一、钩端螺旋体赖型017鞭毛钩相关蛋白K基因的克隆及序列分析（论文文献综述）
王琦[1]（2018）在《禽致病性大肠杆菌ompT缺失株特性及其对雏鸡小肠炎症相关基因表达的影响》文中研究表明禽致病性大肠杆菌（Avian pathogenic Escherichia coli,APEC）导致的禽大肠杆菌病被公认为是影响世界范围内养禽业的主要细菌性疾病,给养禽业带来重大的经济损失。APEC的毒力因子有菌毛、摄铁系统、毒素和外膜蛋白等,致病性复杂,血清型多样。细菌调控基因转录表达的途径众多,PhoP/Q二元调控系统是其中一个关键途径,其中调控与外膜蛋白合成相关基因的表达是其功能之一。本实验室前期研究发现APEC phoP/Q的缺失引起ompT基因表达的显着下调。外膜蛋白酶T（Outer-membrane protease T,OmpT）是革兰氏阴性菌中的一种外膜蛋白酶,它不仅可以作为水解蛋白的蛋白酶发挥功能,还可能是细菌的一个毒力相关因子,在病原菌的感染致病过程中起着一定作用。本试验通过Red重组技术构建了ompT缺失株及回复株,并进行生物学特性分析,基于RNA-Seq技术对ompT缺失株测序筛选并分析差异表达基因,并对ompT缺失株感染雏鸡小肠炎症相关基因mRNA水平的表达进行检测,为进一步研究ompT基因在禽致病性大肠杆菌中的致病作用提供理论依据,研究内容及结果如下:1.ompT基因缺失株、回复株的构建及其生物学特性和致病性分析本试验以AE17为野生株,通过Red重组技术成功构建了ompT缺失株及回复株。细菌生长曲线测定结果显示与野生株相比,ompT基因缺失株差异不显着;环境耐受性试验表明ompT基因缺失导致菌株耐酸性显着增加（p<0.01）,耐碱性显着降低（p<0.05）,耐热性显着降低（p<0.01）;LD50测定结果显示,ompT缺失株对雏鸡的致病力降低;组织载菌量试验结果表明,ompT缺失株显着降低感染雏鸡组织（脾脏、肝脏、肺脏）的载菌量（p<0.01）;与野生株相比,ompT基因缺失后,菌株对APEC的运动能力、抗生素的敏感性及抗吞噬能力差异不显着。2.基于RNA-Seq筛选APEC ompT缺失株差异表达基因为了探索ompT缺失对APEC基因水平的影响,本试验通过RNA-Seq技术从转录组水平筛选ompT缺失引起的差异表达基因,结果显示有490个差异表达基因,其中包括125个下调表达基因,365个上调表达基因。GO功能结果表明差异基因主要涉及铁离子稳态、裂解酶活性、肽聚糖生物合成过程、细胞形态调控等生物学过程;KEGG通路分析结果显示差异基因主要涉及细菌趋化性、生物膜形成、鞭毛装配、脂多糖生物合成等通路。筛选出fliY、ompF、ibeT、aphA、motB、rfaQ、flgK、cheA、irp2、asnC、ycgR、lpxK、kpsU等与毒力相关的基因。通过RT-PCR验证了部分差异基因（fliY、ompF、ibeT、aphA、motB、rfaQ、cheA、irp2）的表达,结果与RNA-Seq中基因表达变化趋势一致,说明RNA-Seq结果可靠。3.RT-PCR检测ompT缺失株感染雏鸡小肠炎症相关基因mRNA的转录水平通过RT-PCR比较攻毒组与对照组雏鸡空肠炎症相关基因PTGDS、MME mRNA水平的转录水平。结果显示攻毒12h、24h和48h后缺失株攻毒组的PTGDS基因mRNA的表达量较AE17攻毒组显着降低（p<0.01或p<0.05）,攻毒12h、24h后PTGDS基因mRNA的表达量高于0h、48h和72h。