一、主要病原念珠菌蛋白酶分泌水平的比较（论文文献综述）
陈小荣[1]（2021）在《去泛素化酶OTUD1在抗真菌免疫反应中的功能与作用机制研究》文中指出固有免疫是机体抵抗病原体侵袭感染的第一道防线,其激活依赖于细胞中众多的模式识别受体（pattern recongnitionreceptors,PRRs）对病原体病原相关分子模式（pathogen associated molecular patterns,PAMPs）的识别。C 型凝集素（C-type lectin receptors,CLRs）可通过识别真菌表面的病原相关分子模式,进而激活一系列的信号通路,诱导炎性细胞因子的产生,最终清除真菌。CARD9是CLRs介导抗真菌免疫反应中重要的接头蛋白,通过招募BCL10和MALT1完成CBM复合体的组装,进而激活NF-κB和MAPK信号通路,诱导炎性细胞因子的表达。有文献报道称泛素化可以调控CARD9的活性,蛋白质的去泛素化是泛素化的可逆反应,底物蛋白的泛素链可通过去泛素化酶（Deubiquitinating enzymes,DUBs）的作用被水解。DUBs 是否参与调控 CARD9 的活性,目前报道较少。我们通过筛选OTU家族成员发现去泛素化酶OTUD1是CARD9的重要调节蛋白。OTUD1可以直接与CARD9结合并去除其泛素链,促进CBM复合体的形成,继而引发核转录因子NF-κB的入核与MAPK信号通路的激活。OTUD1缺失会损伤真菌刺激后CARD9介导的信号通路以及炎性细胞因子的产生。进一步研究发现,OTUD1主要通过去除CARD9赖氨酸上的K33位泛素链,进而促进CBM复合物的形成。更重要的是,在体内实验中Otud1缺陷小鼠比野生型对照小鼠对真菌感染更易感。综上所述,本课题研究阐明了去泛素化酶OTUD1通过对CARD9的去泛素化调控,进而促进CARD9介导的信号通路的活化及抗真菌天然免疫反应。该研究丰富了 CARD9的活性调节机制,并对抗真菌信号通路的激活提供了新的分子机制,有助于真菌疾病新治疗策略的发展。研究目的1.筛选对CARD9有去泛素化作用的去泛素化酶（Deubiquitinating enzymes,DUBs）;2.明确该DUB在调控抗真菌天然免疫反应中的作用与机制;3.通过敲基因小鼠动物模型明确该DUB调控抗真菌天然免疫的生理意义。研究方法1.筛选并确定调控CARD9泛素化的DUBs1.1.外源过表达实验筛选对CARD9有去泛素化作用的DUB将V5标签的CARD9,HA标签的ubiquitin（Ub）与Flag或者Myc标签的DUBs质粒一起转染到HEK293T细胞中,使用免疫沉淀（Immunoprecipitation,IP）和蛋白印迹（western blot,WB）筛选出对CARD9有去泛素化作用的DUBs。1.2.外源过表达实验明确OTUD1对CARD9的去泛素化作用将Myc标签的CARD9,HA标签的ubiquitin与梯度浓度Flag标签的OTUD1或者OTUD1的酶活突变体C320A质粒一起转染到HEK293T细胞中,通过IP与WB检测CARD9的泛素化水平。1.3.体外实验明确OTUD1对CARD9的去泛素化作用将纯化的泛素化修饰的CARD9蛋白与OTUD1或者OTUD1的酶活突变体C320A纯化蛋白在体外去泛素化反应体系中混合孵育,WB检测体外系统中CARD9的泛素化水平。1.4.细胞实验明确内源OTUD1特异性地对CARD9发挥去泛素化作用诱导Otud1缺陷与同窝野生型对照小鼠的骨髓来源的巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages,BMDMs）,给予加热致死的酵母态的白色念珠菌（heat-killed C.albicans yeast,HKCA-Y）刺激 20min。通过 IP 和 WB 检测内源CARD9或BCL10的泛素化水平。2.明确OTUD1与CARD9的相互作用及其相互作用的结构域2.1.外源过表达实验明确OTUD1与CARD9的相互作用将Myc标签的CARD9表达质粒分别与Flag-OTUD1或酶活突变体C320A表达质粒一起转染到HEK293T细胞,通过IP和WB检测OTUD1与CARD9的相互作用。2.2.体外实验明确OTUD1与CARD9直接的相互作用将纯化蛋白Flag-OTUD1与Flag-CARD9在体外结合反应体系中混合孵育,使用IP和WB检测二者的相互作用。2.3.细胞实验明确内源OTUD1与CARD9的相互作用诱导Otud1缺陷与同窝野生型对照小鼠的BMDMs,给予HKCA-Y刺激不同时间点。使用IP和WB检测内源OTUD1与CARD9的相互作用。2.4.寻找OTUD1与CARD9相互结合的作用区域将 Flag-OTUDl 表达质粒分别与 Myc-CARD9、Myc-CARD9（6-98）、Myc-CARD9（117-420）、Myc-CARD9（420-536）表达质粒一起转染到 HEK293T 细胞,通过IP和WB检测结合情况;将Myc标签的CARD9表达质粒分别与Flag-OTUD1、Flag-OTUD1（1-185）、Flag-OTUD1（1-308）、Flag-OTUD1（1-450）、Flag-OTUD1（156-481）表达质粒一起转染到HEK293T细胞,通过IP和WB检测结合情况。3.检测OTUD1对抗真菌免疫反应的调控3.1.利用CRISPR-cas9系统构建Otud1敲除细胞系首先利用亚克隆技术构建plenti-CRISPRv2-Otud1-sgRNA质粒,连同psPAX2和VSVG质粒共同转染至HEK293T细胞中包装慢病毒。将包装好的慢病毒感染RAW264.7细胞,并加入嘌呤霉素进行单克隆细胞的筛选,测序确定Otud1-KO RAW264.7细胞株,WB验证敲除效率。3.2.检测OTUD1对CLRs诱导的细胞因子产生的调控利用Otud1-KO与对照RAW264.7细胞,分别用Dectin-1的配体Zymd或Dectin-2的配体α-mannan刺激指定时间点,提取细胞的mRNA,RT-PCR检测IL-6,TNF-α和IL-1β的mRNA的表达水平。诱导Otud1缺陷与野生型同窝对照小鼠的BMDMs,分别用Zymd或α-mannan刺激指定时间点,收取细胞的上清,ELISA检测分泌在细胞上清中的促炎性细胞因子IL-6,TNF-α,IL-1β和IL-12以及趋化性细胞因子CXCL1和CXCL2的水平;提取细胞的 mRNA,RT-PCR 检测 IL-6,TNF-α,IL-1β,IL-12p35,IL-12p40和IL23p19的mRNA的表达水平。此外,分别用Dectin-1的配体HKCA-Y、Dectin-2的配体 HKCA-H（heat-killed C.albicans hyphae,HKCA-H）或 Mincle 的配体 TDB重复该实验,ELISA检测分泌在细胞上清中的IL-6和TNF-α的水平;提取细胞的mRNA,RT-PCR检测IL-6和TNF-α的mRNA的表达水平。诱导Otud1缺陷与野生型同窝对照小鼠的BMDCs,分别用Zymd或α-mannan刺激指定时间点,收取细胞的上清,ELISA检测分泌在细胞上清中的IL-6,TNF-α,IL-1β,IL-12,CXCL1 和 CXCL2 的水平;提取细胞的 mRNA,RT-PCR 检测 IL-6,TNF-α,IL-1β,IL-12p35,IL-12p40 和 IL23p19 的 mRNA 的表达水平。诱导Otud1缺陷与野生型同窝对照小鼠的BMDMs,并用慢病毒回补mOTUD1及酶活突变形式mOTUD1 C293A,用Zymd刺激24h,ELISA检测分泌在细胞上清中的IL-6和TNF-α的水平。3.3.检测OTUD1对CLRs信号通路的调控诱导Otudl缺陷与野生型同窝对照小鼠的BMDMs,用Zymd或α-mannan刺激指定时间点,提取细胞蛋白,WB检测上游信号通路中重要接头蛋白（Syk、PLC-γ2、PKC-δ）以及下游NF-κB和MAPK信号通路中相关蛋白（IκBα、p65、Jnk、Erk、p38）的磷酸化水平;诱导Otud1缺陷与野生型同窝对照小鼠的BMDMs,用HKCA-Y或Calbicans刺激指定时间点,提取细胞蛋白,WB明确下游NF-κB和MAPK通路中相关蛋白（IκBκ、p65、Jnk、Erk、p38）的磷酸化水平。3.4.检测OTUD1对真菌吞噬的影响诱导Otud1缺陷与野生型同窝对照小鼠的BMDMs与BMDCs,用FITC标记的HKCA-Y刺激指定时间点,利用流式细胞仪分析真菌吞噬率。4.OTUD1在抗真菌免疫反应中的作用机制4.1.检测OTUD1对CBM复合体形成的调控将Myc标签的CARD9表达质粒、Flag标签的BCL10表达质粒、HA标签的Ub表达质粒、Flag标签的OTUD1或其酶活突变体C320A表达质粒一起转染至HEK293T细胞中,36h后提取细胞蛋白,使用anti-Myc Ab进行IP,WB检测CARD9与BCL10的相互作用。诱导Otud1缺陷与野生型同窝对照小鼠的BMDMs,HKCA-Y刺激不同时间点,提取细胞蛋白,用anti-CARD9 Ab抗体进行IP,WB检测内源CARD9与BCL10的相互作用。4.2.检测OTUD1对CARD9调控的去泛素化类型将Myc标签的CARD9表达质粒,Flag-OTUD1表达质粒以及HA标签的ubiquitin（Ub）表达质粒或不同赖氨酸残基突变的Ub（K6、K11、K27、K29、K33、K48或K63）表达质粒一起转染到HEK293T细胞,通过IP和WB检测CARD9的泛素化水平。4.3.检测OTUD1对CARD9何种形式的去泛素化调控影响CBM复合体的形成将Myc标签的CARD9表达质粒、Flag标签的BCL10表达质粒、HA标签的不同赖氨酸残基突变的Ub（K6、K11、K27、K29、K33、K48或K63）表达质粒、Flag标签的OTUD1或其酶活突变体C320A表达质粒一起转染至HEK293T细胞中,通过IP和WB检测CARD9与BCL10的相互作用。4.4.明确内源OTUD1对CARD9蛋白稳定性与K27位泛素化的调控诱导Otud1缺陷与野生型同窝对照小鼠的BMDMs,分别用Zymd或α-mannan刺激指定时间点,提取细胞蛋白,WB检测内源CARD9的蛋白水平。诱导Otud1缺陷与野生型同窝对照小鼠的BMDMs,给予HKCA-Y刺激20min。通过IP和WB检测内源CARD9 K27位泛素化水平。5.检测OTUD1在C.albicans诱导的真菌模型中的功能取Otud1缺陷与野生型同窝对照小鼠（雄鼠,8周龄,各9只）,尾静脉注射C.albicans S5314（2×105真菌细胞量/小鼠）,每天监测小鼠体重与存活数;取感染小鼠的肾脏进行H&E染色、PAS染色及Ly-6G染色（中性粒细胞的marker）并进行组织评分展示肾脏炎症反应、真菌菌丝的生长及中性粒细胞浸润程度;取感染5天小鼠的肾脏、肝脏和脾脏,组织研磨后梯度涂板,统计各脏器的真菌滴度;取感染24h小鼠的血清,ELISA检测分泌在血清中的IL-6和TNF-α的水平。实验结果与结论1.OTUD1调控CARD9的去泛素化1.1.外源过表达实验筛选出OTUD1调控CARD9的去泛素化在 HEK293T 细胞中过表达 V5-CARD9、HA-ubiquitin 及 OTU 家族的 DUBs质粒,筛选出对CARD9有去泛素化作用的DUB:OTUD1。1.2.OTUD1依赖其去泛素化酶活性调控CARD9的去泛素化为明确OTUD1对CARD9的去泛素化调控是否依赖OTUD1的去泛素化酶活性,在HEK293T细胞中过表达V5-CARD9、HA-ubiquitin、梯度浓度的Flag-OTUD1或其酶活突变体Flag-OTUDl C320A。结果显示OTUD1可以去泛素化CARD9,并随着转染量的增加对CARD9的去泛素化作用增强,而酶活突变体OTUD1 C320A对CARD9没有去泛素化作用。该结果表明OTUD1依赖其去泛素化酶活性调控CARD9的去泛素化。1.3.OTUD1能够直接去泛素化CARD9为探究OTUD1是否直接去泛素化CARD9,在体外去泛素化体系中将已泛素化的纯化蛋白CARD9与纯化蛋白OTUD1或OTUD1 C320A共孵育,检测CARD9的泛素化水平。结果显示OTUD1可去泛素化CARD9而OTUD1 C320A对CARD9没有去泛素化作用,表明OTUD1可通过其去泛素化酶活性直接调控CARD9的去泛素化。1.4.OTUD1特异性调控CARD9的去泛素化为探究生理条件下OTUD1是否特异性调控CARD9的去泛素化,诱导Otud1缺陷与同窝野生型对照小鼠的BMDMs,HKCA-Y刺激20min,收取蛋白检测内源CARD9和BCL10的泛素化水平,结果表明Otud1缺陷小鼠的BMDMs中CARD9的泛素化水平显着高于对照组,而内源BCL10的泛素化水平没有影响,提示生理条件下内源OTUD1特异性调控CARD9的去泛素化。2.OTUD1通过与CARD9的相互作用调控CARD9去泛素化2.1.OTUD1与CARD9相互作用为探究OTUD1是否通过与CARD9的相互作用对其进行去泛素化的,在HEK293T细胞中一起转染Myc-CARD9与Flag-OTUD1质粒,发现外源过表达的Myc-CARD9与Flag-OTUD1具有相互作用。2.2.OTUD1与CARD9直接结合为进一步探究二者是否为直接结合,利用Flag-CARD9与Flag-OTUD1纯化蛋白进行免疫共沉淀实验（co-immunoprecipitation,Co-IP）,结果提示OTUD1与CARD9为直接结合作用。2.3.内源OTUD1与CARD9相互作用诱导小鼠BMDMs加入HKCA-Y刺激进行内源结合实验,结果显示内源OTUD1与CARD9相互结合,且随着刺激时间增加,结合程度明显增强。2.4.OTUD1通过OTU和UIM结构域与CARD9的CCD结构域结合为进一步明确二者的结合区域,在HEK293T细胞中过表达CARD9与OTUD1的截断突变体质粒,Co-IP实验结果显示OTUD1通过OTU和UIM结构域与CARD9的CCD结构域结合。