一、细菌内构建复制缺陷型人肝细胞生长因子重组腺病毒及其对胎肝细胞细胞周期的影响（论文文献综述）
宋修光[1]（2012）在《1.3倍乙型肝炎病毒全基因质粒在SV40T永生化小鼠肝细胞中的表达》文中认为研究背景乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）是嗜肝DNA病毒属的一员。HBV可以引起肝脏的急、慢性感染,HBV的慢性感染是引起严重肝脏疾病的主要病因。据世界卫生组织报道,全球20多亿人曾感染乙肝病毒,其中3.5亿以上为慢性乙型肝炎病毒感染者。慢性乙型肝炎不易彻底治愈,并且具有发展成肝硬化、肝癌的高度危险性。慢性乙型肝炎（CHB）是一个严重的公共卫生问题,每年全世界范围内约有一百万人死于慢性乙型肝炎感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝细胞肝癌。我国约有超过50%的居民曾被乙型肝炎病毒感染过,其中8%-15%的人成为慢性感染者。慢性乙型肝炎（CHB）治疗的目标是要实现的持续抑制HBV的复制,缓解肝脏疾病。乙型肝炎的治疗取决于几个因素,如疾病的阶段,“e”抗原的存在或缺失、耐药性、特别是在肝脏慢性疾病的终末期后期无有效药物治疗。因此,在治疗时机的选择及治疗过程中对以上因素的评价是非常重要的。干扰素a-2a（IFN2a）和干扰素α-2b干扰素（IFN2b）作为首选的治疗CHB已使用多年,治疗的目标是HBeAg血清转换,以激活免疫反应,改变免疫状态,目的是清除乙肝病毒DNA （HBVDNA）缓解疾病。然而,治疗费用昂贵且有许多副作用,如贫血、血红蛋白下降、恶心、呕吐,出冷汗等。而且仅约1/3患者用α-干扰素治疗持续应答。此外,核苷类似物不能完全消除病毒,并可能导致病毒基因突变。因此,开发新的抗病毒治疗药物仍然是一个重大的科研任务。但由于缺乏合适的HBV感染细胞模型或小动物模型来评价新的治疗策略而使CHB的治疗受到阻碍。目前,HepG2.2.15细胞系是最常用的体外研究HBV的细胞模型,HepG2.2.15细胞系作为公认的HBV全基因稳定表达细胞系,能支持HBV的复制,分泌感染性病毒颗粒。但因病毒基因以较为固定的拷贝数整合于宿主细胞染色体,表达水平低,其作为体外HBV感染细胞模型,尤其是作为抗病毒药物筛选和研究耐药突变株生物学特征的感染模型,受到了一定的局限。目前仍然迫切需要建立一个体外细胞培养或试验动物模型来帮助我们理解HBV感染中病毒-宿主相互作用,确定病毒突变体的致病性,检测新的抗病毒药物和对慢性感染治疗方法的选择。应用病毒基因的转导使细胞永生化是建立连续传代细胞系的一种方法。将SV40早期转录区基因导入细胞内是最常用的细胞永生化的方法,几乎适用于各种人类细胞类型。通过对SV40T基因介导的永生化细胞系的深入研究,多数研究结果显示SV40T基因的导入除提高转化细胞的生长速率外,能保留其原始细胞的许多分化表型,而非原始基因的表达很少见,在细胞水平上可反映其原始细胞的生物学特性,可作为体外研究的模型。1.3拷贝HBVDNA质粒含HBV完整复制体,基因组小于2.0拷贝,且复制和表达效率高于1.2和1.1拷贝,包含了HBV5’末端Enh Ⅰ、Enh Ⅱ,复制起始区（DR1、DR2）、前基因组转录起始位点x和前C区启动子,x开放读码框等,所以应用的最多。本研究的目的是构建SV40T永生化小鼠肝细胞系,观察1.3倍全基因HBV真核细胞表达质粒（pHBV1.3）在其细胞中的表达。希望能建立一种新型的HBV体外细胞模型。第一部分SV40T永生化小鼠肝细胞系的建立[目的]建立SV40T永生化小鼠肝细胞系,以作为后续实验研究的基础。[方法]1、建立SV40T永生化小鼠肝细胞系。1.1、原代小鼠肝细胞的分离与培养。1.2、SV40T基因质粒（pRSV-T）扩增及抽提。1.3、利用脂质体lipofectamine2000介导pRSV-T质粒转染原代培养小鼠肝细胞。2、SV40T永生化小鼠肝细胞系的检测。2.1、SV40T抗原检测：通过间接免疫荧光法检测SV40T抗原在小鼠肝细胞内的分布情况。2.2、形态学观察：在倒置相差显微镜下观察原代鼠肝细胞和SV40LT抗原永生化小鼠肝细胞的形态,同时在电子显微镜下对两种细胞进行超微结构观察。2.3、绘制原代及SV40T永生化小鼠肝细胞生长曲线,了解细胞生长周期。2.4、生化检测：测定原代及SV40T永生化小鼠肝细胞培养上清液中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、甲胎蛋白（AFP）的含量。2.5、RT-PCR检测肝细胞系中ALB-mRNA的表达。2.6、免疫印迹法（Western blot）检测转染细胞CK-18的免疫反应性。[结果]1、原代小鼠肝细胞的培养和转染：直接胶原酶消化法分离的肝细胞培养后,倒置相差显微镜下原代小鼠肝细胞形态扁平、呈多边形、通常多个细胞成串簇状排列,细胞呈单层贴壁、铺满瓶底。原代培养小鼠肝细胞经脂质体转染SV40L T抗原和50μ g/ml氨苄青霉素（Amp）筛选,于转染后30天出现一明显的上皮细胞样抗Amp的阳性克隆细胞。其余脂质体组和空白对照组细胞已大多死亡。2、SV40T抗原检测：转染后SV40T抗原免疫荧光逐渐增强,至转染后30天时可见明显荧光。胞浆内呈磨砂样荧光,细胞核内呈颗粒状荧光。3、转染肝细胞形态：原代及转染小鼠肝细胞均呈单层贴壁生长,形态呈上皮细胞样,原代小鼠细胞增殖缓慢,传代一次需7-9d。永生化小鼠肝细胞增殖明显比原代快,传代一次只需4-5d。在电子显微镜下,转染肝细胞与正常原代培养小鼠肝细胞相比无明显差异,呈典型的肝细胞形态与结构,细胞内丰富的糖原颗粒和大量的线粒体以及内质网结构清晰可见；细胞膜外可见典型的微状突起物；正在进行分裂的双核仁细胞体现了转染肝细胞体外增殖分化的过程。4、细胞生长曲线：在含10%的胎牛血清培养基中原代小鼠肝细胞生长缓慢,原代小鼠肝细胞在接种后第7天细胞增殖减缓。第8天开始出现细胞死亡。转化后的细胞于接种后第3-4日起增殖减缓,第5天开始出现细胞死亡。5、生化检测：原代及SV40T永生化小鼠肝细胞培养液上清液中ALT、AST、AFP的含量变化差异无显着性（P>O.05）。6、RT-PCR检测转染肝细胞中ALB mRNA的表达：对原代和转染小鼠肝细胞进行总RNA抽提和一步法RT-PCR扩增ALB-mRNA,结果2个标本在475bp处均出现明亮条带,表明转染肝细胞具有表达ALB mRNA的能力。7、Wostern blot检测原代、转染小鼠肝细胞角蛋白18（CK-18）免疫反应性：对原代、转染小鼠肝细胞进行蛋白质提取,经SDS-PAGE、Western blot检测,目的条带细胞CK-18显色均呈阳性,表明原代、转染肝细胞均具有CK-18免疫反应性。[结论]1、pRSV-T质粒可以使小鼠肝细胞永生化,建立SV40T永生化小鼠肝细胞系。2、SV40T永生化小鼠肝细胞系具有原代小鼠肝细胞形态、生长特性及功能,且在体外可以传代培养。可以进一步用来研究建立适宜于HBV感染的细胞模型。到目前为止,经过了五年多的冻存复苏和传代培养,SV40T永生化小鼠肝细胞已经传代50代次,传代、复苏和冻存不改变细胞的形态及增殖能力,细胞形态和生长特性没有明显改变。第二部分pHBV1.3质粒在SV40T永生化小鼠肝细胞系的表达[目的]观察pHBV1.3质粒在SV40T永生化小鼠肝细胞系的表达,希望能建立一种新型的HBV体外细胞模型。[方法]1、pHBV1.3质粒转染SV40T永生化小鼠肝细胞系：按脂质体转染试剂盒lipofectamine2000说明将pHBV1.3质粒转染SV40T永生化小鼠肝细胞系22代。2、pHBV1.3质粒在永生化小鼠肝细胞中的表达2.1、HBsAg及HBeAg的检测：用Abbott的AXSYM自动免疫分析仪及其配套的微粒子酶免分析法（MEIA）诊断试剂盒对转染细胞上清液进行HBsAg、HBeAg检测。2.2、间接免疫荧光检测细胞内HBsAg、HBcAg的表达：将SV40T永生化鼠肝细胞系22代细胞接种于24孔板,转染后24、48、72h用PBS洗涤细胞,4%多聚甲醛固定,按试剂盒说明进行免疫荧光检测,兔抗一HBc以1：500稀释,鼠抗一HBs1：50稀释。2.3、Southern blot:提取转染后72h细胞内总DNA并纯化。将纯化的DNA样本点样于1%琼脂糖凝胶上电泳后,转移至硝酸纤维素膜上与地高辛标记的3.2KB全长HBVDNA探针杂交。地高辛标记及Southern试剂盒购于罗氏,方法按说明进行。2.4、透射电镜检测pHBVl.3质粒转染小鼠肝细胞培养液中HBV病毒颗粒：收集转染后72小时培养上清液,280000×g,4℃超速离心5小时弃去上清,沉淀用100μ L TN缓冲液溶解混匀。滴于有支持膜（0.3%Formvar）的铜网上,2%磷钨酸负染2分钟,室温中干燥30分钟,JEOL透射电镜（JEM-1200EX Electron Microscope）观察,拍照。[结果]1、转染24h后,细胞上清液中可检出HBsAg、HBeAg,72h达到高峰,96h呈下降趋势。转染细胞传代后细胞上清液中HBsAg、HBeAg呈下降趋势。传代至第4代时HBsAg、HBeAg均为阴性。2、转染24小时后,有HBsAg和HBcAg阳性细胞出现,72h细胞表达最强。HBsAg主要呈胞浆内弥漫性分布,HBcAg为核浆型分布,以浆型为主。3、Southern杂交检测转染细胞内HBVDNA的复制：转染后72h,转染细胞中存在3.5KB、2.4KB、2.1KB病毒复制中间体。4、电镜结果：收集转染后72小时细胞培养上清,超速离心后,沉淀用2%磷钨酸负染,JEM-1200EX透射电镜观察。电镜下可以见到少量直径42nm的双层壳状Dane颗粒和较多的直径22nm的小球型颗粒及少量丝状颗粒。[结论]经SV40T抗原转染的小鼠肝细胞系可以被pHBV1.3质粒二次转染,转染后HBV可以在SV40T抗原转染的永生化小鼠肝细胞内进行病毒基因的复制,形成病毒复制中间体。并且进一步进行病毒基因的表达,合成HBV特异性蛋白HBsAg、 HBeAg和HBcAg; pHBV1.3质粒转染后永生化小鼠肝细胞能合成子代病毒颗粒并分泌出细胞。总结本研究结果证实,pRSV-T质粒可以使小鼠肝细胞永生化,建立SV40T永生化小鼠肝细胞系。SV40T永生化小鼠肝细胞系具有原代小鼠肝细胞形态和生长特性,且在体外可以传代培养。且可以被pHBVl.3质粒二次转染,转染后乙型肝炎病毒可以在SV40T抗原转染的永生化小鼠肝细胞内进行病毒基因的复制,形成ssDNA、dsDNA和rcDNA病毒复制中间体,且进一步进行病毒基因的表达,合成HBV特异性蛋白HBsAg、HBeAg和HBcAg；pHBV1.3质粒转染后永生化小鼠肝细胞能合成子代病毒颗粒并分泌出细胞。SV40T永生化小鼠肝细胞可以作为一个新型的适宜于HBV瞬时转染的细胞模型,为体外抗病毒药物筛选提供新的细胞模型。观察了HBVDNA在小鼠肝细胞内的复制情况,为建立人HBVDNA转染跨种属肝细胞模型奠定基础。