攻毒12h后,所有攻毒组的MME基因mRNA的表达量较0h显着降低;攻毒24h、48h后缺失株攻毒组的MME基因mRNA的表达量较AE17攻毒组显着降低（p<0.01或p<0.05）。综上所述,本试验成功构建了ompT缺失株及回复株,缺失ompT后导致耐酸性增强,耐碱性、耐热性降低,肝脏、脾脏、肺脏载菌量减少,显着降低了APEC的毒力和致病性,但对运动性、药物敏感性、抗吞噬能力方面影响不显着。APEC ompT基因的缺失引起毒力相关基因（fliY、ompF、ibeT、aphA、motB、rfaQ、flgK、cheA、irp2、asnC、ycgR、lpxK、kpsU）的表达变化。APEC感染雏鸡引起空肠炎症相关基因PTGDS、MME mRNA的表达变化,且菌株缺失ompT后影响空肠炎症相关基因PTGDS、MME mRNA的表达,说明炎症相关基因PTGDS、MME参与了机体抗APEC感染的过程,且ompT可能参与APEC感染机体的过程。
薛峰[2]（2011）在《钩端螺旋体感染的转录组学与钩体结构生物学研究》文中认为钩端螺旋体病（Leptospirosis,钩体病）世界范围内广泛分布的人畜共患病。问号钩端螺旋体（Leptospira interrogans,问号钩体）是造成钩体病的主要致病菌。最近研究表明,吞噬作用在宿主固有免疫系统抵抗钩体感染中起到了重要作用,且问号钩体可以逃避吞噬细胞的杀伤作用。然而,该过程中问号钩体的宿主适应性变化尚未可知。为了研究致病性钩体与宿主固有免疫互作过程中的分子机理,我们采用高密度基因芯片和比较基因组学方法研究了问号钩体赖型赖株56601在感染巨噬细胞系过程中的转录组学变化。结果表明,问号钩体在接触细胞过程中迅速调控了许多生化途径的基因表达,涉及碳源代谢,能量产生,脂类代谢,信号传导,转录与翻译,抗氧化,以及外膜蛋白等。含血红素的过氧化氢酶基因（katE）显着上调4-7倍,说明该酶可能是对抗宿主氧化杀伤的的主要功能基因。另外,多个主要外膜蛋白的基因,如ompLl, lipL32, lipL41 lipL48, ompL47等,在接触巨噬细胞的过程中显着下调10-50倍,这与先前动物模型中分离钩体的外膜蛋白定量研究结果一致。本研究进一步用免疫杂交方法验证了这些外膜蛋白在蛋白水平的持续下调。最后,结合比较基因组和基因组更新注释,本研究重新定义分类了钩体转录因子基因家族,并发现OmpR家族主要转录因子基因LB333的表达与主要外膜蛋白基因协同调控,初步说明该因子可能参与主要外膜蛋白的调控。本研究首次揭示了问号钩体应对宿主固有免疫系统的全转录组变化,主要结果与先前体外条件调控转录组的研究结果有显着差异。问号钩体在接触宿主抗原递呈细胞（APCs）过程中显着改变了外膜系统,这可能是重要的免疫逃逸机制,并为今后选择亚单位疫苗靶点提供了重要参考信息。本研究重新定义了钩体基因组中的转录因子基因,这为进一步研究钩体转录调控奠定了基础。钩端螺旋体病（Leptospirosis,钩体病）是世界范围内广泛存在的热带病,尤其在湿热的热带和亚热带地区较为流行。致病性钩端螺旋体（Pathogenic Leptospira）通过粘膜或者伤口感染宿主后,迅速进入血流并扩散到肺,肝,肾和其他组织器官。不同致病性钩体感染宿主的临床症状复杂,包括眼结膜充血,腹泻,黄疸,肾衰和脑膜炎等。强致病性钩体,如问号钩体（Leptospira interrogans）等,所造成急性感染能导致严重的器官损伤。其中严重肺出血的致死率高达15%。近几年,固有免疫系统被证实在钩体急性感染中起到了重要作用。