3.OTUD1正向调控抗真菌免疫反应3.1.OTUD1正调天然免疫细胞中CLRs诱导的细胞因子的产生为探究OTUD1是否参与抗真菌免疫反应,首先利用敲除Otud1的克隆株,分别用Zymd和α-mannan刺激不同时间点,结果显示Otud1-KO细胞中的IL-6,TNF-α和IL-1β mRNA的表达水平显着低于对照组。诱导Otud1缺陷与野生型同窝对照小鼠的BMDMs,分别用Zymd和α-mannan刺激时,Otud1缺陷小鼠 BMDMs 中 IL-6,TNF-α,IL-1β,IL-12p35,IL-12p40和IL23p19 mRNA的表达水平、细胞上清中促炎性细胞因子IL-6,TNF-α,IL-1β和IL-12以及趋化性细胞因子CXCL1和CXCL2的分泌水平均显着低于对照组;分别用Dectin-1的配体HKCA-Y、Dectin-2的配体HKCA-H或Mincle的配体TDB刺激Otud1缺陷与对照小鼠的BMDMs,结果显示,Otud1缺陷小鼠BMDMs中IL-6和TNF-α mRNA的表达水平以及细胞上清中IL-6和TNF-α的分泌量均显着低于对照组。诱导Otud1缺陷与野生型同窝对照小鼠的BMDCs,分别用Zymd和α-mannan刺激时,Otud1缺陷小鼠 BMDCs 中 IL-6,TNF-α,IL-1β,IL-12p35,IL-12p40和IL23p19 mRNA的表达水平、细胞上清中促炎性细胞因子IL-6,TNF-α,IL-1β和IL-12以及趋化性细胞因子CXCL1和CXCL2的分泌水平均显着低于对照组。利用慢病毒感染在Otud1缺陷小鼠BMDMs中回补mOTUD1 WT或mOTUD1 C293A,再给予Zymd刺激,结果显示缺陷组回补野生型mOTUD1后,细胞上清中IL-6和TNF-α的分泌回升,但回补酶活突变型mOTUD1 C293A后IL-6和TNF-α的分泌无明显回升。以上结果表明,OTUD1可正向调控细胞中CLRs诱导的细胞因子的产生。3.2.OTUD1正调CLRs诱导的NF-κB与MAPK信号通路的激活为进一步探究OTUD1在抗真菌免疫反应中的作用,检测了真菌刺激后CLRs信号通路的活化。诱导Otud1缺陷与对照小鼠的BMDMs,用Zymd或α-mannan刺激时,Otud1缺陷BMDMs中CARD9上游的Syk、PLC-γ2和PKC-δ的磷酸化无明显变化,提示OTUD1不影响受体近端信号传导;而下游NF-κB和MAPK信号通路中相关蛋白IκBα、p65、Jnk、Erk、p38的磷酸化均显着降低,提示OTUD1正调CLRs诱导的NF-κB与MAPK信号通路的激活。3.3.OTUD1不影响真菌吞噬固有免疫细胞吞噬真菌进而杀伤真菌在抗真菌天然免疫反应中发挥重要作用,我们检测了 OTUD1缺失对巨噬细胞吞噬真菌的影响,结果显示OTUD1缺失不影响巨噬细胞吞噬真菌。4.明确OTUD1在抗真菌免疫反应中的作用机制4.1.OTUD1通过去泛素化CARD9促进CBM信号复合体的形成CBM复合体的组装在抗真菌免疫反应中发挥着至关重要的作用,因此我们探究了 OTUD1对CARD9的泛素化调控是否影响CBM复合体的组装。在HEK293T细胞中过表达Myc-CARD9,Flag-BCL 10,HA-Ub并同时过表达Flag-OTUD1或酶活突变体C320A,结果显示过表达HA-Ub后（CARD9的泛素化增强）CARD9与BCL10的结合减弱,但加入OTUD1后恢复了二者的结合,而加入OTUD1酶活突变体C320A的组没有恢复二者的结合;接下来,我们利用诱导的Otud1缺陷与对照小鼠的BMDMs进一步明确了在生理条件下OTUD1对CBM信号复合体形成的影响。结果显示,HKCA-Y刺激后显着增强了 CARD9与BCL10的结合,但OTUD1缺失明显减弱了二者的结合。综上这些结果表明OTUD1通过去泛素化CARD9促进了 CBM复合体的组装。4.2.OTUD1主要切割CARD9 K29、K33和K63位连接的泛素链为探究OTUD1调控CARD9的去泛素化形式,我们在HEK293T细胞中一起转染Myc-CARD9、HA-Ub或其赖氨酸突变体以及OTUD1-Flag或酶活突变体OTUD1-Flag C320A质粒,Co-IP结果显示CARD9可被多种泛素链修饰,但OTUD1只降低了 WT组、K29组、K33组和K63组中的CARD9的泛素化水平,该结果表明OTUD1主要调控CARD9 K29、K33和K63位的泛素化。4.3.OTUD1通过切割CARD9 K33泛素链促进CBM信号复合体的形成前期结果明确了 OTUD1通过调控CARD9去泛素化促进CBM复合体的组装并发现OTUD1主要切割CARD9 K29、K33和K63的泛素链,因此接下来继续探究了 OTUD1对CARD9的哪种形式的去泛素介导CBM复合体的组装,我们还发现除WT组外,K33连接的泛素链也会减弱CARD9与BCL10的结合,并且加入OTUD1后恢复了 CARD9对BCL10的招募,而被OTUD1切割的K29和K63连接的多泛素链以及不被OTUD1切割的其他泛素链（K6,K11,K27和K48）对CARD9-BCL10的相互作用没有影响。4.4.OTUD1不影响CARD9的蛋白稳定性与K27位连接的泛素链为探究OTUD1是否参与CARD9的降解过程,在Otud1缺陷与对照小鼠的BMDMs中分别用Zymd和α-mannan刺激,WB检测内源CARD9的蛋白水平。结果显示,刺激后CARD9的蛋白水平无显着变化,并且与对照组相比,Otud1缺陷组的CARD9的蛋白水平也无明显差异。该结果提示OTUD1不影响CARD9的蛋白稳定性。接下来,我们在诱导的Otud1缺陷与对照小鼠的BMDMs中进一步明确了OTUD1对CARD9 K27泛素化的调控。结果显示,与对照组相比,Otud1缺陷组内源CARD9 K27位泛素化水平无明显差异,提示OTUD1并不影响CARD9 K27位的泛素化水平。5.OTUD1在C.albicans诱导的真菌模型中具有保护作用为探究OTUD1是否介导体内的抗真菌免疫反应,我们利用Otud1缺陷小鼠与对照小鼠构建了白色念珠菌C.albicans诱导的真菌模型。结果显示,与野生型对照小鼠相比,Otud1缺陷小鼠体重下降更快、死亡率更高;组织病理结果显示Otud1缺陷小鼠肾脏炎症反应更严重、菌丝态的白色念珠菌更多、中性粒细胞的浸润也更显着;此外,Otud1缺陷小鼠肾脏、肝脏和脾脏中真菌载量更高、小鼠血清中细胞因子IL-6和TNF-α的分泌量更少。以上结果提示OTUD1是调节体内抗真菌免疫反应的保护性调节因子。创新性1.目前对CARD9的去泛素化研究较少,并且尚未发现CARD9的去泛素化调控CBM复合体的组装,我们首次发现去泛素化酶OTUD1通过切割CARD9 K33泛素链调控CARD9对BCL10的招募,为CARD9的功能探究提供了新的方向。2.已有文献报道OTUD1与抑制肿瘤发展、介导RNA病毒逃逸等相关,但尚未探究其在抗真菌天然免疫反应中的功能,我们证实OTUD1在天然抗真菌信号通路中发挥正向调控作用,增强细胞与机体抗真菌的能力。3.真菌感染已成为世界面临的重大公共卫生问题,尤其是对免疫低下的人群具有极高的发病率与死亡率,严重危害人类身心健康。本研究发现OTUD1可通过调控CARD9介导炎性细胞因子的产生发挥抗真菌功能。这一发现,可以为临床治疗真菌感染性疾病提供新的思路与治疗靶点。
孟亚民[2]（2021）在《三个新MAPK调控通路控制罗伯茨绿僵菌穿透昆虫体壁或孢子发育的研究》文中研究表明近年来,化学杀虫剂滥用导致的环境问题备受关注,以罗伯茨绿僵菌（Metarhizium robertsii）为代表的昆虫病原真菌可开发为具有生物防治功能的真菌杀虫剂,其被广泛应用于各种农林害虫的防治,在替代传统化学杀虫剂方面具有重要潜力。罗伯茨绿僵菌营寄生、腐生以及根际共生三种生活方式,既是研究真菌致病机制的模式生物,也是研究不同碳氮源营养物质应答机制的良好材料。罗伯茨绿僵菌的致病过程包括穿透昆虫体壁和定殖昆虫血腔,能否穿透体壁决定其侵染的成败,因此,深入认识罗伯茨绿僵菌穿透体壁过程中的致病机制可为提高真菌杀虫剂的效率提供重要的理论支持,但目前关于该过程的作用机制还远未阐明。此外,作为真菌杀虫剂的活性成分,罗伯茨绿僵菌分生孢子的产量和活力是决定真菌杀虫剂效率的重要因素。通过对其孢子发育过程的深入研究,可为真菌杀虫剂的改良提供一定的借鉴意义。本论文主要探究罗伯茨绿僵菌中受MAPK正调控的三个信号通路在穿透体壁过程中的致病机制以及孢子发育过程的调控机制,主要研究结果如下:一.前期研究发现,Fus3正调控一个MYB家族转录因子RNS1（regulator of nutrient selection 1）,Rns1敲除突变体杀虫速度显着下降。本研究发现,在罗伯茨绿僵菌穿透体壁时,Fus3磷酸化RNS1第215位点的苏氨酸和第226位的丝氨酸。被磷酸化的RNS1进入细胞核,并与自身启动子区的顺式作用原件BM2位点（CCCAGAC）结合,诱导自身的表达。RNS1可直接调控体壁降解酶（脂酶、几丁质酶、蛋白酶）的表达,降解昆虫体壁的脂质、几丁质和蛋白质,获取营养而生长,并在昆虫体壁上打开通道,进入昆虫血腔。除了调控利用昆虫体壁蛋白、几丁质和脂质之外,在仅含有非昆虫来源的复杂碳氮源营养物质（烷烃、酪蛋白以及几丁质）中,Fus3也会磷酸化RNS1,诱导Rns1的表达,进而诱导这些复杂碳氮源利用相关基因的表达。Fus3/RNS1级联体对复杂碳氮源利用相关基因的诱导受到优质有机碳氮源营养物质（如葡萄糖、谷氨酰胺）以及次优质有机碳氮源（精氨酸,脯氨酸,N-乙酰-葡萄糖胺,棉子糖,海藻糖）的抑制,但不受优质无机氮源物质硫酸铵的抑制。在碳氮源营养代谢过程中,我们没有鉴定到RNS1与已知的碳氮源调控因子（CRR1,AREA,G6PD,Tps1,Snf1,TOR kinase）有直接相关性。二.在PDA培养基上,Rns1敲除突变体（35）Rns1的菌落形态与野生型菌株WT有明显差异,菌落蓬松,产孢结构出现异常,甁梗结构明显减少,产孢量下降。进一步分析发现,RNS1主要在产孢结构的甁梗以及孢子中高水平表达。上述研究表明RNS1调控罗伯茨绿僵菌的孢子发育过程。转录因子Brl A和Aba A所在的孢子中心发育通路调控罗伯茨绿僵菌的孢子发育过程,且Brl A直接调控Aba A的表达。本研究发现,Brl A存在Brl Aα和Brl Aβ两个转录本,Brl Aβ转录本起始位点位于Brl Aα转录本起始位点上游-835bp的位置。RNS1与Brl A启动子区的BM2位点结合后,通过调控Brl A的表达水平间接促进Aba A的表达。进一步分析发现,Slt2正调控RNS1介导的孢子发育过程。三.前期的研究结果表明,转录因子AFTF1在穿透体壁的过程中调控附着胞的形成,Aftf1的表达受Fus3的正调控,但是调控机制并未阐明。在本研究中,我们进一步发现Fus3正调控转录因子Aftf1的过程是通过转录因子Mr St12介导的。Mr St12敲除突变体无法形成附着胞结构且完全丧失了致病能力。在穿透体壁过程中,Fus3与转录因子Mr St12互作对其进行磷酸化修饰,激活后的Mr St12与Aftf1启动子区的顺式作用原件（ATGAAACA）结合,诱导Aftf1的表达,从而调控罗伯茨绿僵菌的致病过程。作为Fus3调控的下游基因,转录因子RNS1、Mr St12、AFTF1均调控罗伯茨绿僵菌穿透昆虫,但RNS1和Mr St12/AFTF1并不相互调控,表明Fus3/RNS1和Fus3/Mr St12/AFTF1是两个相互独立的级联体。综上所述,本论文发现MAPK与下游的三个转录因子分别组成Fus3/RNS1、Slt2/RNS1/Brl A/Aba A以及Fus3/Mr St12/AFTF1三个信号通路,两个含有Fus3的信号通路在调控昆虫体壁穿透时发挥重要作用,但二者之间并不相互调控。Slt2/RNS1通过控制孢子发育的中心调控通路调控孢子发育过程。
彭跃进[3]（2021）在《球孢白僵菌bZIP型转录因子BbHapX维持膜稳态及调控铁饥饿响应的生理机制》文中研究指明球孢白僵菌（Beaueria bassiana）是一种宿主范围和生防潜力俱佳的虫生丝状病原真菌。无论在离体环境中,还是寄生在宿主体内,它适应环境所演化出的一系列机制均利于其生态位的发展。在生态系统中,铁饥饿稳态对于真菌的生长发育以及物种的传代和壮大都至关重要。在铁胁迫环境下,真菌已演化出一套保守的铁吸收和利用系统,以帮助其度过环境变化所带来的威胁。在物种演化过程中,膜稳态是细胞维持机体正常运转的必要条件之一,对于真菌物种来说尤为重要。它不仅要平衡来自内部（细胞质）和外部（细胞壁）的机械压力,还要精准完成脂质和蛋白的组装和调配。本研究通过基因功能分析发现bZIP型转录因子BbHapX下游靶标BbOle1、BbLip1、BbLec1和BbCFEM家族基因,并结合经典遗传学、细胞生物学、生物信息学和分子生物学手段验证,对BbHapX响应铁饥饿调控和膜稳态调控两方面的功能进行解析。BbHapX维持真菌分生孢子质膜稳态和细胞膜功能分生孢子萌发不仅是环境传播的基础,而且是感染的关键步骤。在昆虫病原真菌球孢白僵菌中,我们从遗传上表征了碱性亮氨酸拉链（bZIP）转录因子HapX（BbHapX）在分生孢子养分储备和病原体-宿主相互作用中的作用。BbHapX的缺失导致体表接种和血腔注射试验中毒力几乎完全丧失。转录组学分析显示,脂肪酸（FA）/脂质代谢需要BbHapX,而生化分析表明BbHapX的损失导致分生孢子FA含量显着降低。外源油酸可以部分或完全恢复ΔBbHapX突变体受损的表型,包括萌发率、膜完整性、营养生长和毒力。BbHapX介导真菌铁的获取,这对于硬脂酸的去饱和是不需要的。另外,Δ9-脂肪酸去饱和酶基因（BbOle1）失活产生的缺陷与ΔBbHapX突变体相似。油酸还对ΔBbOle1突变体的缺陷表型具有显着的修复作用。凝胶阻滞试验显示BbHapX直接调节BbOle1的表达。脂质组学分析表明,BbHapX和BbOle1都有助于具有来自油酸的非极性尾巴的磷脂的稳态。因此,外源性磷脂可以显着恢复膜的完整性。这些数据表明,HapX-Ole1途径有助于分生孢子脂肪酸/脂质储备,并且在由球孢白僵菌引起的感染的早期阶段所涉及的脂质生物学与膜功能之间存在重要的联系。