黄海燕[2]（2011）在《表达Apoptin基因重组腺病毒对肝癌细胞BEL-7402及转移模型的抑制作用》文中指出就基因治疗病毒载体而言,根据其复制特征可分为复制型病毒载体和复制缺陷型病毒载体。上述两种病毒载体均具有将目的基因导入癌变细胞的功能,但只有前者体现出溶瘤活性。已有利用携带野生型p53基因的复制缺陷型腺病毒治疗恶性脑胶质瘤的报道。在这项研究中,复制缺陷型腺病毒通过瘤内注射的方式导入肿瘤组织。在所有接受治疗的患者体内,均检测到外源p53基因的表达,这些p53基因大多表达于肿瘤细胞的细胞核内,并且具有诱导靶细胞凋亡的功能。然而,这些复制缺陷型腺病毒仅能够在注射部位5mm范围内检测至其存在。与复制缺陷型腺病毒相反,复制型腺病毒则具有提供持续感染、复制和表达外源基因的能力。腺病毒已被证实是一种通用的、有效的,且已得到广泛应用的基因治疗载体。这种病毒载体具有滴度高、外源基因载量大等特点。另外,这些载体可以在感染的肿瘤细胞内复制并表达外源基因,从而最终导致肿瘤细胞的裂解。事实上,现有的基因治疗项目中有近四分之一应用腺病毒载体。总之,腺病毒是一种最为常用的人类基因治疗载体。条件复制型腺病毒（Conditionally-replicative adenovirus, CRAd）是一种能够选择性的在肿瘤细胞内复制并杀伤肿瘤细胞的基因工程重组病毒,对正常细胞无作用。CRAd的最大优势也就在于其特异性的在肿瘤细胞复制的功能。病毒在细胞内复制的最终结果是子代病毒的产生和细胞的溶解,而所产生的子代病毒能够继续感染周围的细胞,这也就能够解释为何复制型腺病毒具有更高的抑瘤活性。通过操作腺病毒的复制过程可以进一步提升CRAd的肿瘤特异性复制能力。提高CRAd肿瘤趋向性的策略很多,主要包括以下几种：一是缺失腺病毒基因组中有关在肿瘤细胞内复制的相关序列；二是利用肿瘤特异性启动子使其能够在肿瘤细胞内特异性复制。为探讨CAV Apoptin的抗肿瘤特征,本研究利用表达Apoptin的重组腺病毒,针对人肝癌细胞BEL-7402和小鼠肝癌细胞H22进行了体内、体外抑瘤实验研究。我们利用MTT染色、AO/EB染色、DAPI染色和Annexin V等方法探讨了含CAV Apoptin重组腺病毒的体外抑瘤作用；通过对线粒体膜电位和活性氧水平的检测分析了含CAVApoptin重组腺病毒对肝癌细胞BEL-7402施加影响的信号途径。另外,本研究还在小鼠荷肝癌实体瘤模型和小鼠荷肝癌肺转移模型基础上,通过分析模型动物平均生存期、肿瘤生长趋势、抑瘤率、NK活性、CTL活性和细胞因子水平,对含CAV Apoptin重组腺病毒的体内抑瘤作用进行了探讨。体外实验结果表明,含CAV Apoptin重组腺病毒能够通过诱导细胞凋亡有效抑制肿瘤细胞增殖。体内实验结果表明,表达CAVApoptin重组腺病毒虽然不能完全抑制体内肿瘤细胞的生长,但在实体瘤模型动物和转移瘤模型动物体内均发现其具有肿瘤抑制作用。
王鹏[3]（2011）在《表达His-tag-ICP47融合基因腺病毒载体的构建及其免疫活性的研究》文中进行了进一步梳理研究背景：器官移植是治疗终末期器官疾病的重要方法之一,但供源缺乏和排斥反应是困扰器官移植的两大难题。肝细胞移植（hepatocyte transplantation, HT）最大的优点是可以一肝多用,使更多的人得到移植机会,降低等待肝源时的死亡率,因此有可能取代原位肝移植（orthotopic liver tranplantation, OLT）用于终末期肝脏疾病患者,但免疫排斥仍是HT需要解决的一个重要问题。随着现代基因工程的发展,具有免疫逃逸功能的转基因肝细胞成为HT的研究热点。腺病毒载体能够将外源基因安全而高效地转染入多种细胞,因此被广泛地应用于基因治疗的各个领域,但宿主对基因表达产物的排斥反应严重地限制了基因治疗的发展,临床现有的免疫抑制剂并不总是有效,而且毒副作用大。因此,降低或消除机体对外源基因表达产物及其转染细胞的免疫反应,成为长期基因治疗中的研究热点。主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex, MHC）抗原呈递途径在免疫排斥方面的研究中越来越引起人们的关注,阻断MHCⅠ-抗原肽复合物的表达,成为诱导免疫耐受的研究热点。MHCⅠ限制性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes, CTL）在病毒感染中发挥着重要作用,干扰感染细胞表面MHCⅠ类分子抗原呈递途径来逃避宿主免疫清除的策略被许多病毒所利用。单纯疱疹病毒Ⅰ型（herpes simplex virus I, HSV-1）基因编码的立即早期感染性细胞蛋白47（infected cell protein 47,ICP47）能与抗原多肽竞争抗原加工相关转运子（transporter associated with antigen presentation,TAP）的肽结合位点,有效地降低CTL的识别和杀伤活性,逃逸宿主的免疫清除。因此,本研究构建了一种表达His-tag-ICP47融合基因的腺病毒载体,并研究其免疫活性,以期能够为研究机体免疫耐受机制和基因治疗提供重要的探索方向。此外,这些研究可能为拓展病毒免疫学领域,探索病毒和宿主免疫系统之间的相互作用提供了新的研究方向,并为临床疾病的治疗和预防拓展了更广阔的空间。第一部分表达His-tag-ICP47融合基因腺病毒载体的构建目的：构建表达His-tag-ICP47融合基因的重组腺病毒,并且进行扩增和滴度测定,以便用于其免疫活性的实验研究。方法：应用AdEasy-1月泉病毒表达载体系统构建表达His-tag-ICP47融合基因的重组腺病毒r-H-ICP47和对照空载重组腺病毒r-Track。His-tag-ICP47融合基因首先克隆到pAdTrack-CMV载体上,用PmeⅠ酶切后与腺病毒骨架载体pAdEasy-1在BJ5183菌内同源重组构建重组腺病毒载体pAdEasy-H-ICP47,PacⅠ酶切线性化后,重组腺病毒载体pAdEasy-H-ICP47在293细胞内包装为重组腺病毒r-H-ICP47。以同样的方法构建对照空载重组腺病毒r-Track。最终,扩增并检测病毒滴度。结果：重组腺病毒r-H-ICP47和r-Track构建成功并且具有良好的感染性,可以在293细胞中包装成病毒颗粒。重组腺病毒r-H-ICP47和r-Track的滴度测定结果分别为3.7×1010efu/mL和4.4x 1010efu/mL结论：复制缺陷型重组腺病毒r-H-ICP47和r-Track成功构建,病毒滴度高,能够在细胞内有效地转染和表达,能够满足下一步免疫活性研究的要求。第二部分表达His-tag-ICP47融合基因重组腺病毒的免疫活性研究目的：观察表达His-tag-ICP47融合基因重组腺病毒的免疫活性。方法：1.重组腺病毒r-H-ICP47或r-Track转染HL-7702肝细胞,测定对HL-7702细胞的转染效率,并用MTT法测定CTL对转染HL-7702细胞的杀伤活性。2.以健康人外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）为来源,体外诱导培养树突状细胞（dendritic cells, DCs）,测定重组腺病毒r-H-ICP47或r-Track对转染DCs的转染效率,并且采用MTT法测定第24h、48h和72h时重组腺病毒r-H-ICP47或r-Track对转染DCs刺激淋巴细胞增殖活性的影响。3.重组腺病毒r-H-ICP47或r-Track转染淋巴细胞,测定转染效率,并进行双向混合淋巴细胞反应（Two-way mixed lymphocyte reaction, Two-way MLR）,采用ELISA法分别于第2d、第4d和第6d测定各组MLR上清液中白细胞介素-2 （Interleukin-2, IL-2）和穿孔素（perforin, PF）的浓度。结果：1.重组腺病毒r-H-ICP47和r-Track均能高效转染HL-7702肝细胞株,感染效率随着感染复数（multiplicity of infection, MOI）升高而升高。当MOI为100时,重组腺病毒r-H-ICP47和r-Track对HL-7702细胞的转染效率（86.87±3.14%和90.32±2.25%）均明显高于MOI为50的转染效率（29.52±5.22%和32.12±2.27%）（P<0.05）,而与MOI为200的转染效率（88.53±3.69%和90.64±3.65%）无显着性差异（P>0.05）。当MOI为100的重组腺病毒r-H-ICP47或r-Track转染HL-7702肝细胞后,进行CTL杀伤活性实验,结果显示,与r-track组和正常对照组相比,r-H-ICP47组能明显降低CTL对转染HL-7702细胞的杀伤活性（P<0.05）。2.重组腺病毒r-H-ICP47和r-Track对DCs的感染效率随着MOI升高而升高,当MOI为100时,重组腺病毒r-H-ICP47和r-Track对DCs的转染效率（86.92±2.76%和84.08±2.62%）均明显高于MOI为50的转染效率（30.32±3.08%和23.70±3.23%）（P<0.05）,而与MOI为200的转染效率（91.26±2.59%和87.51士2.41%）无显着性差异（P>0.05）。MTT检测结果显示,与重组腺病毒r-Track组和正常对照组相比,在培养的第48h和第72h,重组腺病毒r-H-ICP47能够较明显地降低转染DCs刺激淋巴细胞增殖的能力（P<0.05）,而在第24h时,DCs刺激淋巴细胞的增殖活性在3组之间均无明显差异（P>0.05）。3.重组腺病毒r-H-ICP47和r-Track对淋巴细胞的感染效率随着MOI升高而升高,当MOI为100时,重组腺病毒r-H-ICP47和r-Track对淋巴细胞的转染效率（87.11±3.29%和82.21±4.01%）均明显高于MOI为50的转染效率（25.54±4.07%和27.67±2.31%）（P<0.05）,而与MOI为200的转染效率（89.75±2.92%和85.99±3.02%）无显着性差异（P>0.05）。Two-way MLR分为5组,D-R-ICP47、D-ICP47组、D-R-Track组、D-Track组和正常对照组,分别用MOI为100的重组腺病毒r-H-ICP47或r-Track转染供体（D）或受体（R）的淋巴细胞后进行Two-way MLR培养,采用ELISA法分别在第2d、第4d和第6d检测MLR上清液中IL-2和PF的浓度。结果显示在各个时间段D-R-ICP47组IL-2和PF的浓度均明显低于其余4组（P<0.05）,并且D-ICP47组IL-2和PF的浓度也低于D-R-Track组、D-Track组和正常对照组（P<0.05）。结论：1.表达His-tag-ICP47的重组腺病毒能够安全、高效地转染HL-7702细胞、DCs和淋巴细胞,并达到理想的表达水平。2.表达His-tag-ICP47融合基因的重组腺病毒能够有效地降低CTL对转染HL-7702肝细胞的特异性杀伤活性,降低转染DCs刺激淋巴细胞增殖的能力和Two-way MLR上清液中IL-2和PF的表达程度。这些结果在一定程度上可预测His-tag-ICP47融合基因能够降低机体对转染细胞和腺病毒载体排斥反应发生的程度,提示表达His-tag-ICP47融合基因的腺病毒载体及其转染细胞能够介导免疫耐受,达到外源基因长期表达的目的。