致病性钩体能够逃避宿主巨噬细胞的吞噬,且诱导宿主细胞凋亡。巨噬细胞作为固有免疫系统中主要的免疫效应细胞之一,在吞噬和杀灭,抗原递呈以及免疫调节等方面起到了重要作用。问号钩体感染鼠类和人后,仅可以在人源巨噬细胞中存活并繁殖,这可能与问号钩体慢性感染鼠类和急性感染人类后不同的临床症状呈正相关。目前研究致病性钩体与宿主巨噬细胞互作的分子机制研究仅停留在个别基因或者信号通路上,缺少全局性认识。本研究采用本论文第一部分的钩体感染巨噬细胞系模型和全转录组基因芯片技术,结合GO和KEGG基因功能和分类数据库,初步揭示了问号钩体赖型赖株56601感染鼠源和人源巨噬细胞系后基因转录水平的整体差异。通过比较转录组学研究,发现两类细胞在炎症因子和趋化因子表达上存在较大差异；人源巨噬细胞系的抗原递呈途径基因受调控幅度明显小于鼠源细胞；发现补体途径中处于核心地位的C3组分在鼠源细胞中显着上调,这可能有助于鼠类宿主感染初期的补体激活；凋亡途径中,CASP8凋亡调控基因的显着上调,这与本实验室已发表的问号钩体通过caspase-8釉caspase-3通路诱导宿主细胞凋亡的结论一致。钩体病临床症状多样,致病型钩体菌体物质成分复杂,这都决定了钩体感染研究是一项任重道远的工作。本研究通过高通量基因表达谱筛选和生物途径统计分析,发现了一些钩体感染鼠源和人源巨噬细胞系后表达水平的差异,为进一步深入研究钩体感染的固有免疫机理奠定了基础。双曲钩端螺旋体（Leptospira biflexa）的转录调控系统较伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdoriferi）更为复杂,主要表现为基因组较大,编码100多个特异性转录因子（specific TF）.双曲钩体没有非特异性Sigma S （RpoS）转录因子,所以Sigma N （Sigma54, RpoN）转录因子可能在转录调控中起到了更大的作用。但由于钩体特异性转录因子较多,钩体RpoN在转录调控中的作用可能与伯氏疏螺旋体的RpoN大不相同。本研究采用同源重组基因敲除的方法,定点失活了双曲钩体的RpoN转录因子。进一步采用全转录组基因芯片技术检测了该转录因子的调控靶点。双曲钩体RpoN的调控靶点主要是氮源代谢相关基因,与模式生物大肠杆菌相似。野生株和突变体的培养物中吐温-80成分的消耗量差异显着,突变体的消耗量大幅度减少。通过Cryo-ET分子电镜结构分析和尼罗红染色,发现双曲钩体RpoN突变体已经不再形成聚beta-羟基丁酸（PHB）贮藏物。这可能与RpoN正调控氨摄取基因有关。另外,RpoN突变体在纯水中的死亡速度明显快于野生株。本研究是钩端螺旋体上第一项定点敲除转录因子研究其调控机理的分子细菌学研究。双曲钩体RpoN突变体丧失了合成贮藏物的能力,并且在纯水中的生存能力也明显下降。这说明RpoN转录因子对于双曲钩体在无养料条件下的耐受能力至关重要的。考虑到问号钩体与双曲钩体的Sigma非特异性转录调控系统基本相同,可以推测问号钩体的RpoN也是正调控其体外生长传播能力的主要因子。钩体病（Leptospirosis）是世界范围内广泛分布的人畜共患病。问号钩体（Leptospira interrogans）是造成该传染病的主要致病菌。目前,致病性钩体仍然缺乏有效的基因操作手段,且其结构生物学研究尚未开展,所以该致病菌的分子生物学特性和该全球性公共疾病的致病机理尚不明了。本研究采用低温电镜技术（Cryo-electron tomography, Cryo-ET）比较分析致病性问号钩体和腐生性双曲钩体的精细结构,揭示了钩体的一些生物学新特性和可能的致病机理。