BbLip1通过调节膜脂稳态启动侵染循环脂肪酶是支持生物生长和发育的必不可少的一类酶。它们不仅催化生化反应（如酯化和酯交换）,而且在维持脂质稳态和细胞代谢方面也起着重要作用。脂肪酶负责将存储在脂滴中三酰基甘油催化降解为游离脂肪酸和甘油三酯。在球孢白僵菌中,BbLip1的缺失不仅会直接导致球孢白僵菌在生长发育和毒力方面造成生理缺陷,还引起油酸含量显着下降50%。当体外添加油酸时,能够部分恢复BbLip1缺失所造成的缺陷。凝胶阻滞结果表明,BbHapX能够转录激活BbLip1的表达。脂质组学分析表明,BbLip1的缺失直接导致真菌分生孢子内游离脂肪酸和贮存脂质的比例失衡。以上结果表明,球孢白僵菌BbHapX转录激活BbLip1参与到脂滴分解代谢,并影响丝状真菌的生长发育、氧化胁迫和毒力,最终贡献于质膜稳态。凝集素蛋白BbLec1参与细胞膜壁稳态凝集素具有碳水化合物结合能力的特征,并在真菌生理学中起着广泛作用。球孢白僵菌是一种丝状昆虫病原真菌,具有一种类似凝集素的蛋白质,其中含有一个Fruit Body＿domain（BbLec1）。BbLec1可以与真菌细胞壁中的壳二糖和几丁质结合。BbLec1蛋白显示出它们自身之间相互作用的潜能,并易位进入了分泌泡。此外,BbLec1与分泌泡蛋白PliA相互作用,这两个蛋白之间的相互依赖性对于稳定分泌泡的结构至关重要。本研究通过构建基因敲除株和回补株,对BbLec1在球孢白僵菌中的功能进行了解析。值得注意的是,BbLec1的丧失导致菌丝体和分生孢子中细胞壁的受损以及分生孢子的形成能力。此外,BbLec1的破坏导致细胞膜完整性降低和对渗透压的敏感性增强。最后,与野生型相比较,ΔBbLec1突变株表现出较弱的毒力。综上,BbLec1作为一种分泌泡成分,保持了分泌泡的结构和功能,这对于丝状昆虫病原真菌球孢白僵菌的致病性至关重要。BbCFEM家族响应铁饥饿调控的生理机制铁作为大多数原核生物和所有真核生物应激反应所必需的微量元素,它对于细胞维持必要的生长代谢至关重要。而CFEM（Cysteine-rich Fungal Extracellular Membrane）家族是真菌细胞中一类具有能够捕获生物铁的八个半胱氨酸保守残基的细胞外膜蛋白家族。在球孢白僵菌中,CFEM基因（BbCFEM）家族参与铁饥饿调控机制是非常保守的。体表侵染和血腔注射的毒力测定结果显示,BbCFEM家族基因在响应铁饥饿调控方面存在补偿效应,其补偿机制的存在取决于真菌面临的外界环境中铁水平的高低。与黄曲霉、黑曲霉和布氏白僵菌的体外铁竞争结果表明,在体外缺铁环境中,BbCFEM家族基因有助于球孢白僵菌与其它真菌竞争铁以供细胞生长。与布氏白僵菌的体内竞争结果显示,BbCFEM家族基因真菌在寄主体内与其他昆虫病原真菌竞争并获取铁。综上,球孢白僵菌BbCFEM家族在响应铁饥饿调控方面高度保守。并且,在不同铁饥饿环境下,BbCFEM家族基因在毒力方面存在着独特的补偿效应。此外,BbCFEM家族基因能够帮助真菌在体外腐生环境、昆虫体表侵染阶段、昆虫血腔增殖和腐生阶段完成生物铁的竞争和获取,并有助于真菌的分化发育和毒力。总而言之,本论文围绕球孢白僵菌bZIP型转录因子BbHapX的生物学功能开展研究。研究结果揭示BbHapX通过调控若干生理途径参与菌体应对铁饥饿响应和维持细胞膜稳态,进而决定真菌的毒力。本研究获得的主要结果如下:（1）揭示了BbHapX通过调控硬脂酰去饱和酶基因BbOle1转录,调节油酸的生成,进而影响菌体的磷脂稳态,最终维持细胞膜的完整性;（2）证实了BbHapX通过转录酯酶基因BbLip1调控脂质分解成脂肪酸的过程,并贡献于膜脂的稳态;（3）证实了BbHapX转录激活类凝集素基因BbLec1。揭示了该凝集素通过外分泌泡转运至细胞膜壁间隙,维持细细胞膜壁的完整性;（4）证实了CFEM家族基因参与球孢白僵菌应对环境中不同的铁利用度。同时,初步揭示了CFEM家族基因介导的铁获取能力参与球孢白僵菌与其它物种的种间竞争。研究结果为进一步阐明昆虫病原真菌侵染宿主和适应环境的机制提供新的理论认识。
鲁卓越[4]（2021）在《球孢白僵菌特异性分泌的Laccase 2与病原菌逃避昆虫免疫反应的关系及作用机制》文中研究说明昆虫病原真菌是唯一通过直接穿透体壁侵染宿主的病原微生物,其侵染过程涉及孢子附着寄主体壁、萌发、分化形成侵染结构-附着胞,附着胞分化形成侵染菌丝,在机械压力和水解酶的协同作用下穿透昆虫体壁。侵染菌丝一旦进入昆虫血腔,分化形成芽生孢子,称之为虫菌体,以逃避宿主免疫反应。球孢白僵菌（Beauveria bassiana）是一种国内外广泛用于农林以及卫生害虫生物防治的昆虫病原真菌,也是研究病原真菌与宿主及环境互作的模式真菌之一。研究发现,球孢白僵菌虫菌体表面特化为一层规则的“刷状”凸起,并且与体外培养的细胞有不同的表面特征和理化性状,推测该结构与病原真菌逃避昆虫血腔免疫识别相关。课题组前期研究发现,该“凸起”结构主要由蛋白质组成,通过比较蛋白组学鉴定了分生孢子、体外芽生孢子和虫菌体表面/分泌蛋白谱,发现6个虫菌体特异表达蛋白。解析这些特异表达蛋白,将有助于揭示昆虫病原真菌逃避宿主免疫反应的新策略,同时为提升生防真菌应用效果提供理论支撑。漆酶广泛存在于细菌、真菌、植物和无脊椎动物（包括昆虫）,参与多种不同的生理学及生物学过程。球孢白僵菌分泌性Laccase 2（Op S5,BBA＿08183）属于次级代谢产物卵孢菌素合成基因簇,参与卵孢菌素合成。前期研究发现,Laccase 2存在于虫菌体特异表达的表面/分泌蛋白库,推测其与虫菌体表面结构形成有关,在病原真菌与宿主昆虫互作中扮演了不同的角色。本文通过表达特性分析、细胞分布及分泌特性分析,结合基因敲除及过表达、异源表达及酶学功能研究等策略,探究了Laccase 2（命名为BbLac2）与球孢白僵菌逃避昆虫免疫反应的关系及作用机制。BbLac2蛋白主要研究结果如下:1.BbLac2表达受昆虫营养、氧化胁迫及昆虫酚类物质的诱导采用RT-qPCR及启动子控制GFP荧光标签探究了BbLac2的表达特性,结果表明,BbLac2在虫菌体中高表达,受昆虫营养（血淋巴或体壁）、氧化剂（menadione、tert-Butyl hydroperoxide和H2O2）及昆虫内源性酚类物质（L-thyrosine、3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine（L-DOPA）或5,6-dihydroxyindole）的诱导。进一步利用启动子与GFP融合的标签菌株,结合RT-qPCR,比较分析了Op S1（oosporein polyketide synthase）和BbLac2在球孢白僵菌侵染致病过程中的表达特性。研究发现,Op S1在侵染宿主死亡12 h后开始表达（72 hpi）,24 h后（84 hpi）转录水平逐步下降。而BbLac2在真菌进入昆虫体内（36 hpi）开始表达,接种48-72 h后转录水平呈上升趋势,84 h后下降。由此表明,BbLac2除参与卵孢菌素合成,在病原菌与宿主免疫互作过程中扮演了其它的角色,可能参与菌株对昆虫营养利用、响应氧化胁迫及解毒酚类物质等过程。2.BbLac2既分布于虫菌体表面,也可分泌至胞外通过构建表达BbLac2::GFP融合基因菌株,检测了BbLac2在真菌细胞（GFP信号）的分布。结果显示,BbLac2仅特异性分布于虫菌体细胞壁或细胞表面。为探究BbLac2的分泌特性,分别将BbLac2编码区和去除信号序列（sp BbLac2）与GFP融合,置于组成型启动子之下,构建PB3::BbLac2::GFP和PB3::BbLac2-sp::GFP菌株。结果显示,PB3::BbLac2::GFP的荧光信号均分布在真菌各种形态细胞的细胞壁或细胞表面,而PB3::BbLac2-sp::GFP的GFP荧光则均匀分布于真菌细胞内。Western blot检测发现,PB3::BbLac2::GFP细胞培养液中检测到融合蛋白,表明BbLac2可以分泌至胞外基质。3.BbLac2独立于卵孢菌素合成参与氧化胁迫反应为进一步探究BbLac2的生物学功能,分别构建了BbLac2基因破坏（ΔBbLac2）、回复互补（Comp）和超量表达(BbLac2OE)菌株。研究发现,破坏BbLac2显着增强了菌株对氧化胁迫的敏感性,而BbLac2OE菌株对氧化胁迫的耐受性略有增强。然而,不产生卵孢菌素的ΔOp S3菌株对氧化胁迫的敏感性与野生菌株无明显差异。由此表明,BbLac2独立于卵孢菌素合成参与菌株氧化胁迫反应。4.BbLac2参与虫菌体表面特性形成鉴于BbLac2是一个细胞壁蛋白或表面蛋白,进而分析基因破坏和过表达对细胞表面特性的影响,分别用三种荧光标记的凝集素concanavalin A（Con A）（识别α-glucose、mannose和α-Ν-acetylglucosamine（Glc NAc））、wheatgerm agglutinin（WGA）（识别β-Glc NAc和sialic acid residues）和Galanthus nivalis（GNL）（识别mannose residues）以及荧光标记的β-1,3 glucan抗体（特异性识别病原相关分子模式β-1,3glucan）检测碳源表位。结果表明,ΔBbLac2虫菌体对3种凝集素的结合活性与野生菌株无明显差异,但对β-1,3 glucan抗体的结合活性显着增强。相反,超量表达菌株BbLac2OE虫菌体对3种凝集素的结合活性显着增强,该结果与BbLac2蛋白存在多个推测的N-糖基化位点一致。而且,过表达菌株对β-1,3 glucan抗体的结合活性显着降低。由此表明,BbLac2为虫菌体表面蛋白,同时扮演了表面蛋白的角色,“隐蔽”包括β-1,3 glucan在内的病原相关分子识别模式。5.BbLac2是一个菌株的毒力因子,参与免疫逃避反应采用“经典”体壁接种和体腔注射接种大蜡螟三龄幼虫两种方式进行生物测定。结果表明,两种接种方法的结果一致,破坏BbLac2菌株导致菌株毒力降低,感染昆虫的死亡率均显着降低,致死中时(LT50)明显延长,而过表达菌株BbLac2OE的毒力显着高于野生亲本菌株（WT）,LT50缩短。真菌致死昆虫后,BbLac2OE、Comp、WT和ΔOp S3菌丝穿出僵虫体壁生长和产孢,而很少有菌丝从ΔBbLac2侵染的昆虫体壁穿出生长,表明破坏BbLac2削弱了白僵菌穿透僵虫体壁的能力。由此表明,BbLac2是一个维持球孢白僵菌毒力的因子。免疫反应检测发现,微量注射接种ΔBbLac2菌株48 h后的昆虫体表发生严重的黑化现象,而BbLac2OE处理的昆虫则没有观察到明显的黑化现象,推测ΔBbLac2易激活昆虫免疫反应。显微观察显示,接种36-48 h,BbLac2OE孢子在虫体内萌发并快速逃避血细胞的“包裹”,而ΔBbLac2孢子或芽管则易被血细胞“包裹”并发生典型的黑化。qPCR检测菌体在虫体内的增殖量,BbLac2OE的增殖显着快于WT,而ΔBbLac2增殖量则低于WT。与之相反,接种BbLac2OE孢子的昆虫血细胞数量低于野生菌株的处理,而ΔBbLac2感染的血细胞数量则显着高于WT处理的昆虫。由此表明,BbLac2参与病原菌逃避昆虫免疫反应。6.BbLac2解毒昆虫免疫反应产生的活性氧和干扰酚氧化酶级联反应为探究BbLac2参与真菌逃避昆虫免疫反应的机制,分别检测了菌株侵染大蜡螟幼虫后与昆虫免疫反应相关的活性氧（ROS）水平及酚氧化酶（PO）活性。以活性氧敏感的荧光探针CM-H2DCFDA检测“包裹”免疫反应中血细胞内的ROS水平,发现BbLac2OE侵染昆虫的荧光强度明显低于WT处理,而ΔBbLac2接种的荧光强度与WT处理无明显差异。以H2O2作为ROS分子代表,定量检测真菌侵染的昆虫血淋巴中ROS水平,也显示相似的变化趋势。由此表明,BbLac2具有清除免疫反应产生ROS的功能。为进一步探究BbLac2清除ROS的潜在机制,利用甲醇诱导的毕赤酵母表达BbLac2。表达的BbLac2蛋白具有典型的漆酶活性,在p H 7.0-13范围及20oC-50oC条件下,BbLac2均具有较高的ROS清除活性。在p H=8.0和40oC条件下,BbLac2清除H2O2活性随蛋白浓度的增加而增强。酚氧化酶（PO）活性检测结果表明,接种真菌孢子0-10 h,昆虫PO活性显着上升,然后呈下降趋势。然而,ΔBbLac2侵染昆虫PO活性显着高于WT处理,而接种BbLac2OE 6 h后的PO活性显着低于WT侵染的昆虫,表明其更容易逃避昆虫免疫识别。为揭示BbLac2影响PO活性的可能机制,采用典型的PO酚类底物L-DOPA测定BbLac2活性。结果表明,在p H 6.0-9.0之间,BbLac2对L-DOPA具有相对高的活性。在含有L-DOPA的Czapek平板上添加BbLac2后,形成明显的黑色素物质。由此表明,BbLac2具有氧化PO底物酚类物质的活性,干扰PO合成及介导的免疫反应。为探究破坏和超量表达BbLac2对宿主昆虫免疫途径的影响,分析了真菌侵染昆虫12 h后3个Toll途径基因Sp（?）tzle、Dorsal和BGBP1（β-1,3 glucan binding protein基因）和14个抗菌肽基因基因表达水平。结果表明,与WT侵染的昆虫相比,ΔBbLac2侵染的昆虫中3个Toll途径基因和11个抗菌肽基因显着上调,而3个Toll途径基因和13个抗菌肽基因在BbLac2OE侵染昆虫中却显着低于WT侵染的昆虫。研究结果进一步证实了BbLac2具有参与病原菌逃避昆虫免疫反应的角色。综上研究结果表明,BbLac2在病原菌逃避昆虫免疫反应中扮演了多功能角色。病原菌在侵入昆虫血腔时特异表达BbLac2,分泌到昆虫血淋巴,不仅参与卵孢菌素合成抑制昆虫免疫反应,而且参与清除免疫反应产生活性氧和氧化PO底物干扰其介导的免疫级联反应,同时BbLac2作为一种表面蛋白,“隐蔽”β-1,3 glucan等病原相关分子模式,有助于真菌逃避昆虫免疫识别。