郭燕菊[4]（2010）在《复制型HBV小鼠模型建立及可诱导肝细胞特异性表达uPA转基因小鼠制备》文中研究指明目的1、构建及鉴定水动力法转染HBV小鼠模型,探讨该模型在HBV疫苗评价中的应用。2、制备可诱导肝细胞特异性表达uPA转基因小鼠,为人肝嵌合体小鼠模型的建立奠定基础。方法1、复制型HBV小鼠模型的建立及其在疫苗评价中的应用（1） pAAV-HBV1.3质粒的鉴定:含腺相关病毒倒转末端重复序列元件与包含1.3个拷贝HBV基因组（ayw亚型）的HBV表达质粒pAAV-HBV1.3（由中国疾控中心病毒病所谭文杰教授惠赠）,酶切鉴定并将该质粒转染Huh7肝癌细胞系,ELISA方法检测HBsAg、HBeAg的分泌表达水平。（2）水动力法HBV小鼠模型的构建:将pAAV-HBV1.3质粒经高压水动力法尾静脉注射C57BL/6小鼠,分别于注射后10天、30天、60天采集血液和肝组织标本,ELISA检测血清HBsAg、HBeAg表达;Real-Time PCR检测血清及肝组织病毒载量;HE染色、免疫组化染色检测肝组织病理学改变及病毒抗原在肝组织中的定位及表达。（3）水动力法HBV小鼠模型的优化:采用免疫抑制剂地塞米松注射液（DEX）腹腔注射小鼠,0.2ml/只/次（50mg/Kg）隔日一次连续3次,建立免疫功能抑制小鼠模型,在此基础上制备乙肝病毒转染小鼠模型,于注射后每周采集尾静脉血,进行血清HBsAg、HBeAg检测及病毒载量检测。（4）水动力法转染HBV小鼠模型的鉴定:利用HBV商品化疫苗（商品名:安在时,成分:HBsAg）免疫小鼠,2μg/只,14天1次,共2次,生理盐水为对照,200μl/只;第2次加强免疫14天后用水动力法转染pAAV-HBV1.3,进行免疫保护性实验,在不同时间点采集尾静脉血,ELISA检测血清HBsAg、HBeAg,Real-Time PCR检测血清病毒载量。（5）水动力法转染HBV小鼠模型在疫苗评价中的应用:用重组腺病毒（AdS）免疫C57BL/6小鼠,同时设置安在时疫苗（商品化疫苗）及生理盐水为对照。分别于首次免疫前及每次免疫后10天采集尾静脉血,ELISA检测血清HBsAb,最后1次免疫14天后尾静脉水动力法注射pAAV-HBV1.3质粒溶液1.6m（l20μg/只）,于不同时间点采集尾静脉血,ELISA检测血清HBsAg、HBeAg,Real-Time PCR检测血清病毒载量。2、可诱导肝细胞特异性表达uPA转基因小鼠的制备（1） pTet-on-Albumin转基因小鼠的制备:构建及鉴定含血清白蛋白增强子和启动子序列的pTet-on-Albumin载体,在细胞水平验证Albumin启动子转录活性,通过将pTet-on-Albumin载体显微注射B6/CBA杂合一代受精卵原核细胞的方法获得转基因首建鼠,然后与野生型C57BL/6杂交,PCR筛选转基因阳性小鼠,RT-PCR、Western blot鉴定rtTA mRNA及蛋白表达。（2） pTRE2-uPA转基因小鼠的制备:构建及鉴定含小鼠uPA基因的pTRE2- uPA载体,与pTet-on质粒共转Huh7细胞系,细胞水平鉴定uPA的表达及其生物活性;通过将pTRE2-uPA载体显微注射B6/CBA杂合一代受精卵原核细胞的方法获得转基因首建鼠,与野生型C57BL/6杂交,PCR筛选转基因阳性小鼠。（3）可诱导肝细胞特异性表达uPA转基因小鼠的制备:将已获得稳定的且在小鼠肝细胞特异性表达Albumin-rtTA的转基因小鼠与TRE2-uPA转基因小鼠杂交,子代鼠Dox诱导,诱导12周后处死小鼠,取血清和肝组织进行ALT和肝组织uPA表达及病理学检测,获得可诱导肝细胞特异性表达uPA转基因小鼠。结果1、复制型HBV小鼠模型的建立及其在疫苗评价中的应用（1） pAAV-HBV1.3质粒的鉴定结果:将包含1.3倍全长HBV基因组的质粒pAAV-HBV1.3酶切分析与预期结果相符,pAAV-HBV1.3脂质体转染Huh7细胞72h后收集细胞培养上清,ELISA方法检测HBsAg、HBeAg均为阳性,OD值分别为0.309及1.279,对照（未转染的Huh7细胞培养上清）均为阴性。（2）水动力法HBV小鼠模型的鉴定结果:C57BL/6小鼠尾静脉水动力法注射pAAV-HBV1.3,10天时通过ELISA方法检测小鼠血清HBsAg、HBeAg,结果均为阳性,感染率为100%;30天、60天时血清HBsAg、HBeAg ELISA检测结果均为阴性。Real-Time PCR检测小鼠血清及肝组织病毒载量,结果显示,注射质粒10天、30天及60天时实验组小鼠血清及肝组织病毒载量明显高于对照组,且在10天时达高峰,以后随时间延长,血清及肝组织中病毒载量降低。免疫组化染色可见,10天时注射pAAV-HBV1.3小鼠肝组织均存在HBsAg、HBcAg阳性细胞,注射HBV质粒30天和60天时小鼠肝组织未检测到HBsAg、HBcAg阳性细胞。（3）水动力法HBV小鼠模型的优化结果:免疫系统功能抑制小鼠在转染pAAV-HBV1.3质粒后各组间HBsAg、HBeAg总体表达持续时间有显着差异（P<0.01,P<0.05）,且均为IP DEX 8周组表达最长,HBsAg和HBeAg在pAAV-HBV1.3转染后第8周转为阴性。结果显示,通过抑制小鼠免疫状态,可明显延长病毒在小鼠体内复制和表达时间。（4） HBV商品化疫苗对水动力法转染HBV小鼠模型鉴定结果:安在时疫苗免疫小鼠2次后即产生保护性抗体,pAAV-HBV1.3转染后血清HBsAg、HBeAg均为阴性,生理盐水组小鼠转染pAAV-HBV1.3后血清HBsAg、HBeAg均为阳性。生理盐水组小鼠转染pAAV-HBV1.3后病毒载量明显高于其他各组。实验结果表明,高压水动力法转染HBV小鼠模型可有效应用于乙肝疫苗免疫效果的评价。（5）水动力法转染HBV小鼠模型用于新型疫苗评价的实验研究:第2次加强免疫后安在时疫苗组HBsAb均为阳性,AdS组及生理盐水组均为阴性,安在时组与其它两组间差异显着（P<0.01,P<0.01）,第4次加强免疫后AdS组HBsAb全部转为阳性,生理盐水组HBsAb为阴性,两组间差异显着（P<0.01）;pAAV- HBV1.3质粒转染后安在时疫苗组HBsAg、HBeAg均为阴性,AdS组HBsAg、HBeAg持续时间明显短于生理盐水组,两组在10天、12天时HBsAg阳性率有显着差异（P<0.01,P<0.05）,在15天时HBeAg阳性率有显着差异（P<0.05）。Real-Time PCR结果显示AdS组与生理盐水组病毒载量明显高于安在时疫苗组（P<0.05 ,P<0.05）,AdS组与生理盐水组转染后20天病毒载量差异显着（P<0.05）。实验结果表明,构建的表达HBV preS1-S-preS2的重组腺病毒候选疫苗可诱导产生一定的免疫保护作用,但免疫效果明显不如商品化疫苗。该实验同时也表明,水动力法转染HBV小鼠模型在乙肝疫苗的免疫效果评价中有重要的应用价值。2、可诱导肝细胞特异性表达uPA转基因小鼠的制备（1） pTet-on-Albumin转基因小鼠的制备:构建四环素诱导表达系统肝组织特异性表达rt的调控质粒pTet-on- Albumin,经BamH I酶切可见4条带（3026bp、2681bp、2000bp、1257bp）,与pTRE2-EGFP共转染Huh7细胞,Dox诱导24h,结果表明未诱导组没有绿色荧光表达,而诱导组可见绿色荧光,细胞水平验证Albumin启动子具有转录活性。pTet-on- Albumin转基因小鼠出生2周后提取基因组DNA,PCR阳性为转基因首建鼠,与野生型C57BL/6小鼠交配,2周龄仔鼠剪尾提取基因组DNA,PCR检测阳性为F1代小鼠,繁育获得子代鼠,诱导后获得子代鼠仅在肝组织检测到rtTA mRNA及rtTA蛋白表达。（2） pTRE2-uPA转基因小鼠的制备:pTRE2-uPA质粒经SmaⅠ、HindⅢ双酶切得4条带（3549bp、1027bp、960bp和158bp）,与pTet-on共转染Huh7细胞,Dox诱导36h后提取转染细胞总RNA,RT-PCR检测uPA的表达,诱导组细胞扩增出1.3 kb的目地条带;溶圈法检测细胞培养上清中的uPA生物活性,除Dox诱导组细胞培养上清可观察到溶圈现象,其他实验组均未检测到明显的溶圈现象。pTRE2-uPA转基因小鼠分别在出生2周后提取基因组DNA,PCR阳性为转基因首建鼠,与野生型C57BL/6小鼠交配,2周龄仔鼠剪尾提取基因组DNA,PCR检测阳性为F1代小鼠。（3）可诱导肝细胞特异性表达uPA转基因小鼠的制备:pTet-on-Albumin F1代小鼠与pTRE2-uPA F1代小鼠交配,PCR鉴定阳性为可诱导肝细胞特异性表达uPA双转基因小鼠,病理切片HE染色可见Dox诱导后肝组织点状坏死灶,免疫组化结果可见肝细胞中散在的uPA表达。血清ALT结果为双转基因小鼠Dox诱导后ALT显着高于未诱导组（P<0.01）。结果显示,成功制备可诱导肝细胞特异性表达uPA转基因小鼠,并经过5代繁育,获得pTet-on-Albumin-uPA双转基因纯合子小鼠,目的基因表达稳定。结论1、通过高压水动力法建立了HBV转染小鼠模型;通过抑制小鼠免疫状态,可延长病毒在肝组织内的复制与表达。2、利用商品化疫苗进行HBV小鼠模型的鉴定,实验表明该模型可以有效应用于疫苗评价;利用该模型对一种新型候选基因疫苗进行了评价。3、成功制备了可诱导肝细胞特异性表达uPA转基因小鼠模型,并获得稳定传代的纯合子小鼠,为HBV感染人肝嵌合体小鼠模型的建立奠定了基础。
蒋黎[5]（2009）在《基于Bcl-2抗Fas凋亡特性的HepaRG细胞—鼠嵌合肝动物模型的建立》文中提出肝脏是最早进行细胞移植实验的器官之一。人肝细胞移植不仅可作为治疗肝衰竭和多种代谢性疾病的有效手段,而且将人肝细胞移植到动物体内,形成"嵌合肝",甚至在动物体内重建人类肝组织,以期获得可感染肝炎病毒的实验动物模型,成为当前研究的一个重要方向。要想建立理想的人鼠嵌合肝动物模型,使人肝细胞在小鼠体内长时间存活并保持功能,就必须满足外源肝细胞移植到动物体内定植的基本条件:一是对外源肝细胞无免疫排斥;二是宿主肝细胞形成再生需求和环境;三是移植肝细胞较宿主肝细胞更具增殖优势。为了寻找不仅能使小鼠肝损伤,形成再生需求和环境,同时又赋予移植细胞更强生长优势的方法。我们设想,利用Fas抗体诱导小鼠肝细胞进入可控的凋亡状态,移植转Bcl-2基因的人肝细胞具有的抗凋亡能力使其在鼠肝内具有更强的增殖优势,来促进人肝细胞在嵌合鼠体内增殖。Fas是一种细胞表面信号分子,属于肿瘤坏死因子受体超家族成员。当与Fas配体或特异性抗体（如Jo2 mAb）结合后,Fas启动细胞凋亡。Bcl-2是一种细胞浆蛋白,它属于常生长蛋白质家族（ever-growing family of protein）中的一员。该家族在细胞凋亡中起着主导作用。研究证明,小鼠肝细胞对Jo2 mAb所诱导的细胞凋亡非常敏感,给小鼠反复注射小剂量的Jo2 mAb不会引起肝外组织器官明显损伤,却可造成肝细胞大面积的凋亡,引起动物出现暴发性肝衰竭症状和死亡。而表达Bcl-2的转基因肝细胞可完全阻止由Jo2mAb引起的肝细胞凋亡。HepaRG细胞是从慢性丙型肝炎感染的肝癌患者体内非瘤组织分离而得的细胞株,在广义上属于永生化细胞株的范畴。HepaRG细胞与正常的肝细胞相比,具有相似的形态学和生理学功能;作为潜能祖细胞,具有向肝细胞和胆管上皮细胞双向分化的潜能。细胞培养显示,HepaRG细胞在分化过程中,能持续表达药物代谢酶（I项药代酶P450和Ⅱ项药代酶）达6w之久;体内移植表明,HepaRG细胞对裸鼠未显示明显的致瘤性,在Alb-uPA/SCID小鼠体内,保持了分化功能,并具有成熟肝细胞的生物学特性,说明HepaRG可作为药物代谢研究和细胞移植的良好的体内外模型。本研究将基于Bcl-2抗凋亡特性,以转染了Bcl-2基因的HepaRG细胞为移植细胞,联合Fas抗体诱导SCID小鼠肝细胞凋亡来构建人鼠嵌合肝动物模型。因为Jo2 mAb可诱导小鼠肝细胞的凋亡,给外源性肝细胞生长让出“空间”,提供了肝再生需求及环境,为移植的外源性肝细胞提供了增殖信号。同时,表达Bcl-2转基因的移植肝细胞能抵御Jo2 mAb引起的肝细胞凋亡,使移植肝细胞具有较鼠肝细胞更强的生长和生存优势。此外,选择SCID小鼠作为移植受体可避免免疫排斥反应的发生,所以该策略很好地满足了异种细胞移植的基本条件。方法和结果1.Jo2 mAb对体外小鼠肝细胞和HepaRG细胞培养的影响体外培养小鼠肝细胞和HepaRG细胞,加入不同浓度的Jo2 mAb（终浓度为10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL、0.1μg/mL）,以了解Jo2 mAb作为诱导小鼠肝细胞凋亡的手段,对移植的HepaRG细胞是否也有相同影响。