问号与双曲钩体的主要区别是两者有不同含量的LPS成分。这初步证明了钩体LPS含量在不同血清型之间差别很大的推论。钩体独特的胞质纤维成分可能是决定钩体特有的螺旋状形态的骨架。冰冻活钩体的DNA成分在柱状细胞内呈紧密束状存在,折叠的间隙约为3.3nm。另外,本研究也揭示了双曲钩体特有的甲基接收蛋白结构,钩体特有的顶端“帽子”结构,和钩体鞭毛马达的高精细结构。这些新发现不仅阐明了钩体的独特的结构和形态,也为研究钩体与宿主互作过程中的感染机制奠定了基础。
张磊[3]（2010）在《问号钩端螺旋体粘附侵袭相关基因mce功能鉴定》文中研究表明背景和目的:钩端螺旋体（简称钩体）病是全世界范围内流行的,由致病性钩体感染引起的人兽共患传染病。据估计,全世界每年有超过500,000的钩端螺旋体感染病例,死亡率达5～20%。钩体病的致病机制至今未明是对钩体病加以有效控制的主要障碍。钩体可分为致病性的问号钩体和非致病的腐生性双曲钩体,前者感染人或动物后可引起钩端螺旋体病。黏附入侵巨噬细胞是致病性钩体的主要特性之一。问号钩体强大的侵袭力使其能迅速穿越人、动物皮肤或黏膜侵入血流引起钩体血症,故问号钩体的粘附侵袭力与其致病性密切相关,但其分子机制不明。虽然有文献报道问号钩体可以粘附侵入小鼠单核巨噬样细胞（J774A.1）,并且推测mce基因可能与问号钩体粘附侵入巨噬细胞相关,然而mce基因的功能至今仍未得到证实。本研究旨在确定各问号钩体菌株携带粘附侵袭相关基因mce的情况,了解问号钩体感染细胞前后mce基因转录水平的变化。通过原核表达rMce并制备其抗血清,分析兔抗rMce血清是否能够抑制问号钩体的粘附小鼠单核巨噬样细胞（J774A.1）。并通过同源重组的方法构建问号钩体mce缺失突变株,在细胞模型中进一步证实问号钩体mce基因是否具有粘附侵袭功能。实验方法:采用PCR扩增我国15群15型问号钩体参考标准株和2株双曲钩体全长mce基因片段,T-A克隆后测序。采用基因工程技术构建问号钩体赖株mce基因原核表达系统。SDS-PAGE联合Bio-Rad凝胶图象分析系统检查目的重组蛋白rMce表达情况。通过Ni-NTA亲和层析法提纯表达的目的重组蛋白。采用皮内多点注射免疫法制备兔抗rMce血清并通过Western Blot对表达的rMce进行鉴定。采用实时荧光定量RT-PCR法检测问号钩体赖株感染小鼠单核巨噬样细胞后,mce基因在不同时间点转录水平上的变化。通过同源重组,将问号钩体赖株mce基因靶向敲除。采用细胞模型,通过Fontana银染法、双荧光染色法,分析兔抗rMce血清对问号钩体粘附宿主细胞的阻断作用以及问号钩体赖株mce基因缺失突变株粘附和侵袭小鼠单核巨噬样细胞能力的变化。结果:我国15株问号钩体株均携带mce基因,双曲钩体则否。与报道的问号钩体赖株mce基因序列（GenBank accession No.:NP712236）比较,所克隆的各菌株mce基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99.0%～100%和97.9%～100%。所构建的mce基因原核表达系统能表达rMce,其产量约为细菌总蛋白的5%。问号钩体赖株全菌兔抗血清和兔抗rMce血清均能有效识别rMce并阻断问号钩体粘附J774A.1细胞。问号钩体赖株感染小鼠单核巨噬样细胞30、60、90、120分钟后,mce基因转录水平最高上调6.10倍（P＜0.05）。通过同源重组成功构建了问号钩体赖株的mce基因缺失突变株。