张丽娟[5]（2021）在《分离自COPD患者Aspergillus lentulus毒力因子测定及宿主免疫反应机制研究》文中指出目的:揭示分离自COPD患者的Aspergillus lentulus（A.lentulus）形态学、分子生物学及体外药物敏感性特点,进一步了解其感染动物模型后的毒力及毒力因子的表达情况,通过检测炎症通路中间产物及终末炎症因子的表达探讨其可能的宿主免疫反应机制。方法:对分离自COPD患者痰标本中的目标菌株进行显微镜下形态学特点的观察,进行扩增β-tubulin（560bp）基因,与基因库序列比对进行分子生物学鉴定。按照CLSI M38-A2标准进行体外药物敏感性测定。以烟曲霉及白色念珠菌为对照,选择A.lentulus菌液浓度1×106CFU注入蜡螟幼虫larvaes体内,在不同时间点观察对比larvaes的生存率、体表黑素化评分和活动度评分。液氮研磨A.lentulus感染的larvae组织,以显色法及酶法检测（1,3）-β-D葡聚糖及半乳甘露聚糖表达。分别以A.lentulus、烟曲霉和白色念珠菌的不同MOI值:0、1、5、10、20作用于鼠树突状细胞,ELISA法检测上清液中IL-β的含量。最后,用1×106CFU的A.lentulus菌液注入蜡螟幼虫larvaes体内,q RT-PCR检测感染后larvaes体内Caspase-1及TNF-α的m RNA含量。结果:1)分离菌株镜下观察:A.lentulus培养外观呈白色絮状菌落,镜下可见透明分隔菌丝,产孢子少,48℃下不能生长;2)分子生物学鉴定结果:扩增结果与A.lentulus标准株具有99%的同源性;3)体外药物敏感性实验结果:A.lentulus患者菌株对7种抗真菌药物的最小抑菌浓度依次为:两性霉素B（2μg/ml）、5-氟胞嘧啶（64μg/ml）、氟康唑（>64μg/ml）、伊曲康唑（0.5μg/ml）、伏立康唑（1μg/ml）、咪康唑（4μg/ml）和米卡芬净（≤0.015μg/ml）,而标准株FH5T药敏结果中,除咪康唑（MIC 2μg/ml）和米卡芬净（MIC≤0.03μg/ml）外,其它药物最小抑菌浓度与患者菌株相同;4)在蜡螟幼虫larvae的感染模型中,烟曲霉及白色念珠菌组蜡螟幼虫在24-48小时内全部死亡,而A.lentulus患者菌株组蜡螟幼虫的体表黑素化评分、生存率评分及活动度评分在48小时与对照组相比分别下降了57.5%、73.3%和53.3%。A.lentulus患者菌株组和标准菌株组（1,3）-β-D葡聚糖水平与PBS对照组比较无差异（P>0.05）,A.lentulus患者菌株组和标准菌株组半乳甘露聚糖水平与PBS对照组比较有升高,且升高有统计学意义（P<0.05）,A.lentulus患者菌株组和标准菌株组半乳甘露聚糖水平无显着差异（P>0.05）;5)白色念珠菌、烟曲霉及A.lentulus作用于鼠树突状细胞后均可引起IL-1β升高,白色念珠菌处理48小时、MOI=20时,IL-1β水平较其它时间点及浓度值时显着升高（P<0.01）,烟曲霉处理12小时、MOI=10时诱导IL-1β升高与MOI=0比较有显着差异（P<0.01）,A.lentulus处理48小时、MOI=1时诱导IL-1β升高与MOI=0比较有显着差异（P<0.01）,从12小时开始,相同时间及浓度下,烟曲霉所诱导的IL-1β水平均显着高于A.lentulus患者菌株组（P<0.01）;6)A.lentulus患者菌株和标准菌株感染larvae后均可诱导蜡螟体内Caspase-1和TNF-α的升高（P<0.05）,而标准株组和患者株组两因子的水平无统计学差异（P>0.05）。结论:1)分离自COPD患者的A.lentulus以白色絮状为主,镜下呈透明分隔菌丝,产孢少,48℃下不能生长,对两性霉素B、5-氟胞嘧啶、氟康唑和咪康唑具有较高的MIC值,对米卡芬净敏感;2)A.lentulus毒力弱于烟曲霉及白色念珠菌,且其毒力作用缓慢;3)A.lentulus作用鼠树突状细胞后可引起其IL-1β的释放,相同条件下A.lentulus诱导IL-1β释放的能力弱于烟曲霉;4)半乳甘露聚糖可作为早期A.lentulus侵袭性感染的监测指标;5)NLRP3/Caspase-1炎症小体通路参与了A.lentulus感染宿主的免疫反应,该过程中伴有TNF-α的升高。
赵婷[6]（2021）在《白头翁汤正丁醇提取物改善VVC小鼠阴道黏膜屏障及主要组分小檗碱抑制白念珠菌黏附阴道上皮的作用研究》文中研究指明目的:研究白头翁汤正丁醇提取物（Butyl Alcohol Extract of Baitouweng Decoction,BAEB）对外阴阴道念珠菌病（Vulvovaginal Candidiasis,VVC）小鼠阴道黏膜上皮屏障完整性的影响以及体外进一步探究其主要成分盐酸小檗碱对白念珠菌黏附人阴道上皮细胞的影响的作用机制。方法:1.SPF级雌性昆明种小鼠皮下隔天注射苯甲酸雌二醇3次诱导至假发情期;并将其随机分为6组（空白对照组,氟康唑组,模型组,BAEB高、中、低剂量组）;除去空白对照组以外,其余各组小鼠均以每只20μl菌液(2×106 CFU·ml-1)接种白念珠菌Candida albicans SC5314标准株至小鼠阴道,悬空倒立5 min,连续7天以构建VVC模型。再用BAEB（80 mg/kg、40 mg/kg、20 mg/kg）按对应组别分别灌胃,连续治疗7天。BAEB治疗后,革兰染色观察白念珠菌在小鼠阴道分泌物中的形态;平板法检测小鼠阴道内的真菌载荷量;HE（Hematoxylin-eosin staining）染色法观察小鼠的阴道黏膜组织病理损伤;MT（Masson’strichrome staining）,HE及PAS（Periodic acid-schiff staining）染色法观察小鼠阴道黏膜上皮屏障的完整性;免疫组化法检测小鼠阴道黏膜上皮细胞黏蛋白mucin-1、mucin-4及β-防御素2蛋白表达水平;Western blot法检测第0,3,7天黏膜上皮细胞黏蛋白mucin-1、mucin-4及β-防御素2的动态表达。2.体外观察BAEB的主要组分盐酸小檗碱对白念珠菌对人阴道上皮细胞A431早期黏附的影响。CCK8检测A431细胞的最适生长浓度、盐酸小檗碱对细胞活力的影响;显微镜观察细胞的汇合度及形态变化;革兰染色法观察1 h、2 h、3 h白念珠菌早期黏附细胞的动态变化及盐酸小檗碱干预后对白念珠菌早期黏附A431细胞的动态影响;ELISA检测白念珠菌刺激下细胞上清液IL-2、IL-4的水平变化及IL-2/IL-4的动态比例;免疫荧光观察白念珠菌刺激下细胞膜上黏附分子ICAM-1的动态表达;Western blot检测白念珠菌刺激下A431细胞黏附分子ICAM-1、黏蛋白（mucin-1、mucin-4）的动态变化。结果:1.革兰染色与平板涂布发现模型组比空白对照组小鼠阴道内的白念珠菌菌丝量多、密集、且较长以及高真菌载荷量;HE染色、MT染色及PAS染色观察到VVC模型组小鼠阴道黏膜结构严重受损,角化层脱落,上皮细胞出现增生,炎症浸润加剧;免疫组化定位与Western blot定量均检测到阴道上皮细胞表面黏蛋白mucin-1、mucin-4及β-防御素2蛋白的表达量显着增多（p<0.0001）;VVC小鼠经BAEB治疗后,与模型组相比,BAEB（高、中、低剂量组）小鼠阴道内菌丝的形成明显受到抑制,真菌载荷量显着下降（p<0.05）;炎症浸润相应降低,阴道黏膜组织损伤也逐渐改善,上皮屏障修复并恢复其完整性;阴道上皮细胞表面的黏蛋白mucin-1、mucin-4及β-防御素2蛋白水平显着下调（p<0.001）。2.CCK8检测和倒置显微镜形态学观察表明,2×105个/ml细胞为A431细胞最适生长密度,且细胞铺展较大,胞间连丝紧密,褶痕突出,漂浮物极少。革兰染色结果表明白念珠菌在早期黏附时间及不同菌的浓度下,2 h时2×107CFU·ml-1的白念珠菌黏附A431细胞的量最多（p<0.0001）。ELISA检测表明较正常组细胞模型组的IL-2分泌增加,上升幅度极大,IL-4分泌也增加,但幅度极小;而盐酸小檗碱干预后IL-2分泌明显下调,IL-4分泌显着上调。免疫荧光结果表明,较正常组细胞,模型组的黏附分子ICAM-1表达显着增加（P<0.0001）且2h ICAM-1的表达量最多;盐酸小檗碱干预后,ICAM-1表达显着降低（P<0.0001）。Western blot结果表明,较正常组细胞,模型组的黏附分子ICAM-1、mucin-1和mucin-4表达显着增加,且具有短暂的时间依赖性;而盐酸小檗碱干预后,ICAM-1、mucin-1及mucin-4的表达较模型组均显着降低。结论:本实验成功构建了小鼠外阴阴道念珠菌病（VVC）模型,并发现BAEB对VVC小鼠的治疗与阴道上皮屏障的修复及黏膜完整性的重塑密切相关,其作用机制可能通过调节机体的固有免疫相关免疫分子mucin-1、mucin-4及β-防御素2等的表达而实现。体外实验表明,BAEB的主要成分盐酸小檗碱在低于其MIC浓度时,能够抑制白念珠菌对阴道上皮细胞的早期黏附和损伤,降低IL-2的分泌同时促进IL-4的分泌,并下调黏附相关分子ICAM-1及黏蛋白mucin-1、mucin-4的表达,从阴道上皮细胞及相关免疫分子角度进一步阐明了BAEB抗VVC的作用与机制。
刘颖[7]（2020）在《白色念珠菌重要毒性因子的电镜结构生物学研究》文中研究指明白色念珠菌（Candida albicans）是艾滋病、癌症等疾病患者以及免疫机能减退人群的重要威胁。目前,形态可塑性被认为是白色念珠菌致病的关键毒性因子。本文以白色念珠菌形态转换不同阶段发挥作用的关键蛋白作为研究对象,首先对第一阶段发挥代谢作用,产生形态转换信号——CO2的尿素酰胺水解酶进行结构解析,分析其发挥作用的分子机制;之后对第二阶段介导免疫逃逸的关键蛋白Pral进行特性及结构分析,探究Pral与补体途径上游蛋白的互作。通过对菌丝生长不同阶段的关键蛋白进行研究,本研究尝试为白色念珠菌发挥致病性的相关机制提供参考和依据。论文第一部分,我们将尿素酰胺水解酶（Urea Amidolyase,UA）作为研究对象。UA所属生物素依赖性羧化酶家族,通过摆臂实现活性位点的偶联和底物的水解,已经是该家族公认的酶活机制,但目前已被解析的多个生物素依赖性羧化酶家族蛋白的结构表明,单纯依靠摆臂模式不足以实现生物素在两个活性位点的转移,生物素羧基载体蛋白（Biotin Carboxyl Carrier Protein,BCCP）也必须在催化过程中移位,这种模式被称为“摆动域”模型。尽管生物素和磷酸泛素依赖酶家族中的多个证据支持这一理论,但目前尚无确切结构证据能够证明“摆动域”的机制。本研究以此为切入点,运用负染电镜单颗粒技术对乳酸克鲁维酵母全长UA（K.lactis Urea Amidolyase,KlUA）的空载状态（KlUA-APO）,只添加配体状态（KlUA+ADP）和同时添加底物配体状态（KlUA+ADP+Urea）进行负染观察及单颗粒三维重构,通过比较三种状态下KlUA的结构差异,发现KlUA二聚体中BCCP位置具有不对称性,不添加底物和配体KlUA二聚体内BCCP更加灵活,摆动更加明显,并由此推测,每个单体的BCCP可在生物素羧化酶（Biotin Carboxylase,BC）及羧基转移酶（Carboxyl Transferase,CT）间自发摆动而不依赖于底物或配体的结合,各单体内的BCCP移动不受另一单体的影响,彼此独立进行。该结构特征通过单颗粒三维重构的计算性“纯化”而被捕捉,为UA呈现的的高效酶活提供了结构解释,并在一定程度上为生物素依赖性羧化酶家族的“摆动域”模型提供了结构依据。论文第二部分,我们将pH调节蛋白（pH-regulated antigen,Pral）作为研究对象。Pral作为白色念珠菌表达的内源性补体蛋白抑制剂,在白色念珠菌进行免疫逃逸时发挥关键作用。研究表明,Pral能通过裂解补体蛋白C3,抑制旁路途径（Alternative Pathway,AP）的激活。同时,Pral也被证明能够抑制经典途径（Classical Pathway,CP）和凝集素途径（Lectin Pathway,LP）功能的发挥,对CP/LP途径C3b沉积和免疫吞噬的抑制作用与AP途径相当。为了探究Pral对三种补体途径上游关键蛋白的干扰作用,本研究首先运用原核、真核表达系统对Pral及补体蛋白C2、C4进行载体构建和表达纯化,并对血浆中含量丰富的C3进行提取纯化,分析各蛋白特性,为Pral与补体途径上游关键蛋白的研究提供实验材料。运用酶联免疫吸附实验对Pral与各补体蛋白的相互作用进行分析,结果显示,Pral能够与CP/LP途径补体蛋白C2和C4发生互作,这种相互作用不依赖蛋白本身的糖基化修饰,但需要金属离子的支持,且在种间具有保守型。这些结果初步验证了我们对Pral抑制CP/LP途径的猜想,即Pral可能通过结合补体途径上游C2和C4蛋白,干扰C3转化酶（C4b2a）功能的发挥。随后,我们对Pral蛋白的生化性质进行分析,结果显示,天然状态下的Pral以大于250kDa的多聚体形式存在于溶液中,具有较强的抗还原能力,多聚体的形成不依赖金属离子的结合,当蛋白浓度升高,会产生浓度依赖性沉淀。因补体蛋白C3是各激活途径的交汇,在补体系统中处于核心地位,本研究还尝试运用电镜三维重构技术对Pral裂解C3的分子机制进行解析,我们首先运用同源建模手段预测并分析了 Pral单体的结构特性,随后,通过负染电镜单颗粒技术对血浆中提取纯化的C3蛋白进行三维重构,获得了 C3蛋白在天然状态下的结构模型;最后,我们对C3-Pral复合物的形成条件进行摸索,将浓度比,孵育温度和孵育时间作为变量,最终确定了 C3-Pral复合物进行电镜观察的最佳条件。以上实验结果为下一步C3-Pral复合物的结构解析提供了实验基础及部分初始模型,并为Pral蛋白在免疫逃逸过程中与CP/LP上游补体蛋白C2、C4互作的结构生物学研究搭建了实验体系。