加入Jo2 mAb 5μg/mL于72h、10μg/mL于48h和72h对小鼠肝细胞有致凋亡征象,表现为细胞体积缩小、胞质浓缩、胞核固定,细胞折光率明显增加;瑞氏染色出现凋亡小体;MTT测定该三时相点细胞抑制率分别为52%、51%和67%,与空白对照组有显着性差异﹙P<0.05﹚;小鼠肝细胞DNA出现明显排列成梯状的分子条带,而ALT、AST以及LDH无明显变化。对照HepaRG细胞不同浓度的Jo2 mAb作用未发现明显的凋亡征象。2.经Jo2 mAb体内诱导小鼠肝细胞凋亡后的HepaRG细胞移植研究采用Jo2 mAb腹腔注射,剂量为0.3mg/kg,诱导20只SCID小鼠制备急性肝损伤模型,24h内按照实验动物随机分组方法,挑选小鼠经脾移植2×106个HepaRG细胞为实验组（10只）,未经HepaRG细胞移植为对照组（10只）。实验组小鼠有9只存活超过4w,而对照组小鼠3d内先后死亡9只,实验组血清ALT和AST趋于正常,显着低于对照组（P < 0.01）,且存活时间显着高于对照组（P <0.01）。实验组经HepaRG细胞移植后肝组织结构完整,无明显出血、坏死,而对照组肝组织结构模糊,出血和大面积点、片状坏死明显。实验组移植后4w免疫组化可见人白蛋白、CK18、人Hep Par 1阳性表达细胞,肝组织免疫荧光可见人白蛋白阳性细胞的表达,但表达数量较少。3.可稳定转染Bcl-2的HepaRG细胞株的建立虽然Jo2 mAb对HepaRG细胞体外无致凋亡作用,但鉴于移植到小鼠体内的HepaRG细胞尽管能存活,但不具有增殖优势,经Jo2 mAb启动细胞凋亡途径,缺乏抗凋亡能力。为此,我们将pSFFV-neo Bcl-2质粒转染HepaRG细胞,经过G418和抗Fas抗体筛选,获得双抗性克隆,从而建立稳定表达Bcl-2蛋白的HepaRG细胞株。稳定转染Bcl-2蛋白的HepaRG细胞株,培养14d形态学无变化。免疫组化检测到Bcl-2以及人白蛋白的表达,采用RT-PCR法检测到Bcl-2的mRNA以及Western blot法检测到Bcl-2表达的蛋白,而对照未转染Bcl-2的HepaRG细胞以及转染空载质粒的HepaRG细胞均未见Bcl-2的阳性表达。4.Bcl-2/HepaRG细胞-鼠嵌合肝动物模型的构建将2×106个Bcl-2转基因HepaRG细胞经脾移植到SCID小鼠体内,移植后1d始给予Jo2 mAb 0.2mg/Kg腹腔注射,1次/周,持续10周建立Bcl-2/HepaRG细胞-鼠嵌合模型（n=43）;移植HepaRG细胞,同样给予Jo2 mAb注射建立HepaRG细胞-鼠嵌合模型（n=25）;移植HepaRG细胞,未腹腔注射Jo2 mAb的小鼠为对照组（n=14）。三组小鼠均能存活至24w。Bcl-2/HepaRG细胞-鼠嵌合肝模型肝组织免疫组化和免疫荧光可见Bcl-2蛋白的表达,且随着移植时间的延长,从2w开始增加,16w表达最强,此后逐渐衰减,至24w降到最低。三组小鼠肝组织免疫组化都能检测到人白蛋白和CK18的表达,免疫荧光还可检测到Ki67的表达。Bcl-2/HepaRG细胞-鼠嵌合肝人白蛋白、CK18以及Ki67阳性持续时间为224w,整体趋势为随着移植后时间推移,呈先升高后逐渐下降的过程,在移植后16w出现峰值,人肝细胞在嵌合鼠肝组织中的替代率约为22%;而HepaRG细胞-鼠嵌合肝上述三指标阳性表达时间为220w,高峰时间为12w,替代率约为15%;对照组的表达时间就仅为212w,高峰时间8w,替代率仅为8%左右。此外,Bcl-2/HepaRG细胞-鼠嵌合肝424w、HepaRG细胞-鼠嵌合肝420w和对照组412w肝组织可通过RT-PCR检测到人白蛋白mRNA的阳性条带、Western Blot于血清中可检测到人白蛋白,同时经ELISA可定量检测到血清中人白蛋白的含量。Bcl-2/HepaRG细胞-鼠嵌合肝模型人血清白蛋白高峰值为0.101μg/mL,出现在16w;而HepaRG细胞-鼠嵌合肝模型人血清白蛋白高峰值为0.042μg/mL,出现在12w;对照组人血清白蛋白高峰值为0.022μg/mL,出现在8w。结论:1.证实Jo2 mAb可体外诱导小鼠肝细胞凋亡。发现Jo2 mAb对HepaRG细胞体外无明显致凋亡作用。2.证实Jo2 mAb体内可致小鼠急性肝损伤,HepaRG细胞移植能保护小鼠避免发生Jo2 mAb所致急性肝损伤,显着改善小鼠的存活率。经HepaRG细胞移植后发现,其虽能在SCID小鼠体内少量存活,但无移植细胞的增殖优势,在Jo2 mAb启动细胞凋亡途径后,可能不具备抗击凋亡的能力,生长、增殖空间有限。3.建立Bcl-2基因稳定转染的HepaRG细胞株。发现转Bcl-2的HepaRG细胞在形态学、生物学功能上与HepaRG细胞无异,能在细胞、分子以及蛋白水平表达Bcl-2蛋白。4.采用转Bcl-2的HepaRG细胞移植,联合Jo2 mAb腹腔注射诱导肝细胞凋亡的方法,建立的嵌合鼠肝组织能表达Bcl-2蛋白。HepaRG细胞不仅能在小鼠体内存活,而且保持人肝细胞的特性,产生人白蛋白,维持近24w,成功建立HepaRG细胞-鼠嵌合肝动物模型。在所建立的HepaRG细胞-鼠嵌合肝动物模型中,发现HepaRG细胞转Bcl-2基因的表达,使其在小鼠体内替代率增高,存活时间延长,数量增多,人白蛋白的表达含量增加。
李霄[6]（2009）在《双特异性抗肿瘤重组腺病毒的构建、鉴定及实验免疫》文中认为本研究利用分子生物学、病毒学和免疫学等技术和手段,旨在探索抗肿瘤过程中存在的安全性和有效性问题。首先,通过同源重组方法构建了分别含有肿瘤特异性启动子hTERTp、PEG3p和特异性抑癌基因HN、Apoptin的双特异性重组腺病毒:Ad-VT、Ad-VP、Ad-HT、Ad-HP;同时构建了表达EGFP基因的对照重组腺病毒病毒:Ad-GT、Ad-GP。通过一系列实验研究证明,所获得重组腺病毒性状稳定,形态完整、增殖性能未受影响。本研究采用MTT染色、AO/EB染色、流式细胞术等方法检测了重组腺病毒感染对A549肺癌细胞的抑制作用。结果表明,Ad-VT、Ad-VP、Ad-HT、Ad-HP均可不同程度地抑制体外培养的A549肿瘤细胞。利用Annexin V染色、DAPI染色、Caspase活性检测等方法探讨了所构建重组腺病毒致A549细胞死亡的方式。结果表明,Ad-VT、Ad-VP、Ad-HT、Ad-HP主要以诱导凋亡的方式抑制体外培养的A549肿瘤细胞。本研究复制了C57BL/6小鼠荷小鼠肺癌（LLC）肿瘤模型,探讨了所构建双特异性抗肿瘤重组腺病毒对体内实体肿瘤的抑制作用。实验结果显示,Ad-VT、Ad-VP、Ad-HT、Ad-HP均可不同程度地抑制实体肿瘤的生长,提高荷瘤动物模型生存率,延长荷瘤动物模型生存期。另外,Ad-HT、Ad-HP还可以刺激产生抗肿瘤免疫反应。上述研究为研制安全、高效的抗肿瘤制剂奠定了基础,并为揭示HN、Apoptin的抑瘤和免疫调控机理提供了参考数据。
杨海[7]（2009）在《人抗凝血酶Ⅲ的cDNA克隆、表达、纯化及其重组蛋白对DIC大鼠模型的疗效研究》文中认为与传统的药物相比,重组蛋白质药物具有活性高、特异性强、毒性低、生物功能明确、便于临床应用、可规模化生产的优点,因此,重组药物蛋白的生产是当今国内外药物研究的热点,其中研究的重点则是如何经济、高效的生产和应用这类蛋白。虽然有细菌、真菌、昆虫细胞、动物细胞、转基因动植物等几种外源蛋白表达系统用来生产重组药用蛋白,但它们均存在着一些难以弥补的缺陷。为探讨利用动物乳腺作为表达系统来生产药用蛋白的可行性,本研究选取人血浆中重要的抗凝蛋白-人抗凝血酶（hAT）作为研究对象,构建含有hAT cDNA基因的重组腺病毒载体Ad-hAT,将Ad-hAT注入羊乳腺内,感染羊乳腺上皮细胞,使hAT的cDNA基因在羊乳腺内高效表达,从而在羊乳汁中获得具有生物功能的重组人抗凝血酶（rhAT）。对rhAT进行分离纯化后,作用于弥散性静脉内凝血（DIC）大鼠模型,对rhAT治疗DIC大鼠的疗效进行评判。通过以上试验,为重组腺病毒载体介导人源基因在动物乳腺中高效表达rhAT以及rhAT在人类DIC疾病中的应用提供理论依据和技术支持。本研究主要包括以下内容:（1）提取人胚胎肝脏组织中的总RNA,经RT-PCR,获得用于表达的hAT的cDNA基因序列。对获得的cDNA序列进行测序分析,初步确定所扩增的cDNA的正确性。（2）以pcDNA3.1（+）为基础质粒,构建重组真核表达质粒p3AT,将之转入体外培养的羊乳腺上皮细胞细胞中获得表达,进一步证实hAT的cDNA序列可用于表达rhAT;（3）以pShuttle-CMV为基础质粒,构建重组穿梭载体pShAT,细菌内同源重组法获得重组腺病毒载体质粒pAd-hAT;（4）将pAd-hAT转入HEK293细胞中,通过病毒包装获得重组hAT腺病毒载体Ad-hAT;Ad-hAT在HEK293细胞内大量扩增;（5）将Ad-hAT转入体外培养的羊乳腺上皮细胞中获得表达,进一步证实Ad-hAT可用于高效表达rhAT;（6）将Ad-hAT注入羊乳腺,感染乳腺上皮细胞,在乳汁中获得rhAT,对乳汁中rhAT进行检测;应用肝素琼脂糖凝胶6FF亲和层析法分离乳汁中的重组蛋白,获得rhAT冻干粉;（7）构建大鼠DIC动物模型,分别用人血浆提取的hAT（hpAT）和rhAT进行处理,检测DIC大鼠血浆中DIC指标,进行疗效判定;（8）对hpAT和rhAT对DIC大鼠的疗效进行比较,探索在DIC治疗中,利用rhAT取代hpAT的可行性。进行上述试验研究,取得如下研究结果:（1）通过RT-PCR法从人胚胎肝脏组织中获得了hAT的cDNA基因。经DNA测序分析,所得hAT的cDNA与Genbank中的相应序列（NM000488）一致。（2）以pcDNA3.1+、pIRES和pShuttle-CMV为基础质粒,构建了含有hAT cDNA基因的真核表达载体p3AT以及穿梭表达载体pShAT。载体p3AT含有新霉素抗性筛选标记基因和GFP报告基因,可对已转染的哺乳动物细胞进行抗性筛选,也可对hAT的表达进行实时观测;构建的pShAT质粒含有GFP报告基因,可对腺病毒载体进行实时蛋白表达观测和快速滴度测定,为下一步研究rhAT的表达奠定基础。（3）将所构建并经鉴定正确的pShAT用Pme I酶切线性化,将所获得的线性化片断直接转化处于感受态且含有Adeasy-1质粒的大肠杆菌BJ5183,通过细菌内同源重组的方法获得了含有hAT cDNA基因的重组腺病毒载体质粒pAd-hAT。证实细菌内同源重组能高效获得重组腺病毒载体质粒。（4）在培养的HEK293细胞中,进行了重组腺病毒Ad-hAT的包装与扩增,获得了重组腺病毒Ad-hAT。（5）质粒表达载体p3AT在体外培养的羊乳腺上皮细胞中获得表达,表达含量达到了700±90 mg/L,rhAT活性为110%～120%,证实了所PT-PCR获得的hAT cDNA可用于hAT的表达;重组腺病毒载体Ad-hAT在体外培养的羊乳腺上皮细胞中获得表达,表达含量达到了900±85 mg/L,rhAT活性为120%～130%,证实了Ad-hAT在羊乳腺上皮细胞中表达的可能性,为下一步在羊乳腺内高效表达hAT奠定了基础。（6）将Ad-hAT注入羊乳腺后,在乳汁中获得了rhAT的高效表达,21 d内共11次的检测平均表达含量达到1.58±0.21 g/L,日检测单次最高3.1 g/L,活性平均为102.5±1.44 %。应用肝素琼脂糖凝胶亲和层析法分离纯化rhAT后,分离纯化后的rhAT回收率达到54.7±1.0%,纯度达到92.5±0.5%。（7）成功构建大鼠DIC动物模型。（8）用rhAT和hpAT处理DIC大鼠后,rhAT和hpAT一样（P>0.05）,均有效地缓解了大鼠DIC病情,对治疗DIC大鼠具有良好的疗效,主要表现为:血浆纤维蛋白原浓度减少和血小板增多的趋势得到有效抑制;血浆内hAT活性和凝血酶-抗凝血酶复合物（TAT）浓度得到相应增加;谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）浓度上升的趋势得到有效抑制。结果说明,在DIC的治疗药物选择中,rhAT具有取代hpAT的可行性。本研究利用腺病毒为载体,在羊乳腺中高效表达了具有生物活性的rhAT;应用肝素琼脂糖凝胶亲和层析法分离纯化rhAT,获得了较高纯度的rhAT冻干粉;应用rhAT作用DIC大鼠模型,取得了和hpAT一样的良好的治疗效果（P>0.05）。研究结果充分说明,本试验确定的重组蛋白表达与分离纯化路线是切实可行的,该方法获得的rhAT在治疗DIC疾病方面具有和hpAT同等的疗效。这些,将促进从人血浆中提取hAT这一传统生产方式的变革,使hAT生产向高效、经济、规模化方向发展;也将进一步拓宽rhAT的应用领域,创造出更大的经济和社会效益。