Fontana银染法和荧光分光光度法检测结果显示,问号钩体赖株mce基因缺失突变株对小鼠单核巨噬样细胞的黏附能力和侵袭能力比野生株分别降低了59.8%和72.7%（P＜0.05）。结论:mce基因仅存在于致病性的问号钩体中,mce基因产物是序列保守的外膜蛋白。所构建的mce基因原核表达系统能很好地表达rMce蛋白,所制备的rMce抗血清能有效阻断问号钩体粘附宿主细胞。问号钩体感染小鼠单核巨噬样细胞后,mce基因转录水平呈细胞接触上调模式。问号钩体赖株mce基因缺失突变株对小鼠单核巨噬样细胞的黏附能力和侵袭能力与野生株相比下降明显,表明该基因与问号钩体致病性密切相关。
王中平[4]（2007）在《赖型钩端螺旋体毒力基因mviN的克隆表达及功能研究》文中认为钩端螺旋体（Leptospira）是系统发育进化上结构和遗传特征都较特殊的一类微生物，它所导致的钩端螺旋体病是在世界范围内流行的人兽共患自然疫源性疾病。问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型56601株全基因组测序于2003年由中国科学家完成，对钩端螺旋体的研究重点将转向功能蛋白组学研究。钩端螺旋体与宿主相互作用是钩端螺旋体致病机制的关键环节。因此，研究与钩端螺旋体粘附侵袭相关的毒力因子的功能，对阐明钩端螺旋体致病机制和免疫机理具有重要意义。通过全基因组生物信息学分析发现，mviN基因是个粘附侵袭毒力基因，存在于许多致病微生物中。钩端螺旋体mviN基因读码框含有1596个核苷酸序列，编码531个氨基酸，表达产物是一跨膜蛋白。本研究以问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型017株基因组为实验材料，PCR扩增出含完整读码框的mviN基因，与原核表达质粒pET32a（+）连接构建重组表达质粒pET-mviN，在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达。以全菌体总蛋白作SDS-PAGE，并以兔抗全钩端螺旋体多价血清为一抗，以HRP标记羊抗兔IgG为二抗作Western-blot分析。结果显示成功表达了分子量约为80kD的MviN融合蛋白。MviN融合蛋白在菌体内主要以可溶性方式表达，经亲和层析纯化，获得了高纯度的MviN融合蛋白。进一步构建了mviN基因与pcDNA3.1（+）的真核重组表达质粒pcDNA3.1-mviN；利用脂质体介导pcDNA3.1-mviN转染COS7细胞，并以RT-PCR法检测其表达情况。以MviN融合蛋白作用于A549和ECV304细胞，观察该蛋白对细胞增殖的影响作用。结果显示，MviN融合蛋白显着抑制这两种细胞的增殖，且该效应随着MviN融合蛋白浓度升高而越明显。还应用流式细胞术检测方法，观察了MviN融合蛋白对ECV304及A549细胞凋亡的作用，实验结果表明MviN融合蛋白能促进细胞凋亡。本研究初步阐明了mviN基因在钩端螺旋体致病机制和免疫机理方面的作用，为进一步研究奠定了基础。