刘加[8]（2020）在《絮状表皮癣菌基因组、转录组及与宿主相互作用机制的研究》文中认为皮肤癣菌病为全球第四大常见疾病,且皮肤癣菌感染后极易复发。絮状表皮癣菌为临床上常见的皮肤癣菌之一,易感染皮肤以及甲,头发感染甚为少见。在印度、伊朗等国家其感染发病率可高于红色毛癣菌、须癣毛癣菌、犬小孢子菌等常见皮肤癣菌。絮状表皮癣菌在分类学上单独成属,其在致病性和生态习性上也有着独特的一面。因絮状表皮癣菌为亲人性皮肤癣菌,缺乏相应的动物模型,现有的分子、组学等研究工具也仅应用于毛癣菌属和小孢子菌属的皮肤癣菌,目前有关絮状表皮癣菌的基本特征,包括分子生物学、组学、致病机制等研究还有很多空白,因此本文主要侧重从这些方面对絮状表皮癣菌展开系统的研究,以揭示絮状表皮癣菌的生物学特征以及与宿主相互作用的具体机制。首先我们对本实验室收集到的19株絮状表皮癣菌进行体外形态和酶解反应的分析,结果表明絮状表皮癣菌在土豆培养基上可呈现4种不同的形态特征,角蛋白酶和脂酶活性比其他临床常见皮肤癣菌弱可能与其易感部位、生态习性有一定的相关性。利用多基因位点（ITS、CHS-1、BT2、LSU）分型和AFLP的方法将絮状表皮癣菌分为四种主要的基因型,但未能证实这种分型与形态、酶解活性以及地域有相关性。在本文的第二章中我们联合二代和三代测序技术完成了对絮状表皮癣菌的高质量全基因组测序,对基因组进行功能注释发现絮状表皮癣菌自身有一套完整的能量和核酸代谢系统以适应不同的环境。通过比较基因组分析发现絮状表皮癣菌基因组为现有皮肤癣菌基因组中最大的,且存在方向的不一致性,推测这种现象与其基因组中的Tf2和Tc1-mariner转座子相关。在全基因组水平进行系统进化分析发现絮状表皮癣菌与石膏样奈尼兹皮菌系统发育关系最近,进一步比较分析得出絮状表皮癣菌的生态习性和致病特点可能与以下因素有关:1)黏附因子的种类和数量尤其是 1,3-beta-glucanosyltransferase gel3;2)角蛋白水解有关的 Cdo1、sub1、sub3、sub7的数量;3)CAzy家族中的CEs和CBMs的数量;4)LysM结构域的种类和数量;5)丝氨酸/苏氨酸蛋白结构域。另外我们在分子和基因组的水平揭示了絮状表皮癣菌采用经济节约的无性繁殖的方式进行繁殖,交配型为MAT1-2型。最后我们利用RNA-seq和dual RNA-seq技术对絮状表皮癣菌在体外以及与人HaCaT细胞互作的基因表达进行分析研究,主要目的是为了揭示絮状表皮癣菌的蛋白水解及与宿主相互作用过程中的关键调控基因,为临床上的分子标记和靶向治疗奠定基础。研究结果表明与起源关系最近的石膏样奈尼兹皮菌相比,絮状表皮癣菌在蛋白水解的各个环节都有其独特的调控机制。金属蛋白酶和DPPV为絮状表皮癣菌蛋白水解的关键调控基因,FAD、MFS转运蛋白、磷脂酶D为絮状表皮癣菌入侵宿主细胞的重要毒力因子,KRT75基因的表达可能与毛发的感染有关,CDC7蛋白激酶可能为无性繁殖的关键调控机制之一。对于细胞而言,絮状表皮癣菌的入侵造成了其结构和功能的破坏,与此同时,与细胞增殖分化、细胞骨架、细胞外基质重塑等有关的基因表达上调以对抗絮状表皮癣菌造成的损伤。
向柄全[9]（2020）在《生物材料表面真菌-细菌混合生物膜中持留菌的形成及其持留机制研究》文中研究说明第一部分诱导生物材料表面真菌-细菌混合生物膜中持留菌形成[目的]寻找诱导生物材料表面真菌-细菌混合生物膜中持留菌形成的方法,构建生物材料表面真菌-细菌混合生物膜中持留菌模型,并观察持留菌形态特征及其对混合生物膜结构的影响。[方法]1.培养生物材料表面白色念珠菌-表皮葡萄球菌混合生物膜,分别使用10ug/mL、50ug/mL、100ug/mL的四环素、庆大霉素、利福平、5-氟胞嘧啶（5-FC）、卡泊芬净、氟康唑、CCCP诱导混合生物膜0.5h、lh、3h促进持留菌形成,再使用10ug/mL的环丙沙星及两性霉素B杀灭非持留菌;超声洗脱混合生物膜,平板菌落计数法比较各种方案诱导产生的持留菌数量,寻找诱导持留菌形成的最佳方案;行药敏检测验证持留菌形成。2.以最佳诱导方案诱导生物材料表面真菌-细菌混合生物膜,构建生物材料表面真菌-细菌混合生物膜持留菌体外模型。3.采用生物材料表面真菌-细菌混合生物膜持留菌体外模型,以未经诱导的混合生物膜为空白对照,培养24h后,使用扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscope,SEM）观察持留菌的形态特征;以未经处理的混合生物膜为空白对照,未诱导直接灭菌的混合生物膜为阴性对照,使用激光共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscope,CLSM）观察持留菌对混合生物膜结构的影响。[结果]1.根据菌落计数结果,四环素、庆大霉素可诱导表皮葡萄球菌持留,5-FC、卡泊芬净、氟康唑可诱导白色念珠菌持留,以上各药物均为100ug/mL浓度诱导1h效果最佳。100ug/mL利福平诱导表皮葡萄球菌3h也可增加持留菌水平,但效果明显低于上述药物;经各药物诱导后,表皮葡萄球菌、白色念珠菌均无耐药,证明存活微生物均为持留菌。2.使用100ug/mL的四环素、卡泊芬净、5-FC、庆大霉素的诱导生物材料表面真菌-细菌混合生物膜1h,可成功构建生物材料表面真菌-细菌混合生物膜持留菌体外模型;3.SEM观察可见经诱导与未经诱导的混合生物膜表面结构无明显差别,均为以白色念珠菌为骨架,表皮葡萄球菌黏附于表面形成复杂的混合生物膜结构;经诱导的白色念珠菌表面可出现隆起样形态改变,经诱导的表皮葡萄球菌细胞分裂减少,部分体积缩小;活/死菌染色后使用CLSM观察,可见未经诱导的混合生物膜在抗菌药物的作用下被溶解,而经诱导持留菌比例较高的混合生物膜未被溶解;不论生物膜厚薄均可见持留菌,生物膜较薄处持留菌与死菌混杂存在,生物膜较厚处可见大片持留菌。[结论]1.5-FC、卡泊芬净可诱导白色念珠菌持留,四环素、庆大霉素可诱导表皮葡萄球菌持留,诱导效果呈时间-剂量-效应关系,100ug/mL浓度各药物诱导1h时可获得最佳诱导效应;2.使用四环素、庆大霉素、5-FC、卡泊芬净诱导生物材料真菌-细菌混合生物膜可成功构建生物材料表面真菌-细菌混合生物膜持留菌体外模型,解决了既往持留菌数量较少、难以获取的技术难题;3.经诱导的白色念珠菌出现菌体表面隆起样改变,表皮葡萄球菌细胞表现为分裂减少、体积缩小;大量持留菌细胞可以避免混合生物膜被抗菌药物破坏;复杂混合生物膜结构不是持留菌形成的必要条件,但复杂的混合生物膜中可产生更高水平的持留菌细胞。第二部分生物材料表面真菌-细菌混合生物膜中持留菌的持留机制研究[目的]分析生物材料表面表皮葡萄球菌及白色念珠菌混合生物膜中持留菌株与非持留菌株的差异表达基因,寻找可能的持留机制及持留相关基因。[方法]1.以四环素、庆大霉素诱导生物材料表面真菌-细菌混合生物膜中表皮葡萄球菌持留,5-FC、卡泊芬净诱导白色念珠菌持留,构建生物材料表面真菌-细菌混合生物膜中持留菌模型,以未经诱导的混合生物膜为空白对照;使用Trizol法分别提取各组细菌与真菌的总RNA,使用OD260/280比值及琼脂糖凝胶电泳分别检测总RNA的纯度与完整度。2.以NCBI基因组数据库的转录组序列作为对比参考序列,对总RNA进行RNA-Seq检测,筛选在两种药物诱导形成的持留菌中均与空白对照呈差异表达的共同差异基因,以排除由各药物引起的与持留无关的基因差异表达,并分析其共同差异基因的功能。3.对共同差异基因进行GO富集分析及KEGG Pathway显着性富集分析,寻找共同差异基因主要参与的代谢途径。[结果]1.成功提取细菌与真菌的总RNA,各组样品总RNA的OD260/280比值均大于1.8,白色念珠菌28s、18s rRNA条带及表皮葡萄球菌23s、16s rRNA条带均完整,证明总RNA纯度、完整度较好。2.生物材料表面真菌-细菌混合生物膜中白色念珠菌持留菌共同差异表达基因684个,表皮葡萄球菌持留菌共同持留菌差异表达基因102个;白色念珠菌持留菌的差异表达基因功能多为增强核糖体功能,减慢细胞分裂,减弱毒力,增强对各种应激的耐受性,且细胞外基质蛋白1（Extracellular matrix 1,ECM1）等黏附相关基因显着上调。表皮葡萄球菌持留菌的DnaK与SceD基因上调,可增加细菌对抗菌药物及不良环境的抵抗能力,但未见其它共同差异表达基因。3.GO富集分析结果显示,白色念珠菌持留菌上调的基因主要富集于分子功能:甲基转移酶活性,转移一个碳基的转移酶活性,核苷三磷酸酶活性,焦磷酸酶活性,ATP耦合酶活性;生物过程:甲基化,rRNA处理,rRNA代谢过程,核糖体形成,ncRNA代谢过程等GO Term;白色念珠菌下调基因及表皮葡萄球菌差异表达基因均无显着富集。KEGG富集分析结果显示:白色念珠菌持留菌上调基因主要富集于:真核生物核糖体的生物发生,RNA聚合酶,嘧啶代谢,嘌呤代谢,ATP结合盒式转运蛋白等通路;白色念珠菌下调基因主要富集于:磷酸戊糖途径,淀粉和蔗糖代谢,谷胱甘肽代谢,磷酸肌醇代谢,RNA降解等通路。表皮葡萄球菌上调基因富集于RNA降解通路,下调基因无明显富集。4.RT-qPCR结果显示,白色念珠菌ECM1基因在各实验组中均较空白组上调;PLC1、PRR2、SAC6、TOR1基因均较空白组下调。表皮葡萄球菌的DnaK基因在各实验组均上调。[结论]1.生物材料表面白色念珠菌-表皮葡萄球菌混合生物膜中持留菌的持留是由多因素、多基因共同引起的以增加微生物对外界不良刺激的耐受性及生存能力为目的的复杂过程,该过程伴有细胞内资源的重新分配,并可能导致微生物的代谢、分裂及致病能力下降。2.白色念珠菌黏附于生物材料表面后,可通过下调PRR2、SAC6、PLC1等基因,形成对多种环境压力耐受但细胞生长抑制、功能低下的持留菌细胞,而ECM1可通过促进白色念珠菌黏附,其可能是白色念珠菌持留的关键基因。3.四环素及庆大霉素可能通过不同基因促使表皮葡萄球菌持留,而表皮葡萄球菌持留菌形成后,可通过上调DnaK基因获得耐受多种环境压力的能力。
姚蕾[10]（2020）在《球形孢子丝菌诱导THP-1巨噬细胞免疫应答的初步研究及黑素对其免疫功能的影响》文中认为孢子丝菌病（Sporotrichosis）是一种累及皮肤、皮下组织甚至内脏、骨骼等器官的深部真菌感染,病程迁延不愈,严重者可危及生命。我国东北尤其是吉林省是较为严重的流行区域之一。该病病原体为申克孢子丝菌复合体,目前已发现该复合体含7种基因型,其中主要的致病型为3种:申克孢子丝菌、巴西孢子丝菌及球形孢子丝菌,而我国的流行株以球形孢子丝菌（Sporothrix globosa）为主,且目前为止,球形孢子丝菌是我国东北地区发现的唯一基因型。但目前对于孢子丝菌病的发病机制尚未能完全明确,尤其明确其基因型的差别以后,对于我国的流行菌种球形孢子丝菌的研究极少。孢子丝菌属暗色真菌,具备合成黑素的能力,黑素是其重要的毒力因子之一,但在孢子丝菌方面的相关研究不多。为初步明确人体在感染孢子丝菌后局部的免疫应答状态、球形孢子丝菌诱发巨噬细胞免疫应答的机制以及黑素在其中的作用,本研究对吉林省孢子丝菌病患者的皮损组织进行了免疫组化及蛋白研究,体外采用球形孢子丝菌野生菌株及使用紫外线诱变法获得的相应白化菌株,研究二者刺激THP-1巨噬细胞后发生的免疫应答及其差别,并进一步探索了球形孢子丝菌诱导THP-1巨噬细胞发生免疫应答的分子调控机制。本研究第一部分收集了15例吉林省孢子丝菌病患者的皮损,与3例正常皮肤进行对照研究,对组织进行了84个真菌感染相关基因的q PCR array检测,发现孢子丝菌病患者皮损内表达增高的基因有5个,分别是STAT1、TLR2、LYN、MYD88、PYCARD;表达降低的基因有17个,分别是IL-12β、FOS、TLR9、CHIA、MBL2、IL-2、COLEC12、NPTX1、C5AR1、IL-12α、CSF2、TIRAP、IKBKB、IL-10、CARD9、IL-23α、MAPK8。经过免疫组化研究显示皮损组织内IFN-γ、TNF-α、IL-18表达增高,与正常皮肤比较有显着性差异（p<0.01）,其中IFN-γ主要在表皮表达;皮损组织内IL-1β、IL-4、IL-10未见明显表达,其中IL-1β表达与正常皮肤组织比较无统计学差异（p=0.250）,正常皮肤组织内可见IL-4、IL-10表达,与皮损组织比较有显着性差异（p<0.01）。对皮损组织的蛋白进行免疫印迹分析发现孢子丝菌病患者皮损组织TLR2表达较正常皮肤增高,而TLR4及NLRP3表达未见明显变化。说明孢子丝菌患者皮损内以Th1方向炎症反应为主,TLR2可能是介导其免疫应答的重要模式识别受体。第二部分进行了体外试验,采用的菌株经过CAL基因测序证实为球形孢子丝菌,并且该菌株序列已上传至Gen Bank（登陆号为KT008664）。利用紫外线诱变法得到了稳定的白化突变株（MEL-）,白化株不产黑素,其他性状与野生菌株（MEL+）高度相似。将MEL+、MEL-分别与THP-1巨噬细胞共培养,采用免疫荧光染色、ELISA、流式细胞术、q PCR、western blot等方法,检测THP-1巨噬细胞被菌株刺激后的免疫应答反应及模式识别受体表达情况。结果表明体外培养THP-1巨噬细胞能够吞噬球形孢子丝菌分生孢子,吞噬指数随共培养时间延长而增加,MEL+与MEL-相比较,THP-1巨噬细胞对MEL-吞噬指数大于MEL+,共培养4h时,二者吞噬指数具有显着性差异（p<0.05）。裂解吞噬了分生孢子的THP-1巨噬细胞后,将释放的孢子悬液接种SDA平板培养基,28℃培养7日后MEL+菌株可见多数菌落生长,而MEL-菌株几无生长;且MEL+菌株随共培养时间延长,菌落数量逐渐减少,说明随共培养时间延长,THP-1巨噬细胞对MEL+菌株杀伤孢子能力增强;而THP-1巨噬细胞对MEL-菌株的杀伤作用明显强于MEL+菌株。将MEL+、MEL-以及从野生株提纯出黑素颗粒分别与THP-1巨噬细胞共培养,检测THP-1巨噬细胞释放NO及ROS的水平,结果表明球形孢子丝菌分生孢子可刺激THP-1巨噬细胞释放NO及ROS,且NO释放水平随共孵育时间延长而增加,在共孵育4h时,MEL-组NO及ROS水平均显着高于MEL+组。检测球形孢子丝菌分生孢子刺激THP-1巨噬细胞分泌细胞因子的水平,结果表明THP-1巨噬细胞与MEL+分生孢子共孵育2h时,IL-6及IL-18水平显着性增高,但3h及4h时IL-18水平无显着性差异;4h时TNF-α水平显着性增高;但直至4h时IL-1β水平仍无显着性差异。