肖波[8]（2008）在《腺病毒介导重组人蛋白C及人神经生长因子Beta基因在兔乳腺中高效表达的研究》文中进行了进一步梳理基因工程蛋白药物的生产是目前国际上研究的热点。如何经济、高效的生产这类蛋白也一直是人们努力探索的一个问题。目前,虽然有细菌、真菌、昆虫细胞、动物细胞、转基因植物、转基因动物等几种外源蛋白表达系统,但他们均存在着各种缺陷。为探讨利用动物乳腺作为表达系统来生产外源蛋白,本研究选取了两种药用蛋白,即一种是存在于人血浆中的药用蛋白——人蛋白C（hPC）,另一种是用于治疗神经性病变的细胞因子——人神经生长因子beta（hNGF-β）作为目标蛋白,通过腺病毒介导,使这两种蛋白的cDNA基因在兔乳腺中高效表达,并在兔乳汁中获得有功能的目标蛋白。从而为腺病毒介导外源基因在动物乳腺中高效表达重组药用蛋白方法的进一步开发和生产提供技术和理论依据。本研究主要包括以下内容:（1）提取人胚胎脏器组织中的总RNA,经RT-PCR,获得用于表达的hPC和hNGF-β的cDNA基因。通过对这两种cDNA进行测序分析,并将二者所编码的氨基酸序列与已发表的相应氨基酸序列进行比对,确定所扩增的cDNA的正确性。（2）真核表达载体的构建及其外源基因在培养细胞中的表达,证实构建入表达载体中的hPC和hNGF-βcDNA基因可用于表达;（3）细菌内同源重组法构建重组腺病毒载体;（4）重组腺病毒载体在HEK293细胞中的包装及重组腺病毒的扩增;（5）重组腺病毒中的外源基因在培养的乳腺上皮细胞中的表达;（6）将重组腺病毒注射到兔乳腺感染乳腺上皮细胞,分别检测兔乳汁中重组人蛋白C（rhPC）和重组人神经生长因子Beta（rhNGF-β）的表达情况,并经相应的活性鉴定,确定所表达蛋白有无相应的功能;（7）对所构建的两种表达rhPC载体进行表达效果的比较,通过优化载体进一步完善该技术体系。主要研究结果如下:（1）通过RT-PCR法从人胚胎心脏和肝脏组织中分别获得了hNGF-β和hPC的cDNA基因。经DNA测序分析,所得hPC和hNGF-β的cDNA与Genbank中的相应序列一致。通过对这两种cDNA所编码的氨基酸序列分析,二者均与已发表的两种蛋白的氨基酸序列一致。（2）以pcDNA3.1+、pIRES和pShuttle-CMV为基础质粒,构建了含有hPC及hNGF-βcDNA基因的真核表达载体p3PG和p3NG以及穿梭表达载体pShPG和pShNG。其中,载体中p3PG和p3NG含有新霉素抗性筛选标记基因和GFP报告基因,可对已转染的哺乳动物细胞进行抗性筛选,也可对目标蛋白基因的表达进行实时观测;pShPG、pShNG中含有GFP报告基因,可对目标蛋白基因的表达进行确定,提高了检测目标蛋白基因表达的效率,为rhPC及rhNGF-β的表达研究奠定了基础。（3）构建了含有hPC cDNA基因的穿梭表达载体pShPF,内含有促进hPC向成熟转变所需蛋白Furin的cDNA基因。（4）通过不同表达载体在CHO和HEK293细胞株中的表达,证实了所构建载体在哺乳动物细胞中表达的可能性,获得了hPC和hNGF-βcDNA在细胞的体外表达,为后面含hPC基因和hNGF-β基因的腺病毒载体的构建奠定了基础。（5）将所构建并经鉴定正确的pShNG、pShPG和pShPF载体用Pme I酶切线性化,然后将所获得的线性化片断与Adeasy质粒共转化大肠杆菌BJ5183,或者直接用线性化的pShNG、pShPG和pShPF直接转化处于感受态且含有Adeasy质粒的大肠杆菌BJ5183,通过细菌内同源重组的方法获得了重组AdPG、AdPF和AdNG腺病毒载体。验证了“两步转化法”可大幅度提高细菌内同源重组制备腺病毒载体的效率。（6）在培养的HEK293细胞中,进行了AdPG、AdPF、AdNG重组腺病毒的包装与扩增。通过重组腺病毒在兔乳腺上皮细胞中的表达研究,证实了重组腺病毒可感染乳腺上皮细胞并且表达目标蛋白。（7）通过对兔乳腺的感染试验,高效表达了具有生物活性的rhNGF-β和rhPC, rhNGF-β的最高表达量为346μg/mL,rhPC的最高表达量达到958μg/mL。从而证实了以腺病毒为载体导入动物乳腺表达外源蛋白的可行性。（8）通过对所构建的两种表达hPC的载体进行表达效果的比较,证实了furin对成熟hPC的表达起作用,但不如报道的效果较好,其原因可能是由于所构建的载体的差异而使furin表达量不同,从而造成hPC原肽不能完全被降解成成熟的hPC。本研究利用腺病毒为载体,在兔乳腺中高效表达了rhPC和rhNGF-β。通过将furin基因构建入腺病毒载体中hPC基因的下游,促进了rhPC的成熟表达,表明通过优化腺病毒载体的构建可促进动物乳腺成熟表达外源基因的蛋白。rhPC和rhNGF-β的高效表达充分说明以腺病毒为载体,利用动物乳腺进行外源蛋白的生产是可行的。该方法进一步拓展了腺病毒载体的应用范围,无论在转基因技术理论领域,还是在基因工程药物生产研究方面,均具有重要意义,为转基因蛋白药物的生产开辟了一条新途径。
梁蔚芳[9]（2007）在《聚乙二醇化干扰素α-2a与干扰素α-2a在体内和体外的抗乙型肝炎病毒活性研究》文中指出乙型肝炎病毒属嗜肝DNA病毒科，具有严格的种属和组织特异性，它只传染人和类人猿等灵长类动物，或者是这些动物的原代培养肝细胞。病毒与靶细胞受体结合进入体内，在肝细胞特异性细胞因子作用启动病毒复制。在研究HBV过程中，需要建立HBV相关的体外培养模型及小型动物模型。目前的稳定转染细胞系如HepG2．2．1．5和含HBV全基因组的转基因鼠均可以产生病毒血症，但其HBV DNA是整合到宿主染色体组上，与HBV自然传染不同。腺病毒宿主广泛，能够传染多种细胞，介导的基因转移具有高效性，可将外源基因直接转移到靶细胞中，并使其在细胞内有效表达成活性蛋白，进入细胞核后以附加体形式存在，并可启动病毒复制。为了克服HBV的种属屏障，本文利用重组腺病毒载体介导复制型的HBV，将HBV基因组转入LO2肝细胞株和昆明小鼠，构建一种新的HBV细胞模型和动物模型。同时，利用该细胞模型及动物模型在体外和体内研究普通干扰素IFNα-2a与聚乙二醇化干扰素Peg-IFNα-2a的抗病毒活性，并探讨IFNα-2a与Peg-IFNα-2a在体外和体内对HBV的第一个复制中间体cccDNA的清除是否存在差异。1．重组腺病毒的生物学特征的鉴定利用所构建的具复制能力的HBV重组腺病毒传染体外培养肝细胞，观察HBV的表达情况，从而初步了解该重组HBV腺病毒的生物学特性。以复制型HBV重组腺病毒，传染293细胞，大量制备重组腺病毒。PCR证实该重组腺病毒基因组中整合有HBV DNA，经连续传代的重组腺病毒中均可扩增出目的条带，具有遗传稳定性；以不同剂量的重组腺病毒传染LO2细胞，结果表明，传染剂量越大，HBsAg和HBeAg的表达越强；但当传染复数超过50时，细胞较易出现老化脱落等现象。可能是因为除了细胞正常生长外，传染的过程中需要更多的能量，从而也加快了宿主细胞的生长代谢。以25 pfu／细胞的重组腺病毒传染三种肝源性细胞株：人肝癌细胞株HepG2细胞、人正常肝细胞株LO2细胞和禽肝细胞株LMH。RT-PCR在三种传染肝细胞中均能检测到HBV特异的mRNA；ELISA在三种传染肝细胞的培养上清中均能检出HBsAg和HBeAg，表明重组腺病毒均可以介导HBV在该三种不同来源的肝细胞中建立HBV的传染状态。HBV可在异种肝细胞内复制，HBV蛋白能够表达，从而认为，HBV DNA的复制与表达无严格的种属特异性限制，而是肝细胞内环境依赖性的。HBsAg和HBeAg的表达量随时间而增加，第五、六天达到高峰，其后有所下降。禽肝细胞HBsAg和HBeAg的表达量均低于另两种人源化肝细胞，认为可能与HBV表达的组织特异性有关。人肝癌细胞株HepG2细胞抗原的表达量高于人正常肝细胞株LO2细胞，认为因肝癌细胞的分裂生长及合成代谢均高于正常细胞，因而使得HBsAg和HBeAg的表达量也随之增高。重组腺病毒传染细胞后，连续七天在细胞内均可检测到腺病毒载体，证明了重组腺病毒对细胞的易感性和高效的基因转移能力。重组腺病毒传染细胞后第三天可以在培养上清中检测到腺病毒基因，随着培养时间的延长，培养上清中腺病毒含量增加。可能是随着培养时间的延长，细胞增殖到一定程度后开始老化、死亡、脱落，从而使部分重组腺病毒释放进培养上清中。2．重组腺病毒传染LO2细胞后HBV复制的动态分析将重组腺病毒介导的具自行复制能力的HBV传染人正常肝细胞株LO2，获得能表达HBV标志物的细胞模型，应用酶联免疫技术动态观察LO2细胞内HBsAg和HBeAg的表达；HBV荧光定量PCR检测培养上清中HBV DNA载量；合成特异性引物并结合荧光定量PCR技术，检测细胞内cccDNA的水平，旨在探讨重组腺病毒传染后HBV在细胞内的复制规律。以25 pfu／细胞的重组腺病毒传染LO2细胞，病毒吸附3小时后，去掉培养液，并以PBS冲洗3遍后，加入含10％胎牛血清的DMEM完全培养液1ml／孔，过夜培养。24小时后开始收集细胞上清及细胞，连续八天，-20℃保存。以血清DNA抽提试剂盒提取培养上清中DNA，HBV荧光定量PCR检测培养上清中HBVDNA含量。ELISA法检测培养上清中HBsAg和HBeAg的分泌。以不含蛋白酶的裂解液裂解细胞，利用cccDNA和rcDNA与蛋白质结合能力的差异提取cccDNA，并以绿豆核酸酶消化残留的rcDNA；利用cccDNA和rcDNA结构上的差异，设计跨越负链缺口的引物，并通过荧光定量PCR检测cccDNA，探讨重组腺病毒传染LO2细胞后细胞内cccDNA的变化。以病毒含量分别为107、106拷贝／ml的乙型肝炎患者血清进行引物的特异性检测，结果均为阴性，证明引物对HBV cccDNA具有特异性。质粒标准品倍比稀释为102，103，104，105，106，107拷贝／ml进行引物的敏感性检测，质粒在103-107范围内均能检测到信号，因此，该方法的敏感性可以达到103拷贝／ml。以该特异性引物进行荧光定量PCR检测重组腺病毒传染后L02细胞后细胞内cccDNA的量，cccDNA在传染后一天即可在细胞内检测到，第四天达到高峰，随后呈下降趋势，但仍维持相对稳定状态。认为cccDNA的稳定维持在一定水平，既能满足病毒复制的需要，又不会对细胞产生毒性，有利于维持病毒对细胞的长期传染状态。HBV荧光定量PCR检测培养上清中HBV DNA，培养上清中HBV DNA含量在病毒传染细胞后第五天达到最高，随后维持稳定状态。ELISA检测培养上清中HBsAg和HBeAg的分泌，HBsAg和HBeAg的表达量随培养时间的延长而增加，第六天达到高峰，随后呈下降趋势。一是由于细胞生长已到达平台期，细胞内已建立一种稳定的病毒传染状态；二是随着时间的延长，培养的细胞几乎停止分裂生长，细胞合成代谢功能降低，出现老化现象，因此完全依赖于细胞功能才能进行复制和表达的病毒，其复制水平也会随之下降。