消失;在相应的HBV1.3突变体（HBV1.3 mut2.3）中,E2F4和Id1都失去了对HBV的调控作用。15,SPR和ITC实验表明包含5’-1758TTAAAGGTC1766-3’的Cp2短链可以直接与E2F4的DNA识别区域相互结合。16,进步分析发现5’-1758TTAAAGGTC1766-3’在HBV Gt A/B/C/D基因型中高度保守,并且E2F4和Id1对这四种基因型的HBV的调控具有普适性。结论:在本研究中,我们阐明了Id1及其相互作用的转录因子E2F4在HBV复制和转录中的协同调控作用。研究结果显示,无论是在HBV复制背景下的细胞水平还是组织水平中,Id1表达水平均显着下调,而E2F4表达水平则显着上调;E2F4可以通过上调HBV Cp启动子活性从而促进HBV复制和相应的转录;上游Id1分子则通过与E2F4相互作用抑制其核内转移,导致HBV的复制和转录受抑制;5’-1758TTAAAGGTC1766-3’是E2F4在Cp启动子上的直接识别位点,在HBV A/B/C/D四种基因型中高度保守,是Id1和E2F4实现对四种基因型HBV调控的基础。我们的研究进一步完善了宿主因子对HBV的调控网络,为研发新的抗病毒策略提供了新的思路。
二、包膜蛋白和核心蛋白共突变体对乙型肝炎病毒在Hep G2细胞中表达的抑制作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、包膜蛋白和核心蛋白共突变体对乙型肝炎病毒在Hep G2细胞中表达的抑制作用（论文提纲范文）
（1）HBV稳定转染后宿主细胞DNA修复系统异常表达的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 0.1 乙型肝炎病毒的研究现状 |
| 0.2 HBV感染对宿主DNA修复系统的影响 |
| 0.3 DNA损伤修复的概述 |
| 第一章 HBV稳定转染前后对宿主细胞转录组分析 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 细胞系 |
| 1.1.2 实验试剂及主要试剂的配制 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 细胞培养 |
| 1.2.2 细胞上清中乙肝标志物检测 |
| 1.2.3 细胞系RNA的提取(Trizol法) |
| 1.2.4 转录组测序的文库构建 |
| 1.2.5 库检及上机测序 |
| 1.2.6 生物信息学分析 |
| 1.2.7 DNA修复相关基因RT-qPCR验证 |
| 1.2.8 差异表达基因的Western blot检测 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 细胞上清乙肝标志物检测 |
| 1.3.2 转录组测序数据的质量控制 |
| 1.3.3 参考基因组比对 |
| 1.3.4 定量分析 |
| 1.3.5 差异分析 |
| 1.3.6 富集分析 |
| 1.3.7 部分差异基因的RT-qPCR验证分析 |
| 1.3.8 部分差异基因的Western blot验证分析 |
| 1.4 讨论 |
| 第二章 HBV稳定转染前后宿主细胞DNA同源重组修复能力的评价 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞系、质粒和菌株 |
| 2.1.2 实验试剂及主要试剂的配制 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 重组荧光素酶报告载体(pGL3 SSA)的构建 |
| 2.2.2 靶向pGL3 SSA系统的CRISPR/Cas9 系统的构建 |
| 2.2.3 靶向pGL3 SSA报告载体系统的CRISPR/Cas9 系统筛选 |
| 2.2.4 HBV稳定转染前后的细胞同源重组修复能力检测 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 重组荧光素酶报告载体(pGL3 SSA)的构建 |
| 2.3.2 靶向pGL3 SSA报告载体的CRISPR/Cas9 系统构建 |
| 2.3.3 靶向pGL3 SSA报告载体的CRISPR/Cas9 系统的筛选 |
| 2.3.4 HBV稳定转染前后的细胞同源重组修复能力检测 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 RAD52 基因与宿主DNA修复系统关系的研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 细胞系、质粒和菌株 |