THP-1巨噬细胞与MEL-分生孢子共孵育2h时,IL-6、IL-1β及IL-18水平均有显着性增高;3h时TNF-α水平也出现显着性增高。3h时,MEL-分生孢子刺激THP-1巨噬细胞分泌TNF-α及IL-18水平高于MEL+分生孢子;4h时,MEL-分生孢子刺激THP-1巨噬细胞分泌四种细胞因子水平均显着高于MEL+分生孢子。而单纯黑素对NO、ROS及细胞因子分泌均无显着性影响。实时荧光定量PCR及免疫蛋白印迹检测THP-1巨噬细胞TLR2、TLR4、NLRP3的表达,结果表明TLR2及TLR4表达增高,且TLR2表达高于TLR4,但NLRP3表达无明显变化。提示我们TLR2在巨噬细胞识别球形孢子丝菌的重要性,而黑素能够抑制THP-1巨噬细胞抵御球形孢子丝菌分生孢子的免疫效能。最后,采用si RNA方法对THP-1细胞进行TLR2分子的敲减,以验证TLR2在THP-1巨噬细胞识别球形孢子丝菌分生孢子及诱发后续炎症反应中的作用。结果表明THP-1巨噬细胞与球形孢子丝菌分生孢子共孵育4小时后,正常THP-1巨噬细胞对球形孢子丝菌分生孢子的吞噬指数为30.01±5.32,TLR2敲减的THP-1巨噬细胞对球形孢子丝菌分生孢子的吞噬指数为6.09±1.62,较正常组明显降低（p=0.00174）;正常THP-1巨噬细胞分泌TNF-α为（2475.93±245.12）pg/ml,IL-6为（743.75±55.34）pg/ml,较空白对照组显着性增高（p均<0.01）,而TLR2敲减的THP-1巨噬细胞分泌TNF-α为（1476.18±313.79）pg/ml,IL-6为（452.65±29.93）pg/ml,较空白对照组无显着性变化（p=0.951及0.068）。说明TLR2分子在识别以及介导分泌炎症因子以抵御球形孢子丝菌感染的过程中具有重要作用。本研究初步发现了孢子丝菌患者皮损内的免疫状态及差异表达基因,体外试验进一步阐明了黑素作为球形孢子丝菌的重要的毒力因子在抑制宿主免疫应答中的作用,确证了TLR2是宿主识别球形孢子丝菌的重要受体,为明确孢子丝菌病的发病机制提供了新的理论基础。
二、主要病原念珠菌蛋白酶分泌水平的比较（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、主要病原念珠菌蛋白酶分泌水平的比较（论文提纲范文）
（1）去泛素化酶OTUD1在抗真菌免疫反应中的功能与作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 综述：OTU家族去泛素化酶在免疫调控中的功能和机制 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文目录 |
| 发表论文一 |
| 发表论文二 |
| 原始结果附图 |
| 学位论文评阅及答辩情况报 |
（2）三个新MAPK调控通路控制罗伯茨绿僵菌穿透昆虫体壁或孢子发育的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1.文献综述 |
| 1.1 昆虫病原真菌致病机制的研究概述 |
| 1.1.1 昆虫病原真菌的致病过程 |
| 1.1.2 体壁降解酶及相关毒力因子 |
| 1.2 真菌碳氮源代谢调控机制的研究概述 |
| 1.2.1 碳代谢阻遏 |
| 1.2.2 氮代谢阻遏 |
| 1.3 真菌分生孢子发育的研究概述 |
| 1.3.1 真菌分生孢子发育过程 |
| 1.3.2 真菌孢子发育调控机制 |
| 1.4 MAPK信号转导通路的研究概述 |
| 1.4.1 MAPK信号转导通路 |
| 1.4.2 STE12 转录因子 |
| 1.4.3 MYB家族转录因子 |
| 2.引言 |
| 3.Fus3/RNS1 级联体调控罗伯茨绿僵菌穿透昆虫体壁 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 质粒与菌株 |
| 3.1.2 主要试剂与试剂盒 |
| 3.1.3 主要培养基 |
| 3.1.4 主要缓冲液 |
| 3.1.5 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 基因的敲除与回补 |
| 3.2.2 孢子萌发速率测定 |
| 3.2.3 酵母双杂交实验 |
| 3.2.4 蛋白质免疫共沉淀实验(Co-IP) |
| 3.2.5 双光子荧光互补实验(BiFC) |
| 3.2.6 Phos-tag实验 |
| 3.2.7 蛋白的原核表达与纯化 |
| 3.2.8 探针合成及退火步骤 |
| 3.2.9 电泳迁移率实验(EMSA) |
| 3.2.10 RNA-Seq与 qRT-PCR分析 |
| 3.2.11 ChIP-Seq与 ChIP-qPCR分析 |
| 3.2.12 亚细胞定位实验 |
| 3.2.13 氨基酸与多肽含量测定 |
| 3.2.14 胞外总蛋白酶与Pr1 酶活测定 |
| 3.2.15 几丁质酶与脂酶活性测定 |
| 3.2.16 罗伯茨绿僵菌基因组中启动子序列的提取 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 RNS1 在穿透体壁过程中的作用及表达规律 |
| 3.3.2 RNS1 在穿透体壁过程中受Fus3 磷酸化修饰 |
| 3.3.3 Fus3 介导的RNS1 的磷酸化促进其进入细胞核 |
| 3.3.4 转录因子RNS1 识别的DNA结合位点 |
| 3.3.5 磷酸化修饰后的RNS1 诱导自身的表达 |
| 3.3.6 RNS1 诱导体壁降解酶的表达 |
| 3.3.7 Fus3/RNS1 级联体调控罗伯茨绿僵菌利用非昆虫来源的复杂碳氮源营养物质 |
| 3.3.8 RNS1 调控烷烃、几丁质以及蛋白质利用相关基因的表达 |
| 3.3.9 RNS1与NMR和 CCR途径没有直接相关性 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4.Slt2/RNS1 调控孢子中心发育通路 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 真菌菌落形态观察 |
| 4.2.2 罗伯茨绿僵菌产孢结构观察 |
| 4.2.3 罗伯茨绿僵菌产孢量分析 |
| 4.2.4 5’RLM-RACE实验 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 RNS1 调控罗伯茨绿僵菌的孢子发育过程 |
| 4.3.2 RNS1 调控孢子中心发育通路 |
| 4.3.3 Slt2 正调控RNS1 介导的孢子发育过程 |
| 4.3.4 Slt2 在孢子发育过程中不调控RNS1 进入细胞核 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5.Fus3/MrSt12/AFTF1 级联体调控罗伯茨绿僵菌穿透昆虫体壁 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 质粒与菌株 |
| 5.1.2 主要试剂与试剂盒 |
| 5.1.3 主要培养基 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 附着胞形成速率测定 |
| 5.2.2 生物测定 |
| 5.2.3 酵母双杂交实验 |
| 5.2.4 Western blot分析 |
| 5.2.5 蛋白质免疫共沉淀实验(Co-IP) |
| 5.2.6 蛋白表达与纯化 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 在穿透体壁过程中MrSt12 正调控Aftf1 的表达 |
| 5.3.2 MrSt12 调控罗伯茨绿僵菌穿透昆虫体壁 |
| 5.3.3 MrSt12通过与Aftf1 启动子结合直接调控其表达 |
| 5.3.4 MrSt12与Fus3 互作 |
| 5.3.5 MrSt12 调控Aftf1 的过程依赖于Fus3 的磷酸化修饰 |
| 5.3.6 Fus3/MrSt12/AFTF1与Fus3/RNS1 级联体无直接相关性 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 6 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间的成果 |
（3）球孢白僵菌bZIP型转录因子BbHapX维持膜稳态及调控铁饥饿响应的生理机制（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Summary |
| 第一章 综述 |
| 1.1 球孢白僵菌分生孢子的物质累积与侵染生物学背景 |
| 1.2 铁稳态调控的意义 |
| 1.3 HapX调控铁稳态的研究进展 |
| 1.3.1 HapX响应铁饥饿调控保守系统的研究背景 |
| 1.3.2 HapX转录调控机制的研究进展 |
| 1.3.3 真菌HapX铁饥饿调控与生物学功能的研究进展 |
| 1.4 细胞膜稳态的研究进展 |
| 1.4.1 真菌膜脂合成代谢与膜稳态的研究进展 |
| 1.4.2 真菌细胞膜与细胞壁稳态的研究进展 |
| 1.4.3 真菌膜蛋白与细胞膜稳态的研究进展 |
| 1.4.4 真菌膜蛋白CFEM家族与铁饥饿调控的研究进展 |
| 1.5 研究内容和目标 |
| 第二章 BbHapX维持分生孢子膜稳态和细胞膜功能的机制 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 供试试剂 |
| 2.1.2 菌种培养 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 生物信息学分析 |
| 2.2.2 BbHapX和BbOle1基因敲除株及回补株的构建和鉴定 |
| 2.2.3 根瘤农杆菌介导的真菌转化以及球孢白僵菌转化子筛选与鉴定 |
| 2.2.4 分生孢子萌发表型测定 |
| 2.2.5 菌落生长速率测定 |
| 2.2.6 生物防治潜能测定 |
| 2.2.7 配比法凝胶阻滞实验 |
| 2.2.8 真菌胞内游离脂肪酸含量测定 |
| 2.2.9 脂质组学分析 |
| 2.2.10 Southern杂交 |
| 2.2.11 转录组学分析 |
| 2.2.12 活体细胞染色 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 BbHapX和BbOle1的生物信息学分析特征和分子操作 |
| 2.3.2 BbHapX对于真菌毒性至关重要 |
| 2.3.3 BbHapX参与启动脂质和FA代谢的基因 |
| 2.3.4 BbHapX对FA代谢稳态至关重要 |
| 2.3.5 外源油酸能恢复膜的完整性和毒力 |
| 2.3.6 BbHapX有助于真菌适应铁饥饿 |
| 2.3.7 BbOle1是转录因子BbHapX的直接靶标 |
| 2.3.8 磷脂稳态需要BbHapX和BbOle1 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 BbLip1参与脂滴的分解代谢以维持细胞膜脂稳态 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 供试试剂 |
| 3.1.2 菌株培养 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 BbLip1基因敲除株和回补株构建和鉴定 |
| 3.2.2 小量基因组DNA提取 |
| 3.2.3 真菌发育表型测定 |
| 3.2.4 活细胞脂滴染色及标记 |
| 3.2.5 酶解法凝胶阻滞实验 |
| 3.2.6 数据分析 |
| 3.2.7 其他实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 BbLip1蛋白的生物信息学特征及基因分子操作 |
| 3.3.2 BbLip1的缺失影响球孢白僵菌的毒力和生长发育 |
| 3.3.3 BbLip1参与真菌细胞膜完整性和通透性事件 |
| 3.3.4 BbHapX转录调控BbLip1参与细胞膜完整性事件 |
| 3.3.5 BbLip1参与脂滴的代谢 |
| 3.3.6 BbLip1参与真菌的营养生长和氧化胁迫 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 凝集素蛋白BbLec1参与细胞膜壁稳态的机制 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 供试试剂 |
| 4.1.2 菌种培养 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 生物信息学分析 |
| 4.2.2 突变株的构建和鉴定 |
| 4.2.3 膜系统酵母双杂 |
| 4.2.4 核系统酵母双杂 |
| 4.2.5 Pull Down |
| 4.2.6 质谱分析 |
| 4.2.7 扫描电镜 |
| 4.2.8 透射电镜 |
| 4.2.9 芽孢转化 |
| 4.2.10 Western Blotting |
| 4.2.11 几丁质提取及蛋白结合实验 |
| 4.2.12 寡糖微矩阵列分析 |
| 4.2.13 荧光载体构建与亚细胞定位 |
| 4.2.14 数据分析 |
| 4.2.15 其他方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 BbLec1的生物信息学分析和分子操作 |
| 4.3.2 BbHapX转录激活BbLec1 |
| 4.3.3 BbLec1的亚细胞定位 |
| 4.3.4 BbLec1与寡糖的结合特征 |
| 4.3.5 BbLec1是外分泌泡的组成部分 |