对HBV cccDNA、HBV DNA、HBsAg和HBeAg进行Spearman相关性分析，培养上清中HBV DNA的量与HBsAg和HBeAg的分泌量之间存在正相关关系，分别为：rs=0.881，P=0.004（双侧）；rs=0.857，JP=0.007（双侧），从而认为HBV蛋白表达规律与培养上清中HBV DNA相关，而细胞内HBV cccDNA与培养上清中HBV DNA的量及HBsAg和HBeAg的分泌量之间无明显相关性（P＞0.05）。3．IFNα-2a与Peg-IFNα-2a在体外对HBV复制的影响以重组腺病毒传染的LO2细胞为细胞模型，通过观察IFNα-2a与Peg-IFNα-2a处理前后培养上清HBV DNA、细胞内HBV cccDNA、HBsAg与HBeAg的变化，比较IFNα-2a与Peg-IFNα-2a的体外抗病毒作用，并观察该两种干扰素对乙型肝炎病毒复制的第一个环节有无抑制作用。以25 pfu／细胞的重组腺病毒传染LO2细胞，病毒吸附3小时后，去掉培养液，并以PBS冲洗3遍，加入含10％胎牛血清的DMEM完全培养液1ml／孔，过夜培养。将细胞分为三组，一组以IFNα-2a处理，药物用量分别为100 IU／ml、500 IU／ml、1000 IU／ml，每两天一次；一组以Peg-IFNα-2a处理，药物用量分别为3.6×10-3μg／ml、1.8×10-2μg／ml、3.6×10-2μg／ml；对照组不加；每组设三个复孔，细胞维持培养一周。以MTT法进行细胞毒性检测，在本实验浓度下，IFNα-2a与Peg-IFNα-2a对腺病毒传染的LO2细胞均无细胞毒性作用（P＞0.05）。细胞以药物处理后连续培养7天，收集培养上清；细胞以PBS洗涤3次后，胰蛋白酶消化，收集细胞进行细胞计数。以血清DNA抽提试剂盒提取培养上清DNA；以不含蛋白酶的裂解液裂解细胞，提取细胞内cccDNA。ELISA法检测培养上清HBsAg和HBeAg的分泌；HBV荧光定量PCR检测培养上清中HBV DNA；以HBV cccDNA特异性引物进行荧光定量PCR检测细胞内HBV cccDNA。结果显示，Peg-IFNα-2a药物组中，三个药物浓度组处理的细胞中HBsAg及HBeAg与对照组比较，均无显着性差异（P＞0.05）。IFNα-2a药物组中，剂量为100 IU／ml组的细胞分泌的HBsAg及HBeAg与对照组比较，无显着性差异（P＞0.05）；剂量为500 IU／ml组及1000 IU／ml组的细胞分泌的HBsAg及HBeAg与对照组相比显着减少（P＜0.05，P＜0.001），认为IFNα-2a在剂量为500 IU／ml以上时对重组腺病毒传染的LO2细胞的HBV抗原分泌有抑制作用。HBV荧光定量PCR检测培养上清中HBV DNA及应用HBV cccDNA特异性引物进行荧光定量PCR检测细胞内cccDNA含量。Peg-IFNα-2a药物组中，三个药物浓度组处理的细胞培养上清中HBV DNA含量与对照组比较，均无显着性差异（P＞0.05）。IFNα-2a药物组中，剂量为100 IU／ml组的细胞培养上清中HBV DNA含量与对照组比较，无显着性差异（P＞0.05）；剂量为500 IU／ml组及1000 IU／ml组的细胞培养上清中HBV DNA含量与对照组相比显着减少（P＜0.05），认为IFNα-2a在剂量为500 IU／ml以上时对重组腺病毒传染的LO2细胞内HBV DNA的合成有抑制作用。比较各组细胞内HBV cccDNA，各药物组细胞与对照组细胞的cccDNA含量均无显着性差异（P＞0.05），认为短期的药物处理不能抑制细胞内cccDNA的合成。4．IFNα-2a与Peg-IFNα-2a在体内对HBV复制的影响利用重组腺病毒传染小鼠，使HBV基因在小鼠体内表达，构建HBV传染的小鼠模型，利用该模型研究IFNa-2a和Peg-IFNot-2a的体内抗病毒作用，并观察IFNα-2a与Peg-IFNα-2a对小鼠体内HBV cccDNA的清除是否存在差异。重组腺病毒以尾静脉注射的方法接种4周龄的昆明小鼠，接种剂量为2×109pfu，建立HBV传染的动物模型。分别以IFNα-2a与Peg-IFNα-2a对小鼠进行皮下注射，参照人体临床用药，IFNα-2a用药剂量为1.7×103IU／只，三次／周；Peg-IFNα-2a用药剂量为0.06μg／只，一次／周；以生理盐水为对照组，一次／周。分别于第4周和第8周观察腺病毒介导的HBV在小鼠体内的复制情况及药物对HBV在体内复制的影响。提取两个药物组和对照组传染小鼠血清DNA及肝脏DNA，以HBV特异性引物进行PCR检测，传染小鼠血清及肝脏中结果均为阳性。以腺病毒特异引物进行PCR反应，检测传染小鼠血清及肝脏中的腺病毒基因组。第4周时三组传染小鼠肝脏中均可检出腺病毒DNA，第8周时再次检测传染小鼠肝脏中腺病毒DNA，结果均为阴性；而三组传染小鼠血清中一直不能检测出腺病毒DNA。结果表明，小鼠血清中不含重组腺病毒，血清中的HBV DNA是由于病毒在体内复制而产生的子代病毒。分别提取第4周和第8周时传染小鼠的肝脏RNA，以0.5μl DnaseⅠ处理提取物，除去污染的痕量DNA，RT-PCR检测HBV RNA。第4周和第8周时三组传染小鼠肝脏中均能检测出HBV特异的mRNA，证明传染小鼠肝脏中存在HBV的复制形式。以上结果表明，该重组腺病毒可以在小鼠体内建立HBV的传染状态。采用ELISA法检测了小鼠血清中IFN-γ含量，各实验组间IFN-γ含量比较有显着性差异（P＜0.001），但不同时间（第4周和第8周）各组IFN-γ含量比较无显着性差异（P＞0.05）。各实验组进行两两比较，结果表明，Peg-IFNα-2a组和IFNα-2a组与对照组比较均有显着性差异（P＜0.05）；比较两个药物组之间所诱生的IFN-γ的含量，Peg-IFNα-2a组高于IFNα-2a组（P＜0.05）。认为Peg-IFNα-2a与IFNα-2a在体内均具有免疫调节能力，但Peg-IFNα-2a的免疫调节作用强于IFNα-2a。荧光定量PCR检测小鼠血清HBV DNA，比较各实验组小鼠血清中的病毒含量变化，结果显示，两个药物组与对照组比较均有显着性差异（P＜0.05），表明两个药物对小鼠血清中病毒均有抑制作用。两个药物组之间比较无显着性差异（P＞0.05）；各实验组中血清病毒载量在第4周与第8周的差异无显着性（P＞0.05），从而认为Peg-IFNα-2a与IFNα-2a在本实验时间范围内对小鼠血清中病毒的作用无差异。传染小鼠肝脏DNA以绿豆核酸酶处理，以HBV cccDNA特异性引物进行荧光定量PCR检测传染小鼠肝脏中HBV cccDNA含量。结果显示，第4周与第8周时三组传染小鼠肝脏中HBV cccDNA含量均无显着性差异（P＞0.05）。从而认为IFNα-2a与Peg-IFNα-2a虽然能抑制血清中的病毒复制，但对肝脏内HBVcccDNA的影响不显着。结论：建立复制型HBV重组腺病毒的体外传染和体内传染模型。重组腺病毒在体外培养细胞中可以表达HBV、HBsAg和HBeAg，并可检测出HBV复制中间体。重组腺病毒传染小鼠，可以在小鼠体内检测到HBV复制中间体。利用该模型分别在体外和体内进行抗HBV活性的比较，IFNa-2a的体外抗病毒作用比Peg-IFNα-2a强；在体内，Peg-IFNα-2a具有较强的免疫调节能力；两个药物均能抑制血清中HBV的复制，但却对肝脏内HBV cccDNA的合成影响不大。
尹川[10]（2007）在《肝细胞核因子4诱导肝细胞功能的体外和体内研究》文中进行了进一步梳理背景与目的:肝细胞移植（hepatocyte transplantation,HCT）是治疗晚期肝硬化和肝功能衰竭的重要方法,但存在的主要问题是供体细胞功能不完善。肝细胞核因子4（hepatocyte nuclear factor, HNF4）是调控肝细胞分化和维护肝细胞生物学功能的重要转录蛋白。本实验利用表达HNF4α的腺病毒AdHNF4α对HNF4诱导的肝细胞功能进行了体外和体内的初步研究。方法:本研究首先比较不同肝细胞中HNF4α和肝细胞相关功能基因的表达情况,然后构建了表达HNF4α的腺病毒AdHNF4α,并体外感染人肝肿瘤细胞株（HepG2和Hep3B）以及小鼠胚胎干细胞,分别观察HNF4α基因上调对其生物学功能的影响;并应用HNF4α基因修饰HepG2细胞治疗急性肝功能衰竭小鼠,初步观察小鼠生存率和肝功能改善情况。结果:HNF4α在正常成熟的肝细胞中表达最高,同时肝细胞生物学功能基因表达水平与HNF4α的表达密切相关。将外源HNF4α基因导入肝肿瘤细胞可增强正常肝细胞重要功能基因表达。上调小鼠胚胎干细胞HNF4α表达,可明显提高正常肝细胞如CYP1a2、G-6-P、PAH以及ALB等功能基因的表达,糖原合成和ICG代谢功能显着增强,ES细胞向肝细胞定向分化的能力明显提高。利用HNF4α基因修饰的HepG2移植治疗急性肝功能衰竭小鼠可明显提高动物模型的生存率,有效改善肝功能。结论:HNF4α是调控肝细胞分化和维护肝细胞生物学功能的重要转录蛋白。上调供体肝细胞中HNF4α的表达,可明显增强肝细胞功能,因此HNF4α基因修饰肝细胞有望成为治疗急性肝功能衰竭的有效工具。
二、细菌内构建复制缺陷型人肝细胞生长因子重组腺病毒及其对胎肝细胞细胞周期的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、细菌内构建复制缺陷型人肝细胞生长因子重组腺病毒及其对胎肝细胞细胞周期的影响（论文提纲范文）
（1）1.3倍乙型肝炎病毒全基因质粒在SV40T永生化小鼠肝细胞中的表达（论文提纲范文）
| 目录 |
| CONTENTS |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 综述 |
| 综述（一） |
| 参考文献 |
| 综述 (二) |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第一部分 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的文章 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文文章1 |
| 英文文章2 |
（2）表达Apoptin基因重组腺病毒对肝癌细胞BEL-7402及转移模型的抑制作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1篇 绪论 |
| 第2篇 文献综述 |
| 第1章 肝癌治疗的研究进展 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 HCC病原学 |
| 1.3 肿瘤分期 |
| 1.4 肝癌治疗的常规方法 |
| 1.5 肝癌治疗的特殊疗法 |
| 1.6 HCC的发病机制(B和C肝炎病毒诱导的肝细胞癌的发病机制) |
| 1.7 HCC的预防 |
| 1.8 HCC发生发展的风险因子 |
| 1.9 目前HCC治疗方法的展望 |
| 1.10 总结及展望 |
| 第2章 细胞凋亡和凋亡素与肝病的关系 |
| 2.1 概述 |
| 2.2 Apoptin的作用机制 |
| 2.3 细胞凋亡与癌症治疗 |
| 2.4 细胞凋亡与肝癌 |
| 第3篇 研究内容 |