| 3.1.2 实验试剂及主要试剂配制 |
| 3.1.3 gRNA和引物合成 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 gRNA和引物的设计 |
| 3.2.2 HEK293T细胞DNA的提取 |
| 3.2.3 HEK293T细胞中gRNA上下游序列的扩增及鉴定 |
| 3.2.4 靶向HEK293T细胞中RAD52 基因的CRISPR/Cas9 系统构建 |
| 3.2.5 CRISPR/Cas9 系统靶向抑制HEK293T细胞RAD52 基因 |
| 3.2.6 靶向抑制RAD52 后TA克隆验证 |
| 3.2.7 靶向抑制RAD52 后宿主DNA同源重组修复能力检测 |
| 3.2.8 靶向抑制RAD52 后宿主DNA修复相关基因的RT-qPCR检测 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 HEK293T细胞中RAD52 gRNA靶点鉴定 |
| 3.3.2 靶向抑制RAD52的CRISPR/Cas9 系统的构建 |
| 3.3.3 HEK293T细胞RAD52 抑制后TA克隆鉴定 |
| 3.3.4 靶向HEK293T细胞RAD52的CRISPR/Cas9 系统筛选 |
| 3.3.5 靶向抑制RAD52 后宿主DNA同源重组修复能力检测 |
| 3.3.6 靶向抑制RAD52 后宿主DNA修复相关基因的RT-qPCR检测 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 结论与展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 主要简历 |
| 致谢 |
（2）Na+/K+ ATPaseβ3亚基对乙型肝炎病毒抑制作用及机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 背景知识 |
| 1.1.1 乙型肝炎病毒 |
| 1.1.2 ATP1B3与BST-2 |
| 1.1.3 NF-κB信号通路 |
| 1.1.4 泛素化降解 |
| 1.2 论文设计 |
| 1.2.1 论文目的和意义 |
| 1.2.2 实验思路及方案设计 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验仪器、材料与试剂 |
| 2.1.1 主要实验仪器 |
| 2.1.2 主要试剂与材料 |
| 2.1.3 质粒与细胞系 |
| 2.1.4 引物合成及测序 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 质粒过表达载体构建 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 细胞复苏、传代与转染 |
| 2.2.4 稳转细胞系的构建 |
| 2.2.5 短干扰RNA(si RNA)的化学合成及转染 |
| 2.2.6 酶联免疫吸附测定(ELISA) |
| 2.2.7 实时荧光定量PCR(q PCR) |
| 2.2.8 Southern blot检测HBV核心颗粒DNA |
| 2.2.9 Northern blot检测HBV RNA |
| 2.2.10 核质分离 |
| 2.2.11 免疫印迹(Western Blot) |
| 2.2.12 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation) |
| 2.2.13 免疫荧光共定位 |
| 2.2.14 Luciferase双荧光报告实验 |
| 2.2.15 统计学方法 |
| 第3章 结果与讨论 |
| 3.1 ATP1B3 抑制HBV的表达 |
| 3.1.1 HepG2 细胞中外源ATP1B3 抑制HBV抗原的产量 |
| 3.1.2 HepG2 细胞中梯度过表达的外源ATP1B3使HBV抗原的产量梯度减少 |
| 3.1.3 HepG2 细胞中过表达ATP1B3对HBV抗原的产量减少不存在非特异性 |
| 3.1.4 HepG2 细胞中下调内源ATP1B3 的表达能够增加HBV抗原的分泌 |
| 3.1.5 HepG2.2.15和Hep AD38 细胞中外源ATP1B3 抑制HBV抗原的产量 |
| 3.1.6 HepG2.2.15和Hep AD38 细胞中下调内源ATP1B3 的表达增加HBV抗原的分泌 |
| 3.1.7 过表达ATP1B3 不影响HBV的 DNA和 RNA |
| 3.1.8 小结 |
| 3.2 ATP1B3 激活HepG2 细胞中的NF-κB信号通路 |