| 4.3.6 野生型、ΔBbLec1敲除株和回补菌株的生物学表型 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 BbCFEM家族响应铁饥饿调控的生理机制 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 供试试剂 |
| 5.1.2 菌种培养 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 生物信息学分析 |
| 5.2.2 BbCFEM家族基因突变株的构建和鉴定 |
| 5.2.3 真菌RNA提取及反转录 |
| 5.2.4 BbCFEM3、7和8的亚细胞定位 |
| 5.2.5 铁饥饿条件下的毒力测定 |
| 5.2.6 BbCFEM3、7和8之间的酵母双杂交验证 |
| 5.2.7 球孢白僵菌与其他真菌物种的竞争测定 |
| 5.2.8 数据分析 |
| 5.2.9 其他实验方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 BbCFEM家族的系统发育树构建和分子操作 |
| 5.3.2 BbCFEM家族的亚细胞定位 |
| 5.3.3 BbCFEM家族在真菌分化和发育方面的生物学表型 |
| 5.3.4 BbCFEM家族调控铁饥饿条件下真菌的生长 |
| 5.3.5 BbCFEM家族基因在不同铁饥饿程度下的毒力存在补偿效应 |
| 5.3.6 BbCFEM家族参与响应真菌抗氧化胁迫 |
| 5.3.7 BbCFEM家族在铁饥饿条件下与其他物种的竞争 |
| 5.3.8 高铁血红素铁能恢复BbCFEM7和8基因缺失造成的毒力丧失 |
| 5.3.9 BbCFEM3/7和BbCFEM8之间存在的分子生物学机制 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 结语 |
| 第七章 附记 |
| 参考文献 |
| 附录:攻读博士学位期间的主要成果 |
（4）球孢白僵菌特异性分泌的Laccase 2与病原菌逃避昆虫免疫反应的关系及作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 病原真菌侵染致病过程 |
| 1.2 昆虫免疫防御反应研究进展 |
| 1.2.1 昆虫行为及社会性免疫防御 |
| 1.2.2 角质层对病原真菌的免疫屏障 |
| 1.2.3 昆虫先天免疫研究进展 |
| 1.3 病原真菌逃避或抑制宿主免疫反应机制 |
| 1.3.1 病原真菌逃避宿主免疫识别机制 |
| 1.3.2 病原真菌控制宿主免疫机制研究 |
| 1.3.3 病原真菌攻击或对抗宿主免疫研究 |
| 1.4 漆酶及其功能研究 |
| 1.5 球孢白僵菌是研究病原与宿主互作的模式真菌之一 |
| 1.6 小结 |
| 2 引言 |
| 2.1 立题依据 |
| 2.2 技术路线 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 供试菌株 |
| 3.1.2 供试昆虫 |
| 3.1.3 主要载体 |
| 3.1.4 仪器设备 |
| 3.1.5 药品试剂及试剂盒 |
| 3.1.6 培养基及缓冲液 |
| 3.1.7 引物序列 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 DNA及 RNA提取 |
| 3.2.2 载体构建 |
| 3.2.3 遗传转化 |
| 3.2.4 转化子筛选及验证 |
| 3.2.5 菌株培养和保存 |
| 3.2.6 分生孢子悬浮液配制 |
| 3.2.7 RT-PCR及 RT-qPCR |
| 3.2.8 基因表达特性分析 |
| 3.2.9 Southern blot |
| 3.2.10 异源表达蛋白诱导及纯化 |
| 3.2.11 分泌蛋白收集及菌丝蛋白提取 |
| 3.2.12 蛋白定量 |
| 3.2.13 SDS-PAGE电泳及染色 |
| 3.2.14 Western blot |
| 3.2.15 BbLac2 酶活检测 |
| 3.2.16 不同形态细胞的收集 |
| 3.2.17 真菌生长及胁迫表型分析 |
| 3.2.18 分生孢子产量测定 |
| 3.2.19 分生孢子萌发率测定 |
| 3.2.20 真菌细胞表面特性检测 |
| 3.2.21 细胞膜染色观察 |
| 3.2.22 生物测定 |
| 3.2.23 昆虫免疫防御反应检测 |
| 3.2.24 统计分析 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 BbLac2 序列特征 |
| 4.2 BbLac2 表达特性分析 |
| 4.3 BbLac2 独立于合成卵孢菌素在真菌侵染早期高表达 |
| 4.4 BbLac2 位于虫菌体表面且可分泌至胞外 |
| 4.5 基因破坏、超量表达及回复互补菌株的筛选验证 |
| 4.6 破坏BbLac2 影响真菌生长发育 |
| 4.7 破坏及超量表达BbLac2 影响细胞表面特性 |
| 4.8 BbLac2 独立于卵孢菌素合成参与氧化胁迫反应 |
| 4.9 BbLac2 是球孢白僵菌的毒力因子 |
| 4.10 BbLac2 参与真菌逃避昆虫免疫反应 |
| 4.11 BbLac2 的蛋白特性 |
| 4.11.1 BbLac2 的酵母表达及纯化 |
| 4.11.2 BbLac2 的酶学特性研究 |
| 4.12 BbLac2 具有解毒活性氧的功能 |
| 4.13 BbLac2 通过竞争PO底物干扰其活性 |
| 4.14 BbLac2 影响昆虫Toll途径及抗菌肽基因的表达 |
| 5 讨论 |
| 5.1 BbLac2 帮助真菌解毒昆虫免疫应答产生的ROS |
| 5.2 BbLac2 干扰昆虫多酚氧化酶(PPOs)级联反应 |
| 5.3 BbLac2 遮蔽虫菌体表面PAMPs帮助真菌逃避昆虫免疫识别 |
| 6 主要结论、创新点及展望 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 论文不足与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录 Ⅰ 本文使用的引物 |
| 附录 Ⅱ BCA法蛋白浓度测定标准曲线 |
| 附录 Ⅲ H_2O_2荧光值标准曲线 |
| 附录 Ⅳ 球孢白僵菌芽孢子数量标准曲线 |
| 附录 Ⅴ BbLac2 的酵母表达及纯化 |
| 附录 Ⅵ BbLac2 酶学特性 |
| 附录 Ⅶ 攻读博士学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（5）分离自COPD患者Aspergillus lentulus毒力因子测定及宿主免疫反应机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 A.lentulus的分离、鉴定及毒力和毒力因子测定 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 主要仪器及试剂 |
| 1.3 内容与方法 |
| 1.4 质量控制 |
| 1.5 统计方法 |
| 1.6 技术路线图 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 A. lentulus作用于鼠树突状细胞后IL-1β 的表达 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 主要仪器及试剂 |
| 1.3 内容与方法 |
| 1.4 质量控制 |
| 1.5 统计方法 |
| 1.6 技术路线图 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 A.lentulus可能的宿主免疫反应机制研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 实验对象 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 质量控制 |
| 1.5 统计方法 |
| 1.6 技术路线图 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 致病真菌毒力因子研究新进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（6）白头翁汤正丁醇提取物改善VVC小鼠阴道黏膜屏障及主要组分小檗碱抑制白念珠菌黏附阴道上皮的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词 |
| 前言 |
| 第一部分 白头翁汤正丁醇提取物对外阴阴道念珠菌病小鼠阴道黏膜上皮屏障的影响 |
| 1 实验材料和仪器 |
| 1.1 实验菌株与药物 |
| 1.2 动物 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 主要溶液配制 |
| 1.5 仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 菌液配制 |
| 2.2 小鼠VVC模型的构建 |
| 2.3 药物治疗 |
| 2.4 小鼠阴道局部症状体征及活动状态观察 |
| 2.5 小鼠阴道涂片镜检(观察小鼠阴道分泌物中白念珠菌形态) |
| 2.6 小鼠阴道灌洗液真菌载荷计数 ( 平板法计数小鼠阴道灌洗液真菌载荷量) |
| 2.7 小鼠阴道黏膜组织病理学检测 |
| 2.8 组织学观察(HE染色、PAS染色、MT染色)VVC小鼠阴道黏膜上皮的完整性 |
| 2.9 免疫组化检测小鼠阴道黏膜上皮细胞黏蛋白(Mucin1、Mucin4)及β-防御素2 蛋白的表达 |
| 2.10 Westernblot法检测小鼠阴道黏膜上皮黏蛋白(Mucin1、Mucin4)及β-防御素2 蛋白水平 |
| 2.11 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 动物整体状态及阴道局部体征 |
| 3.2 BAEB对 VVC小鼠阴道分泌物中白念珠菌形态的影响 |
| 3.3 BAEB对 VVC小鼠阴道真菌载荷的影响 |
| 3.4 BAEB对 VVC小鼠阴道黏膜组织病变的影响 |
| 3.5 BAEB对 VVC小鼠阴道黏膜上皮完整性的影响 |
| 3.6 BAEB对 VVC小鼠阴道黏膜上皮细胞黏蛋白mucin1、mucin4及β-防御素2 表达的影响 |
| 3.7 BAEB对 VVC小鼠阴道黏膜上皮mucin1、mucin4和β-防御素2 蛋白水平的影响 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 白头翁汤正丁醇提取物主要组分盐酸小檗碱对白念珠菌黏附阴道上皮细胞的影响 |
| 1 实验材料和仪器 |
| 1.1 细胞 |
| 1.2 实验菌株与药物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要试剂与药物(母液)处理 |
| 1.5 实验仪器与实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养(复苏、换液、传代及冻存) |
| 2.2 A431 细胞浓度确定 |
| 2.3 不同时间段盐酸小檗碱最佳浓度确定与形态学观察 |
| 2.4 不同浓度的白念珠菌于不同时间对 A431 细胞黏附的影响 |
| 2.5 细胞分组 |
| 2.6 盐酸小檗碱对白念珠菌在不同时间黏附A431 细胞的影响 |
| 2.7 ELISA法检测盐酸小檗碱对白念珠菌在不同时间段刺激下A431 细胞分泌IL-2、IL-4 水平的影响 |
| 2.8 免疫荧光检测不同时间点 A431 细胞 ICAM-1 表达 |
| 2.9 Western blot 检测盐酸小檗碱干预白念珠菌不同时间点刺激下A431 细胞 ICAM-1、mucin-1、mucin-4 蛋白表达 |
| 2.10 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 A431 细胞最适浓度的确定 |
| 3.2 不同时间段盐酸小檗碱安全浓度的确定 |
| 3.3 盐酸小檗碱对细胞生长状态的影响 |
| 3.4 不同浓度的白念珠菌于不同时间对A431 细胞的黏附 |
| 3.5 盐酸小檗碱对白念珠菌在不同时间黏附A431 细胞的影响 |
| 3.6 盐酸小檗碱对A431 细胞在白念珠菌不同时间刺激下分泌IL-2、IL-4 水平的影响 |
| 3.7 盐酸小檗碱对A431 细胞在白念珠菌不同时间刺激下IL-2/IL-4比例的影响 |
| 3.8 盐酸小檗碱对A431 细胞在白念珠菌不同时间的刺激下黏附分子ICAM-1 表达的影响 |
| 3.9 盐酸小檗碱对A431 细胞在白念珠菌不同时间的刺激下ICAM-1、mucin-1、mucin-4 蛋白水平的影响 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 阴道黏膜屏障在抗感染中的作用 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（7）白色念珠菌重要毒性因子的电镜结构生物学研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 引言 |
| 第一部分 电镜单颗粒技术探究尿素酰胺水解酶分子机制 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 尿素酰胺水解酶概述 |
| 1.1.1 尿素酰胺水解酶与代谢 |
| 1.1.2 尿素酰胺水解酶与疾病 |
| 1.2 尿素酰胺水解酶结构 |
| 1.2.1 尿素羧化酶 |