王欣莹[5]（2006）在《问号钩端螺旋体鞭毛相关基因flhA、flhB和fliR突变株的构建及其功能的初步研究》文中研究说明钩端螺旋体（以下简称钩体）病是世界范围内流行的人兽共患的自然疫源性疾病。尽管不少学者一直致力于钩体致病机制的研究并取得一定的进展,但人们对钩体致病机制仍所知甚少。在许多细菌中,Ⅲ型分泌系统产物参与了对宿主细胞的粘附、侵入,诱导宿主细胞损伤。某些鞭毛相关蛋白也是Ⅲ型分泌系统家族成员。因此研究钩体鞭毛相关基因的功能可能有助于阐明其在粘附与侵入宿主细胞过程中的致病机制。本实验克隆了问号钩体56601株鞭毛相关基因flhA、flhB和fliR,构建其原核表达系统。针对基因flhA、flhB和fliR分别设计两对siRNA,电穿孔法导入钩体内,半定量RT-PCR技术检测钩体flhA、flhB和fliR基因mRNA的表达水平。构建插入失活型基因打靶载体,将其导入钩体内,构建flhA、flhB和fliR基因突变株。Fontana镀银染色法观察钩体56601标准株及flhA、flhB突变株粘附J774A.1细胞的能力。流式细胞术法检测钩体56601标准株及flhA、flhB突变株诱导J774A.1细胞坏死和凋亡的情况。结果表明:构建的原核表达系统在IPTG诱导下,能够表达目的重组蛋白rFlhA、rFlhB和rFliR。导入siRNA后,在荧光显微镜下观察到钩体内出现绿色荧光物质。半定量RT-PCR结果显示,flhA的两对特异性siRNA均能抑制其mRNA的表达;fliR的一对siRNA对其mRNA产生抑制。导入自杀质粒pUC18KA和pUC18KB的钩体能在含有卡那霉素的平板上生长。问号钩体56601标准株和flhA、flhB突变株均可粘附J774A.1细胞,但突变株的粘附率较低。在J774A.1细胞中,flhA突变株引起细胞坏死和凋亡的比率较标准株和flhB突变株低。推测极有可能钩体鞭毛相关基因flhA和flhB的产物参与了对宿主细胞的粘附、侵入、分泌毒性蛋白,从而诱导宿主细胞损伤。这些实验为进一步研究问号钩体鞭毛相关基因产物的致病功能奠定了基础。
朱庆平[6]（2005）在《赖型钩端螺旋体致病相关基因invA的克隆、表达及其功能研究》文中提出钩体为广泛流行的人兽共患病——钩体病的病原体。目前,对钩体的致病及免疫分子机理的认识不甚清楚。赖型钩体56601株及哥本哈根株基因组测序表明,约60%的钩体预测基因的功能未知。因此,钩体的重要致病及免疫相关基因功能急需加强研究。 invA基因存在于致病的赖型钩体56601株及哥本哈根株中,信息分析表明,该基因与巴尔通体内的与编码侵袭能力相关蛋白IalA的基因等具有很高的相似性;以PCR扩增试验也证实,invA基因存在于强毒赖型钩体017株中,但不存在于无毒钩体Patoc Ⅰ株中。提示invA基因很可能为致病相关基因,同时,也很可能是一个免疫侯选基因及用于钩体诊断的目的基因。 本研究选择赖型钩体017株中invA基因为目标,PCR扩增出含完整读码框的invA基因,与原核表达载体pET32a（+）连接构建重组表达载体pETINVA,在大肠杆菌BL21（DE3）中表达出分子量约为35kDa的InvA融
于向华,鲍朗,谢勇恩,张会东[7]（2002）在《钩端螺旋体赖型017鞭毛钩相关蛋白K基因的克隆及序列分析》文中研究指明在以抑制消减杂交比较强毒株赖型钩端螺旋体017株和无毒株双曲钩体Patoc I株 的基因组差异时,获得了一系列仅存在于强毒株而无毒株缺如的差异片段.选取差异片段AF325810设计特异性引物,以赖型钩端螺旋体017株基因组DNA为模板,进行巢式PCR扩增,PCR纯化产物T载体克隆,选取阳性克隆测序,进一步进行生物信息学分析,以获得强毒株赖型钩端螺旋体017株特有的毒力相关基因,DOT BLOT显示其在钩端螺旋体各株间有不同分布PCR扩增得到了产物为2kb大小的DNA片段,序列分析结果显示得到了问号钩端螺旋体赖型017株的鞭毛钩相关蛋白K基因的上游序列,为进一步探索钩端螺旋体的致病机制奠定了基础.