| 3.2.1 过表达ATP1B3 以剂量依赖性的方式激活NF-κB信号通路 |
| 3.2.2 过表达ATP1B3 促进磷酸化p65 向核内转移 |
| 3.2.3 ATP1B3 的敲低减弱了TAK1对NF-κB的激活 |
| 3.2.4 抑制NF-κB信号通路会削弱ATP1B3对HBV的抑制作用 |
| 3.2.5 小结 |
| 3.3 ATP1B3 通过诱导IFN-α/ISG和 IL-6 的产生抑制HBV |
| 3.3.1 过表达ATP1B3 诱导IFN-α和 IL-6 的产生 |
| 3.3.2 过表达ATP1B3 诱导ISGs表达增加 |
| 3.3.3 IFN-α诱导BST-2 的表达 |
| 3.3.4 敲低 ATP1B3使BST-2 的表达降低 |
| 3.3.5 小结 |
| 3.4 ATP1B3与BST-2 协作促进对HBs Ag的限制 |
| 3.4.1 ATP1B3 独立于BST-2 抑制HBV |
| 3.4.2 使用NF-κB抑制剂能够减弱ATP1B3 诱导的BST-2 表达 |
| 3.4.3 过表达BST-2 促进了ATP1B3对HBs Ag的抑制 |
| 3.4.4 敲低BST-2使ATP1B3对HBs Ag的抑制减弱 |
| 3.4.5 小结 |
| 3.5 ATP1B3 促进蛋白酶体依赖的细胞内HBs Ag降解 |
| 3.5.1 鉴定ATP1B3 限制HBV需要的功能区 |
| 3.5.2 ATP1B3对HBV的抑制不依赖于其Na~+/K~+ATP酶的活性 |
| 3.5.3 ATP1B3 影响HBV蛋白水平 |
| 3.5.4 ATP1B3使HBV的 S蛋白表达减少 |
| 3.5.5 ATP1B3 加速HBs的降解 |
| 3.5.6 ATP1B3 通过蛋白酶体途径降解HBs |
| 3.5.7 ATP1B3 突变体降解HBs |
| 3.5.8 小结 |
| 3.6 ATP1B3与LHBs和 MHBs在细胞中相互作用并共定位 |
| 3.6.1 ATP1B3与HBs共定位 |
| 3.6.2 ATP1B3与HBS存在相互作用 |
| 3.6.3 HBs与 ATP1B3 存在相互作用 |
| 3.6.4 小结 |
| 3.7 ATP1B3 诱导LHBs和 MHBs的多聚泛素化 |
| 3.7.1 ATP1B3 诱导HBs的多聚泛素化 |
| 3.7.2 ATP1B3 通过K48 诱导HBs的泛素化 |
| 3.7.3 ATP1B3 降解HBs需要泛素化 |
| 3.7.4 小结 |
| 3.8 讨论 |
| 第4章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）靶向HBV核心启动子转录活性的化合物筛选与鉴定（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 质粒来源 |
| 1.1.2 细胞来源 |
| 1.1.3 菌株 |
| 1.1.4 主要试剂 |
| 1.1.5 主要试剂配制 |
| 1.1.6 主要实验仪器 |
| 1.1.7 化合物库 |
| 1.1.8 引物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 质粒构建 |
| 1.2.2 克隆具体步骤 |
| 1.2.3 电击转化 |
| 1.2.4 DH5α电转感受态的制备 |
| 1.2.5 质粒小量抽提 |
| 1.2.6 质粒中量抽提 |
| 1.2.7 细胞的培养与细胞转染 |
| 1.2.8 Gaussia荧光素酶检测 |
| 1.2.9 细胞活力检测 |
| 1.2.10 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 1.2.11 Western Blot |
| 1.2.12 HBV DNA检测 |
| 1.2.13 细胞总RNA提取与逆转录 |
| 1.2.14 RT-qPCR |
| 1.2.15 HepG2-NTCP细胞感染实验 |
| 1.2.16 HepG2-Pcore-Gluc细胞模型构建 |
| 1.2.17 药物筛选流程 |
| 1.2.18 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 HepG2-Pcore-Gluc细胞模型构建 |
| 2.2 第一轮筛选结果 |
| 2.3 第二轮筛选结果 |
| 2.4 进一步评估Reversine和 SCH58261 的抗HBV活性 |
| 2.5 Reversine和 SCH58261对HBV DNA复制水平的影响 |
| 2.6 Reversine对 HBV RNA转录、乙肝表面抗原和E抗原的影响 |