| 1.2.2 脲基甲酸盐水解酶 |
| 1.3 “摆动域”模式介绍 |
| 1.4 电镜单颗粒技术 |
| 1.4.1 电镜结构生物学简介 |
| 1.4.2 电镜三维重构原理 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 第二章 KlUA蛋白电镜负染观察 |
| 2.1 电镜单颗粒技术流程 |
| 2.2 电镜负染制样 |
| 2.2.1 电镜负染制样技术简介 |
| 2.2.2 负染技术原理 |
| 2.2.3 负染剂及载网 |
| 2.2.4 载网支持膜亲水化处理 |
| 2.2.5 负染制样前准备 |
| 2.2.6 负染制样操作 |
| 2.3 电镜观察参数设置 |
| 2.3.1 透射电镜简介和所用电镜参数 |
| 2.3.2 透射电子显微镜调试 |
| 2.4 KlUA蛋白制备 |
| 2.5 KlUA+ADP+Urea、KlUA+ADP和KlUA-APO的负染观察 |
| 2.5.1 KlUA+ADP+Urea负染观察 |
| 2.5.2 KlUA+ADP负染观察 |
| 2.5.3 KlUA-APO的负染观察 |
| 2.6 结果分析 |
| 第三章 不同状态下KlUA蛋白的电镜三维重构 |
| 3.1 数据的收集及图像处理 |
| 3.1.1 数据收集 |
| 3.1.2 数据处理 |
| 3.2 结果分析 |
| 3.2.1 二维分类结果 |
| 3.2.2 三维重构结果 |
| 3.2.3 三维重构结果分析 |
| 第四章 总结与展望 |
| 第二部分 补体蛋白与白色念珠菌Pral蛋白的互作探究 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 补体系统概述 |
| 1.1.1 补体激活途径 |
| 1.1.2 补体调节系统 |
| 1.2 致病菌逃避补体免疫主要方式 |
| 1.3 Pral蛋白概述 |
| 1.4 Pral蛋白与免疫系统 |
| 1.5 补体途径上游关键蛋白概述 |
| 1.5.1 补体蛋白C2概述 |
| 1.5.2 补体蛋白C4概述 |
| 1.5.3 补体蛋白C3概述 |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验仪器 |
| 2.1.2 实验试剂与耗材 |
| 2.1.3 生物材料与质粒 |
| 2.2 主要溶液与配方 |
| 2.3 表达载体构建 |
| 2.3.1 几种常见的表达体系 |
| 2.3.2 蛋白表达系统选择 |
| 2.3.3 蛋白表达载体选择 |
| 2.3.4 载体构建实验步骤 |
| 2.4 质粒的扩增与提取 |
| 2.5 真核细胞培养 |
| 2.5.1 HEK293T细胞简介 |
| 2.5.2 HEK293T细胞培养 |
| 2.6 蛋白表达 |
| 2.6.1 原核细胞的诱导表达 |
| 2.6.2 真核细胞重组质粒的转染及蛋白的表达 |
| 2.7 目的蛋白的纯化 |
| 2.7.1 蛋白纯化常用方法 |
| 2.7.2 Pral纯化 |
| 2.7.3 C2/hC4的纯化 |
| 2.7.4 C3/sC4的纯化 |
| 2.8 SDS-PAGE检测 |
| 2.9 BN-PAGE检测 |
| 2.10 二向电泳检测 |
| 2.11 WB蛋白鉴定和分析 |
| 2.12 质谱蛋白鉴定和分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 实验所需蛋白的纯化 |
| 3.1.1 载体构建 |
| 3.1.2 蛋白纯化 |
| 3.1.3 小结 |
| 3.2 Pral蛋白与经典途径上游关键蛋白的互作分析 |
| 3.2.1 Pral蛋白与上游补体蛋白互作分析 |
| 3.2.2 金属离子对Pral与补体蛋白结合的影响 |
| 3.2.3 小结 |
| 3.3 Pral蛋白特性分析 |
| 3.3.1 Pral蛋白的抗还原能力检测 |
| 3.3.2 金属离子对Pral蛋白多聚体形成的影响 |
| 3.3.3 小结 |
| 3.4 Pral蛋白结构预测和分析 |
| 3.4.1 一级结构分析 |
| 3.4.2 二级结构预测 |
| 3.4.3 三级结构预测 |
| 3.4.4 小结 |
| 3.5 C3蛋白电镜负染观察及三维重构 |
| 3.5.1 C3蛋白电镜负染观察 |
| 3.5.2 C3蛋白数据收集及三维重构 |
| 3.5.3 C3蛋白三维重构结果分析 |
| 3.6 C3-Pral复合物制备的摸索 |
| 3.6.1 复合物形成条件的摸索 |
| 3.6.2 Pral与C3分子作用机制的初步分析 |
| 3.6.3 小结 |
| 第四章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
| 附录 |
（8）絮状表皮癣菌基因组、转录组及与宿主相互作用机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 絮状表皮癣菌体外酶解反应及分子分型研究 |
| 前言 |
| 第一节 探讨絮状表皮癣菌种内形态和酶解反应差异 |
| 第二节 絮状表皮癣菌多基因位点种内分型研究 |
| 第三节 絮状表皮癣菌AFLP种内分型研究 |
| 第二章 絮状表皮癣菌基因组学及比较基因组学研究 |
| 前言 |
| 第一节 絮状表皮癣菌基因组学数据分析研究 |
| 第二节 絮状表皮癣菌比较基因组学分析研究 |
| 第三章 絮状表皮癣菌转录组学分析研究 |
| 前言 |
| 第一节 絮状表皮癣菌体外转录组分析研究 |
| 第二节 絮状表皮癣菌与HaCaT细胞互作转录组分析研究 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 论文相关综述 互作转录组（dual RNA-seq)技术在病原真菌中的应用及展望 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表文章 |
| 参加学术会议 |
| 致谢 |
（9）生物材料表面真菌-细菌混合生物膜中持留菌的形成及其持留机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表(以字母顺序排列) |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 第一部分 诱导生物材料表面真菌-细菌混合生物膜中持留菌形成 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 生物材料表面真菌-细菌混合生物膜中持留菌的持留机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 持续性感染与持留菌细胞 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（10）球形孢子丝菌诱导THP-1巨噬细胞免疫应答的初步研究及黑素对其免疫功能的影响（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 孢子丝菌病及其病原体——申克孢子丝菌复合体 |
| 1.2 中国及吉林省孢子丝菌病近况 |
| 1.3 孢子丝菌的毒力因素研究现状 |
| 1.3.1 双相性 |
| 1.3.2 耐热性 |
| 1.3.3 蛋白酶 |
| 1.3.4 细胞壁表面成分 |
| 1.3.5 黑素 |
| 1.4 机体抗孢子丝菌免疫研究现状 |
| 第2章 孢子丝菌病患者皮损免疫状态的初步研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料和试剂 |
| 2.2.1 主要仪器设备 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.3 临床标本 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 实时荧光定量PCR检测相关基因表达分布 |
| 2.4.2 免疫组化染色 |
| 2.4.3 免疫蛋白印迹 |
| 2.4.4 统计分析 |
| 2.5 实验结果 |
| 2.5.1 临床标本来源 |
| 2.5.2 孢子丝菌病患者皮损内真菌感染相关基因表达情况 |
| 2.5.3 皮损内相关炎性因子的免疫组化 |
| 2.5.4 皮损内相关模式识别受体蛋白表达情况 |
| 2.6 讨论 |
| 2.7 总结 |
| 第3章 THP-1 巨噬细胞抗球形孢子丝菌的免疫机制及黑素对其功能的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料和试剂 |
| 3.2.1 主要仪器设备 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 主要培养基的配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 THP-1 细胞复苏及培养 |
| 3.3.2 PMA诱导THP-1 分化为巨噬细胞 |
| 3.3.3 菌株 |
| 3.3.4 突变菌株的鉴定 |
| 3.3.5 分生孢子悬液的制备 |
| 3.3.6 孢子丝菌黑素颗粒的制备 |
| 3.3.7 THP-1 巨噬细胞对分生孢子吞噬及杀伤效应 |
| 3.3.8 流式细胞术检测THP-1 巨噬细胞内ROS水平 |
| 3.3.9 NO试剂盒检测THP-1 巨噬细胞NO水平 |
| 3.3.10 ELISA试剂盒检测THP-1 巨噬细胞分泌细胞因子水平 |
| 3.3.11 实时荧光定量PCR检测THP-1 巨噬细胞TLR2、TLR4、NLRP3的表达 |
| 3.3.12 免疫蛋白印迹检测THP-1 巨噬细胞TLR2、TLR4、NLRP3蛋白表达情况 |
| 3.3.13 统计分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 PMA诱导THP-1 分化为巨噬细胞 |
| 3.4.2 突变白化菌株(MEL-)的鉴定 |
| 3.4.3 THP-1 巨噬细胞对分生孢子的吞噬效应 |
| 3.4.4 THP-1 巨噬细胞对分生孢子的杀伤效应 |
| 3.4.5 THP-1 巨噬细胞与球形孢子丝菌共孵育后细胞内ROS水平 |
| 3.4.6 THP-1 巨噬细胞与球形孢子丝菌共孵育后释放NO水平 |
| 3.4.7 THP-1 巨噬细胞分泌细胞因子水平 |
| 3.4.8 实时荧光定量PCR检测THP-1 巨噬细胞TLR2、TLR4、NLRP3的表达 |
| 3.4.9 免疫蛋白印迹检测THP-1 巨噬细胞TLR2、TLR4、NLRP3蛋白表达情况 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 总结 |
| 第4章 THP-1 巨噬细胞TLR2在球形孢子丝菌感染免疫中的作用机制 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料和试剂 |
| 4.2.1 主要仪器设备 |
| 4.2.2 主要试剂及抗体 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 THP-1 细胞转染 |
| 4.3.2 分生孢子悬液的制备 |
| 4.3.3 THP-1 巨噬细胞的吞噬效应 |
| 4.3.4 ELISA试剂盒检测THP-1 巨噬细胞分泌细胞因子水平 |
| 4.3.5 统计分析 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 siRNA干扰技术建立TLR2低表达的THP-1 巨噬细胞模型 |
| 4.4.2 TLR2敲减后THP-1 巨噬细胞对球形孢子丝菌吞噬指数的变化 |
| 4.4.3 TLR2对THP-1 巨噬细胞感染球形孢子丝菌后分泌TNF-α及IL-6 的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 总结 |
| 第5章 结论 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 本研究的创新点包括 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
四、主要病原念珠菌蛋白酶分泌水平的比较（论文参考文献）
- [1]去泛素化酶OTUD1在抗真菌免疫反应中的功能与作用机制研究[D]. 陈小荣. 山东大学, 2021(11)
- [2]三个新MAPK调控通路控制罗伯茨绿僵菌穿透昆虫体壁或孢子发育的研究[D]. 孟亚民. 浙江大学, 2021(01)
- [3]球孢白僵菌bZIP型转录因子BbHapX维持膜稳态及调控铁饥饿响应的生理机制[D]. 彭跃进. 浙江大学, 2021
- [4]球孢白僵菌特异性分泌的Laccase 2与病原菌逃避昆虫免疫反应的关系及作用机制[D]. 鲁卓越. 西南大学, 2021
- [5]分离自COPD患者Aspergillus lentulus毒力因子测定及宿主免疫反应机制研究[D]. 张丽娟. 新疆医科大学, 2021(08)
- [6]白头翁汤正丁醇提取物改善VVC小鼠阴道黏膜屏障及主要组分小檗碱抑制白念珠菌黏附阴道上皮的作用研究[D]. 赵婷. 安徽中医药大学, 2021(01)
- [7]白色念珠菌重要毒性因子的电镜结构生物学研究[D]. 刘颖. 兰州大学, 2020(04)
- [8]絮状表皮癣菌基因组、转录组及与宿主相互作用机制的研究[D]. 刘加. 北京协和医学院, 2020(05)
- [9]生物材料表面真菌-细菌混合生物膜中持留菌的形成及其持留机制研究[D]. 向柄全. 昆明医科大学, 2020
- [10]球形孢子丝菌诱导THP-1巨噬细胞免疫应答的初步研究及黑素对其免疫功能的影响[D]. 姚蕾. 吉林大学, 2020(08)