| 第1章 表达Apoptin基因重组腺病毒的制备及对肝癌细胞BEL-7402的抑制作用 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 表达Apoptin基因重组腺病毒对肝癌细胞BEL-7402的抑制方式 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 表达Apoptin基因重组腺病毒对信号分子的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 表达Apoptin基因重组腺病毒的体内抑瘤作用研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第4篇 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（3）表达His-tag-ICP47融合基因腺病毒载体的构建及其免疫活性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 表达His-tag-ICP47融合基因腺病毒载体的构建 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 表达His-tag-ICP47融合基因重组腺病毒的免疫活性研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述部分 病毒免疫逃逸机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
| 个人简历 |
| 在学期间发表的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（4）复制型HBV小鼠模型建立及可诱导肝细胞特异性表达uPA转基因小鼠制备（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 复制型HBV 小鼠模型的建立及其在疫苗评价中的应用 |
| 1-1 水动力法转染HBV 小鼠模型的建立 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 1-2 水动力法HBV 转染小鼠模型的鉴定及其在疫苗评价中的应用 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 可诱导肝细胞特异性表达uPA 转基因小鼠的制备材料与方法 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 乙型肝炎病毒动物模型的研究进展 |
| 主要仪器设备 |
| 主要试剂 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（5）基于Bcl-2抗Fas凋亡特性的HepaRG细胞—鼠嵌合肝动物模型的建立（论文提纲范文）
| 英文缩写一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 基于Bcl-2 抗Fas 凋亡特性的HepaRG 细胞-鼠嵌合肝动物模型的建立 |
| 前言 |
| 第一部分 J02 mAb 对体外小鼠肝细胞和HepaRG 细胞培养的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 经J02 mAb 体内诱导小鼠肝细胞凋亡后的HepaRG 细胞移植研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 可稳定转染Bcl-2 基因的HepaRG 细胞株的建立 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 Bcl-2//HepaRG 细胞-鼠嵌合肝动物模型的构建 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 文献综述一 人鼠嵌合肝动物模型研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 HepaRG 细胞的生物学特点及其应用研究 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 英文论着 |
（6）双特异性抗肿瘤重组腺病毒的构建、鉴定及实验免疫（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 英文缩略词表 |
| 绪论 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 溶瘤病毒在肿瘤生物治疗中的应用 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 病毒和肿瘤 |
| 1.3 病毒溶瘤的分子机制 |
| 1.4 肿瘤生物治疗用病毒的分类 |
| 1.5 致癌与抑癌 |
| 1.6 溶瘤病毒 |
| 1.7 溶瘤病毒研究与动物模型间的关系 |
| 1.8 肿瘤病毒治疗面临的问题 |
| 1.9 提高肿瘤病毒治疗效率的策略 |
| 1.10 结论 |
| 第2章 条件复制型腺病毒在肿瘤生物治疗领域的应用 |
| 2.1 概述 |
| 2.2 腺病毒结构 |
| 2.3 腺病毒包装 |
| 2.4 腺病毒感染 |
| 2.5 腺病毒载体骨架 |
| 2.6 缺失E1的腺病毒载体 |
| 2.7 缺失多个早期基因的腺病毒载体 |
| 2.8 高载量腺病毒载体 |
| 2.9 E1缺失腺病毒载体回顾 |
| 2.10 临床研究 |
| 2.11 结论 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 肿瘤特异性启动子的鉴定及穿梭载体的构建 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 双特异性抗肿瘤重组腺病毒的构建及鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 双特异性抗肿瘤重组腺病毒的体外抑瘤作用研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 双特异性抗肿瘤重组腺病毒的体内抑瘤作用研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及取得的科研成果 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
（7）人抗凝血酶Ⅲ的cDNA克隆、表达、纯化及其重组蛋白对DIC大鼠模型的疗效研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 重组药用蛋白的表达纯化研究进展 |
| 1.1 重组药用蛋白的表达 |
| 1.1.1 细菌内表达重组蛋白 |
| 1.1.2 哺乳动物细胞培养表达重组蛋白 |
| 1.1.3 植物生物反应器表达重组蛋白 |
| 1.1.4 动物乳腺反应器表达重组蛋白 |
| 1.2 重组药用蛋白的纯化 |
| 1.2.1 样品准备与预处理 |
| 1.2.2 层析技术 |
| 1.2.3 其他方法 |
| 第二章 腺病毒及其载体研究进展 |
| 2.1 腺病毒的生物学特性 |
| 2.1.1 形态结构 |
| 2.1.2 感染周期 |
| 2.1.3 编码基因的转录与复制 |
| 2.2 重组腺病毒载体的构建 |
| 2.2.1 第一代腺病毒载体的构建 |
| 2.2.2 第二代腺病毒载体构建 |
| 2.2.3 第三代腺病毒载体构建 |
| 2.3 腺病毒作为基因工程载体的优势 |
| 2.3.1 宿主细胞种类多，安全性能相对好 |
| 2.3.2 增殖能力强，表达谱广，外源基因表达水平高 |
| 2.3.3 与人类基因同源，无插入致突变性 |
| 第三章 人抗凝血酶(hAT)研究进展 |
| 3.1 hAT 的结构、功能与缺陷症 |
| 3.1.1 hAT 的结构 |
| 3.1.2 AT 的抗凝血功能 |
| 3.1.3 AT 的其它生理功能 |
| 3.1.4 AT 缺陷症 |
| 3.2 rhAT 的表达与分离纯化研究进展 |
| 3.2.1 hAT 基因表达研究进展 |
| 3.2.2 AT 蛋白的分离纯化研究进展 |
| 3.3 对AT 进一步研究的意义 |
| 第四章 hAT cDNA 序列的克隆及其表达载体构建 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 hAT 全长cDNA 的扩增与序列分析 |
| 4.2.2 hAT 表达载体及穿梭载体的构建 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 hAT 基因序列的分离、克隆 |
| 4.3.2 hAT 表达载体的构建 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 细菌内同源重组获得重组腺病毒载体的研究 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 穿梭载体的线性化 |
| 5.2.2 重组腺病毒载体的鉴定 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 重组腺病毒载体的构建方法 |
| 5.3.2 细菌内同源重组法构建重组腺病毒载体的优势 |
| 5.3.3 影响大质粒转化的因素 |
| 5.3.4 二次转化提高细菌内同源重组的成功率 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 rhAT 在体外培养的羊乳腺上皮细胞中的表达研究 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 重组腺病毒的包装 |
| 6.2.2 重组腺病毒的扩增 |
| 6.2.3 重组腺病毒的纯化和滴度测定 |
| 6.2.4 重组腺病毒介导rhAT 在羊乳腺上皮细胞中的表达 |
| 6.2.5 重组表达质粒p3AT 介导rhAT 在羊乳腺上皮细胞内的表达 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 腺病毒的生活周期 |
| 6.3.2 影响腺病毒构建的主要因素 |
| 6.3.3 腺病毒载体介导的rhAT 在乳腺上皮细胞中的表达 |
| 6.3.4 表达质粒介导的rhAT 在乳腺上皮细胞中的表达 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 rhAT 在山羊乳腺内的表达以及重组蛋白纯化研究 |
| 7.1 材料和方法 |
| 7.1.1 材料 |
| 7.1.2 方法 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 羊乳腺感染病毒后rhAT 的表达 |
| 7.2.2 羊乳中的rhAT 的活性分析 |
| 7.2.3 羊乳中rhAT 的分离纯化 |
| 7.3 讨论 |
| 7.3.1 动物乳腺生物反应器表达重组蛋白的优势 |
| 7.3.2 转基因动物乳腺生物反应器 |
| 7.3.3 以腺病毒为载体构建非转基因动物乳腺生物反应器 |
| 7.3.4 肝素琼脂糖凝胶亲和层析法分离rhAT |
| 7.4 小结 |
| 第八章 rhAT 对 DIC 大鼠模型的疗效研究 |
| 8.1 材料与方法 |
| 8.1.1 材料 |
| 8.1.2 方法 |
| 8.2 结果与分析 |
| 8.2.1 动物模型的建立 |
| 8.2.2 rhAT 对DIC 大鼠血浆中六项DIC 指标的作用效果 |
| 8.2.3 大鼠对LPS 的抵抗作用观察 |