| 2.7 Reversine在 HepG2-NTCP感染模型上的活性评估 |
| 2.8 Reversine在核心启动子上的作用区域的初步探索 |
| 2.9 Reversine对核受体超家族基因转录的影响 |
| 2.10 Reversine的作用特异性分析 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 HBV cccDNA 转录调控机制与抗 cccDNA 药物开发 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的学术成果及发表的学术论文 |
（4）基于GRP78的新型抗HBV抑制剂的研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 |
| 前言 |
| 第一节 抑制剂筛选靶点GRP78 的确定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二节 以GRP78 为靶点的抑制剂筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三节 最佳小肽GBP-68 抗病毒机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 基于免疫捕获的新型HBV分子检测方法 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 HBV血清学标志物研究进展 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的学术成果及发表的学术论文 |
（5）SIRT1在乙型肝炎病毒蛋白X（HBx）促进肝细胞癌发生发展中的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 SIRT1 对乙肝相关性肝癌转移的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 SIRT1在乙肝相关性肝癌中的表达水平 |
| 2.2 SIRT1对乙肝相关性肝癌转移的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 HBV/HBx对SIRT1表达的调控作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 HBV对SIRT1表达的调控作用 |
| 2.2 HBx对SIRT1表达的调控作用 |
| 2.3 SIRT1对HBx表达的调控作用 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 SIRT1对HBx诱导的肝细胞癌增殖、迁移和侵袭的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 过表达SIRT1对HBx诱导的肝细胞癌增殖、迁移和侵袭的影响 |
| 2.2 沉默SIRT1对HBx诱导的肝细胞癌增殖、迁移和侵袭的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 SIRT1抑制剂烟酰胺的抗肿瘤效应 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 烟酰胺的细胞毒性检测 |
| 2.2 烟酰胺对HBx诱导的肝细胞癌增殖的影响 |
| 2.3 烟酰胺对HBx诱导的肝细胞癌迁移的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 HBx在肝细胞癌转移侵袭中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表的论文 |
（6）SAMHD1蛋白的O-GlcNAc修饰抑制HBV复制的机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 HBV感染促进己糖胺生物合成途径 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 O-GlcNAc修饰对HBV复制的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 SAMHD1蛋白O-GlcNAc修饰增强其抑制HBV的作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第四部分 体内实验验证HBV感染后促进SAMHD1蛋白O-GlcNAc修饰 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 O-GlcNAc修饰与病毒感染免疫 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 攻读学位期间发表的学术论文,申请课题,参加会议及获奖情况 |
（7）半乳糖凝集素-3结合蛋白作为正向调节因子参与IFN-γ介导的抗HBV作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 HBV概述 |
| 1.1.1 HBV结构与形态 |
| 1.1.2 HBV的生活周期 |
| 1.1.3 抗HBV的药物研究进展 |
| 1.2 IFN-γ概述 |
| 1.2.1 干扰素家族 |
| 1.2.2 IFN-γ |
| 1.2.3 IFN-γ与HBV |
| 1.3 LGALS3BP概述 |
| 1.4 本研究的目的及意义 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验细胞及质粒 |
| 2.1.2 实验试剂及耗材 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 实验主要试剂的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 质粒的构建与鉴定 |
| 2.2.2 细胞培养及冻存 |
| 2.2.3 细胞转染及干扰素处理 |
| 2.2.4 细胞内总RNA的提取及反转录实验 |
| 2.2.5 细胞内DNA的检测 |
| 2.2.6 荧光定量PCR |
| 2.2.7 ELISA检测HBs Ag及 HBe Ag水平 |
| 2.2.8 蛋白质定量试剂盒(BCA法,Bicinchoninine acid assay) |
| 2.2.9 Western Blot |
| 2.2.10 统计学结果分析 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 IFN-γ对细胞内源性LGALS3BP的影响 |
| 3.1.1 IFN-γ对Hep G2和Hep G2.215 细胞的细胞毒性测试 |
| 3.1.2 IFN-γ对Hep G2 细胞系中内源性LGALS3BP表达的影响 |
| 3.2 IFN-γ对HBV的抑制作用 |
| 3.2.1 IFN-γ对HBV的 HBs Ag和 HBe Ag水平的影响 |
| 3.2.2 IFN-γ对HBV的 DNA复制和转录水平的影响 |
| 3.3 真核表达质粒的构建和验证 |
| 3.3.1 过表达质粒的构建 |
| 3.3.2 干扰质粒p Super-sh-LG的构建 |
| 3.3.3 过表达质粒和干扰质粒在细胞中验证 |
| 3.3.4 LGALS3BP对 Hep G2 肝癌细胞系的增殖的影响 |
| 3.4 LGALS3BP表达水平的增加能增强IFN-γ对HBV的抑制作用 |
| 3.4.1 用IFN-γ处理时,LGALS3BP表达水平降低对HBs Ag和HBeAg表达的影响 |
| 3.4.2 用IFN-γ处理时,LGALS3BP表达水平降低对HBV DNA复制和转录的影响 |
| 3.5 LGALS3BP表达水平的降低能削弱IFN-γ对HBV的抑制作用 |
| 3.5.1 用IFN-γ处理时,LGALS3BP表达水平降低对HBs Ag和HBeAg表达的影响 |
| 3.5.2 用IFN-γ处理时,LGALS3BP表达水平降低对HBV DNA复制和转录的影响 |
| 第4章 总结与讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 附录 |
（8）宿主限制性因子SERINC5对乙型肝炎病毒的抑制作用及机制的研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要英文缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 背景知识 |
| 1.1.1 乙型肝炎病毒 |
| 1.1.2 乙型肝炎病毒包膜蛋白 |
| 1.1.3 宿主限制性因子概述 |
| 1.1.4 SERINC家族介绍及SERINC5 抗病毒作用 |
| 1.2 论文设计 |
| 1.2.1 论文目的和意义 |
| 1.2.2 实验设计 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料、试剂与仪器 |
| 2.1.1 菌株及培养基 |
| 2.1.2 质粒构建与载体信息 |
| 2.1.3 细胞系 |
| 2.1.4 抗体与siRNA |
| 2.1.5 实验试剂 |