| 8.3 讨论 |
| 8.3.1 LPS 的建模机理 |
| 8.3.2 大鼠对LPS 的抵抗作用 |
| 8.3.3 rhAT 对DIC 大鼠的治疗作用 |
| 8.4 小结 |
| 结论及创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（8）腺病毒介导重组人蛋白C及人神经生长因子Beta基因在兔乳腺中高效表达的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 动物乳腺反应器生产重组蛋白的研究进展 |
| 1.1.1 动物乳腺生物反应器表达重组蛋白的研究概况 |
| 1.1.2 动物乳腺生物反应器存在的问题及发展前景 |
| 1.2 腺病毒及其载体的研究进展 |
| 1.2.1 腺病毒的一般生物学特性 |
| 1.2.2 腺病毒载体的构建 |
| 1.2.3 腺病毒载体的优点 |
| 1.2.4 腺病毒载体的应用 |
| 1.3 人蛋白C 转基因的研究现状 |
| 1.3.1 蛋白C 的结构特性及其作用 |
| 1.3.2 重组人蛋白C 的研究状况 |
| 1.4 人神经生长因子转基因的研究现状 |
| 1.4.1 神经生长因子的结构 |
| 1.4.2 神经生长因子的生物活性 |
| 1.4.3 神经生长因子在临床上的应用 |
| 1.4.4 神经生长因子的来源 |
| 1.4.5 重组人神经生长因子的研究进展 |
| 第二章 人蛋白C 及人神经生长因子Beta cDNA 序列的克隆及其表达载体的构建 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 hPC 及hNGF-β全长cDNA 的扩增与序列分析 |
| 2.2.2 hPC 及hNGF-β表达载体及穿梭载体的构建 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 人蛋白C 和人神经生长因子beta 基因序列的分离、克隆 |
| 2.3.2 hPC 及hNGF-β表达载体的构建 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 人蛋白C 及人神经生长因子beta cDNA 在CHO 和293 细胞中的表达 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 四种载体转染CHO 和HEK293 细胞光镜检查结果 |
| 3.2.2 转染CHO、HEK293 细胞mRNA 检测 |
| 3.2.3 Western blot 检测结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 载体线性化对转染效率的影响 |
| 3.3.2 关于双标记筛选表达载体的便利性 |
| 3.3.3 关于外源基因导入方法的选择 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 同源重组法在细菌内制备重组腺病毒载体的研究 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 穿梭载体的线性化 |
| 4.2.2 重组腺病毒载体的鉴定 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 关于构建腺病毒载体的方法 |
| 4.3.2 细菌内同源重组法构建重组腺病毒载体的优势 |
| 4.3.3 影响大质粒转化的因素 |
| 4.3.4 二次转化提高细菌内同源重组的成功率 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 重组腺病毒的扩增及其在乳腺上皮细胞中表达的研究 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 重组腺病毒的包装 |
| 5.2.2 重组腺病毒的扩增 |
| 5.2.3 重组腺病毒的纯化和滴度测定 |
| 5.2.4 重组腺病毒在兔乳腺上皮细胞中的表达 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 腺病毒的生活周期 |
| 5.3.2 腺病毒生产中的几个重要环节 |
| 5.3.3 关于重组腺病毒滴度的测定 |
| 5.3.4 关于重组腺病毒在乳腺上皮细胞中的表达 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 重组腺病毒在兔乳腺中高效表达的研究 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 兔乳腺感染病毒后rhNGF-β的表达 |
| 6.2.2 兔乳腺感染病毒后hPC 的表达 |
| 6.2.3 兔乳中所表达的rhNGF-β和rhPC 的活性分析 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 结论及创新点 |
| 参考文献 |
| 附录1 人PC cDNA 序列 |
| 附录2 人PC cDNA 测序图 |
| 附录3 人神经生长因子cDNA 序列 |
| 附录4 神经生长因子βcDNA 测序图 |
| 缩略词和中英文对照表 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（9）聚乙二醇化干扰素α-2a与干扰素α-2a在体内和体外的抗乙型肝炎病毒活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1. 乙型肝炎动物模型 |
| 2. 腺病毒载体 |
| 3. 干扰素 |
| 第一部分 重组腺病毒的生物学特性研究 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 第二部分 重组腺病毒感染LO2细胞后HBVcccDNA的动态分析 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三部分 Peg-IFNα-2a与IFNα-2a对重组腺病毒感染LO2细胞后HBV复制的影响 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四部分 Peg-IFNα-2a与IFNα-2a对重组腺病毒感染小鼠体内HBV复制的影响 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
（10）肝细胞核因子4诱导肝细胞功能的体外和体内研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 详细摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 肝细胞核因子4α和肝细胞相关功能基因在不同肝细胞、肝肿瘤细胞及ES 细胞的表达 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.2 方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 RT-PCR 检测人正常成熟肝细胞、人肝肿瘤细胞株以及人FLC 株HNF4α以及肝细胞相关功能基因的表达 |
| 1.2.2 RT-PCR 检测小鼠不同发育阶段的FLC HNF4α以及肝细胞相关功能基因的表达 |
| 1.3 讨论 |
| 第二部分 重组复制缺陷型腺病毒AdHNF4α构建 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 AdEasy~(TM)重组腺病毒系统 |
| 2.2.2 获取HNF4α14256p cDNA 片段 |
| 2.2.3 体外连接获取穿梭质粒pAdTrack-CMV-HNF4α |
| 2.2.4 细菌内同源重组产生腺病毒质粒pAdHNF4α |
| 2.2.5 293 细胞内包装、扩增腺病毒AdHNF4α |
| 2.2.6 RT-PCR 法测定AdHNF4α上调L02 细胞中HNF4α表达 |
| 2.2.7 Western blot 检测AdHNF4α上调L02 细胞中HNF4α表达 |
| 2.3 讨论 |
| 第三部分 外源导入肝细胞核因子4α对人肝肿瘤细胞生物学特性的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 AdHNF4α感染肝肿瘤细胞后HNF4α mRNA 和蛋白表达检测 |
| 3.2.2 AdHNF4α感染肝肿瘤细胞后肝细胞相关功能基因表达测定 |
| 3.2.3 AdHNF4α感染肝肿瘤细胞后细胞凋亡率的检测 |
| 3.3 讨论 |
| 第四部分 外源导入肝细胞核因子4α对小鼠ES 细胞生物学特性的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 PMEF 的制备 |
| 4.2.2 小鼠ES 细胞株ES-D3 培养 |
| 4.2.3 AdHNF4α感染小鼠ES 细胞后HNF4α表达测定 |
| 4.2.4 ICC检测CK8、CK18、AFP和ALB表达 |
| 4.2.5 RT-PCR检测ES细胞在分化过程中肝细胞相关功能基因表达 |
| 4.2.6 PAS染色法检测糖原合成 |
| 4.2.7 吲哚氰绿吸收染色实验 |
| 4.3 讨论 |
| 第五部分 HNF4α基因修饰HepG2治疗小鼠急性肝功能衰竭的初步研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 小鼠生存率 |
| 5.2.2 一般情况 |
| 5.2.3 肝脏组织HE 染色 |
| 5.2.4 血清学检查 |
| 5.3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 硕士期间发表论文及获奖情况 |
| 硕士期间获奖情况 |
四、细菌内构建复制缺陷型人肝细胞生长因子重组腺病毒及其对胎肝细胞细胞周期的影响（论文参考文献）
- [1]1.3倍乙型肝炎病毒全基因质粒在SV40T永生化小鼠肝细胞中的表达[D]. 宋修光. 山东大学, 2012(04)
- [2]表达Apoptin基因重组腺病毒对肝癌细胞BEL-7402及转移模型的抑制作用[D]. 黄海燕. 吉林大学, 2011(10)
- [3]表达His-tag-ICP47融合基因腺病毒载体的构建及其免疫活性的研究[D]. 王鹏. 郑州大学, 2011(12)
- [4]复制型HBV小鼠模型建立及可诱导肝细胞特异性表达uPA转基因小鼠制备[D]. 郭燕菊. 中国人民解放军军事医学科学院, 2010(05)
- [5]基于Bcl-2抗Fas凋亡特性的HepaRG细胞—鼠嵌合肝动物模型的建立[D]. 蒋黎. 第三军医大学, 2009(05)
- [6]双特异性抗肿瘤重组腺病毒的构建、鉴定及实验免疫[D]. 李霄. 吉林大学, 2009(08)
- [7]人抗凝血酶Ⅲ的cDNA克隆、表达、纯化及其重组蛋白对DIC大鼠模型的疗效研究[D]. 杨海. 西北农林科技大学, 2009(10)
- [8]腺病毒介导重组人蛋白C及人神经生长因子Beta基因在兔乳腺中高效表达的研究[D]. 肖波. 西北农林科技大学, 2008(12)
- [9]聚乙二醇化干扰素α-2a与干扰素α-2a在体内和体外的抗乙型肝炎病毒活性研究[D]. 梁蔚芳. 第一军医大学, 2007(02)
- [10]肝细胞核因子4诱导肝细胞功能的体外和体内研究[D]. 尹川. 第二军医大学, 2007(02)