| 2.1.6 主要实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 聚合酶链式反应(PCR) |
| 2.2.2 DNA的纯化回收 |
| 2.2.3 连接反应及感受态细胞的转化 |
| 2.2.4 质粒提取 |
| 2.2.5 细胞培养 |
| 2.2.6 细胞转染 |
| 2.2.7 HBV病毒的制备及病毒感染 |
| 2.2.8 酶联免疫吸附测定(ELISA) |
| 2.2.9 HBV核心颗粒DNA(Core particle DNA)的提取 |
| 2.2.10 RNA提取 |
| 2.2.11 Southern blot检测HBV核心颗粒DNA |
| 2.2.12 Northern blot检测HBV RNA |
| 2.2.13 细胞上清中HBV完整病毒粒子纯化及DNA提取 |
| 2.2.14 实时定量PCR |
| 2.2.15 Western blot及显色 |
| 2.2.16 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation) |
| 2.2.17 免疫荧光共定位 |
| 2.2.18 统计学方法 |
| 第3章 结果与讨论 |
| 3.1 SERINC5 抑制HBV的分泌 |
| 3.1.1 SERINC5 降低HBV分泌到上清中的HBsAg水平 |
| 3.1.2 SERINC5 抑制HBV完整病毒粒子的分泌 |
| 3.1.3 下调SERINC5 的表达, HBV完整病毒粒子及HBsAg的分泌增加 |
| 3.1.4 HepG2.2.15 细胞中,SERINC5 抑制HBV完整病毒粒子及HBsAg的分泌 |
| 3.1.5 HepG2-NTCP细胞中SERINC5 抑制HBV完整病毒粒子及HBsAg的分泌 |
| 3.1.6 小结 |
| 3.2 SERINC5 影响HBV包膜蛋白糖基化修饰 |
| 3.2.1 SERINC5 对HBx、Core蛋白表达无影响 |
| 3.2.2 SERINC5 影响HBV包膜蛋白糖基化修饰 |
| 3.2.3 SERINC5 不会通过泛素蛋白酶体途径或自噬溶酶体途径影响HBV包膜蛋白表达量和糖基化修饰 |
| 3.2.4 SERINC5 不影响HIV-1 包膜蛋白Env糖基化修饰 |
| 3.2.5 SERINC1 不影响HBV包膜蛋白糖基化修饰 |
| 3.2.6 小结 |
| 3.3 SERINC5 通过影响HBV包膜蛋白糖基化修饰抑制HBV病毒粒子分泌 |
| 3.3.1 SERINC5 对HBV包膜蛋白糖基化修饰的影响与包膜蛋白糖基化位点突变体相似 |
| 3.3.2 SERINC5 对HBV包膜蛋白糖基化修饰的影响与衣霉素对包膜蛋白糖基化的抑制作用相似 |
| 3.3.3 确认SERINC5 通过影响HBV包膜蛋白的糖基化修饰,抑制HBV病毒粒子分泌 |
| 3.3.4 小结 |
| 3.4 SERINC5 与LHBS在细胞高尔基体共定位,并能与LHBS, MHBS和SHBS结合 |
| 3.4.1 SERINC5 与LHBs在细胞高尔基体共定位 |
| 3.4.2 SERINC5 能够分别与LHBs, MHBs和SHBs在细胞内结合 |
| 3.4.3 小结 |
| 3.5 SERINC5 抑制HBV功能区的鉴定 |
| 3.5.1 SERINC5 截短突变体对HBV分泌的抑制 |
| 3.5.2 SERINC5 截短突变体对LHBs及MHBs蛋白糖基化修饰的影响 |
| 3.5.3 SERINC5 磷酸化修饰对其抑制HBV功能的影响 |
| 3.5.4 SERINC5 糖基化修饰对其抑制HBV功能的影响 |
| 3.5.5 小结 |
| 3.6 讨论 |
| 第4章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（9）肝细胞内质网应激对HBV复制及恩替卡韦抗病毒作用的影响（论文提纲范文）
| 中英缩略词对照表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（10）Id1通过E2F4实现对HBV转录和复制的抑制作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一章 Id1在HBV表达的环境中发生下调 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 比较HBV相关的肝癌组织和癌旁组织中pgRNA的表达水平 |
| 2.2 比较HBV相关的肝癌组织和癌旁组织中Id1和HBc的蛋白表达水平 |
| 2.3 HBV复制在细胞水平对Id1表达水平的影响 |
| 2.4 比较HBV转基因小鼠和普通C57 小鼠中Id1 蛋白表达水平 |
| 2.5 HBV感染HepG2-NTCP对 Id1 表达水平的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 Id1通过抑制核心启动子的活性下调HBV转录和复制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 过表达Id1对HBV复制水平的影响 |
| 2.2 过表达Id1对HBV转录水平的影响 |
| 2.3 过表达Id1对HepG2-NTCP模型中HBV复制水平的影响 |
| 2.4 过表达Id1对HBV4个启动子活性的影响 |
| 2.5 沉默Id1对HBV复制水平的影响 |
| 2.6 沉默Id1对HBV转录水平的影响 |
| 2.7 过表达Id1对HBV转基因小鼠HBV复制和转录水平的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 E2F4通过激活核心启动子的活性上调HBV转录和复制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 过表达Id1筛查对HBV转录调控的转录因子的影响 |
| 2.2 HepG2 转染HBV1.1 倍体分析HLH转录因子表达变化 |
| 2.3 过表达E2F4激活HBV核心启动子活性 |
| 2.4 过表达E2F4促进HBV的转录和复制 |
| 2.5 比较HBV相关的肝癌组织和癌旁组织中E2F4的蛋白表达水平 |
| 2.6 沉默E2F4对HBV转基因小鼠HBV复制和转录水平的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 Id1 通过结合E2F4 并阻断其对HBV核心启动子的激活 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 Id1抑制E2F4的核转移 |
| 2.2 Id1和E2F4的相互作用 |
| 2.3 E2F4介导Id1对HBV抑制作用 |
| 2.4 E2F4通过识别核心启动子促进HBV的转录和复制 |
| 2.5 Id1阻断核心启动子对E2F4的招募 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 E2F4 通过识别结合Cp启动子上5'-1758TTAAAGGTC1766-3'位点对HBV表达调控中的实现促进作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 筛选E2F4在Cp启动子上的识别位点 |
| 2.2 5 '-1758TTAAAGGTC1766-3'是E2F4和Cp的相互作用的基础 |
| 2.3 5 '-1758TTAAAGGTC1766-3'的突变体导致E2F4和Id1 失去对HBV调控作用 |
| 2.4 5 '-1758TTAAAGGTC1766-3'的保守性是E2F4和Id1对A-D基因型HBV发挥调控作用的基础 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间撰写和发表的文章 |
四、包膜蛋白和核心蛋白共突变体对乙型肝炎病毒在Hep G2细胞中表达的抑制作用（论文参考文献）
- [1]HBV稳定转染后宿主细胞DNA修复系统异常表达的研究[D]. 张孝璐. 军事科学院, 2021
- [2]Na+/K+ ATPaseβ3亚基对乙型肝炎病毒抑制作用及机制的研究[D]. 张君. 吉林大学, 2021(01)
- [3]靶向HBV核心启动子转录活性的化合物筛选与鉴定[D]. 孙瑜雪. 重庆医科大学, 2021(01)
- [4]基于GRP78的新型抗HBV抑制剂的研究[D]. 刘俊叶. 重庆医科大学, 2021(01)
- [5]SIRT1在乙型肝炎病毒蛋白X（HBx）促进肝细胞癌发生发展中的作用及其机制研究[D]. 王晴. 重庆医科大学, 2021(01)
- [6]SAMHD1蛋白的O-GlcNAc修饰抑制HBV复制的机制研究[D]. 胡杰. 重庆医科大学, 2021(01)
- [7]半乳糖凝集素-3结合蛋白作为正向调节因子参与IFN-γ介导的抗HBV作用[D]. 孟诗敏. 湖北工业大学, 2020(04)
- [8]宿主限制性因子SERINC5对乙型肝炎病毒的抑制作用及机制的研究[D]. 刘悦. 吉林大学, 2020(01)
- [9]肝细胞内质网应激对HBV复制及恩替卡韦抗病毒作用的影响[D]. 陈欢. 遵义医科大学, 2020(12)
- [10]Id1通过E2F4实现对HBV转录和复制的抑制作用及其机制研究[D]. 魏杰. 重庆医科大学, 2020(01)