寇志华[8]（2001）在《钩端螺旋体保守性抗原与疫苗研究》文中进行了进一步梳理钩端螺旋体病，简称钩体病，是由致病性钩端螺旋体感染所致，是一种分布广泛的人兽共患病，由于其发病急、临床症状复杂多样且不典型，极易误诊和漏诊，因此，钩体病的实验室诊断和预防对于控制钩体病的流行具有重要的意义。目前应用的钩体灭活疫苗及试用的外膜疫苗虽然具有很好的预防同型钩体感染的效果，但二者都不能有效地预防多种不同血清型钩体的感染，而且免疫持续时间短。因此研究编码钩体保守性抗原及保护性抗原的基因，对于致病性钩体的诊断和疫苗研究具有重要的意义。本实验首次克隆分析并表达了中国钩体特有血清型56609的四种保守性抗原的编码基因flaB、ompL1、lipL41和lipL32；构建了3种DNA疫苗pcD－flaB、pcD－ompL1和pcD－lipL41，并进行了在豚鼠、小鼠和仔猪体内的免疫保护性研究，以及豚鼠小鼠体内的安全性研究，对基于 lipL32基因的 PCR方法用于致病性钩体的诊断进行了探讨。结果（1）成功克隆了四种基因并表达了GST－FlaB、GST－LipL32和GST－LipL41；（2）三种DNA疫苗均具有不同程度的免疫保护效果，其中pcD-flaB效果最佳，不但具有较好的预防同型钩体感染的作用，还具有交叉保护作用；（3）pcD-flaB具有比灭活苗和亚单位疫苗较好的保护效果；（4）DNA疫苗pcD-flaB不但激活了体液免疫，而且也激活了Thl应答；（5）未检测出与宿主染色体DNA发生整合；（6）基于lipL32基因的比PCR法可以特异性地诊断钩体。 以上结果表明DNA疫苗pcD-flaB具有较好的免疫保护性和安全性，有望用于钩体的预防：基于lipL32基因的PCR方法有望用于致病性钩体的诊断。
二、钩端螺旋体赖型017鞭毛钩相关蛋白K基因的克隆及序列分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、钩端螺旋体赖型017鞭毛钩相关蛋白K基因的克隆及序列分析（论文提纲范文）
（1）禽致病性大肠杆菌ompT缺失株特性及其对雏鸡小肠炎症相关基因表达的影响（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 课题来源 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写词表 |
| 文献综述 |
| 1.禽致病性大肠杆菌及其毒力因子概述 |
| 2.OmpT外膜蛋白酶的研究进展 |
| 3.病原菌与小肠相互作用的研究 |
| 4.RNA-Seq技术的应用 |
| 5.本课题研究目的意义 |
| 引言 |
| 主要技术路线 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 试验菌株、质粒及细胞 |
| 1.1.2 试验动物 |
| 1.1.3 主要试剂及试剂盒 |
| 1.1.4 主要培养基及试剂的配制 |
| 1.1.5 仪器设备 |
| 1.2 试验方法与步骤 |
| 1.2.1 目的菌株AE17中ompT基因的检测 |
| 1.2.2 AE17缺失株ΔompT的构建 |
| 1.2.3 回复株ΔompT-comp的构建 |
| 1.2.4 AE17、ΔompT和ΔompT-comp的生物学特性及致病性分析 |
| 1.2.5 基于RNA-Seq技术筛选ompT缺失株差异表达基因 |
| 1.2.6 ompT缺失株感染雏鸡小肠炎症相关基因mRNA的转录水平测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 ompT缺失株及回复株的鉴定 |
| 2.1.1 导入pkD46质粒的菌株鉴定 |
| 2.1.2 导入ompT-pKD3片段的菌株鉴定 |
| 2.1.3 禽致病性大肠杆菌ompT缺失株的构建 |
| 2.1.4 ompT回复株的鉴定 |
| 2.2 ompT缺失株和回复株生物学特性及致病性分析 |
| 2.2.1 生长曲线的测定结果 |
| 2.2.2 运动性测定结果 |
| 2.2.3 环境耐受试验结果 |
| 2.2.4 药敏试验结果 |
| 2.2.5 鸡巨噬细胞吞噬试验结果 |
| 2.2.6 细菌半数致死量(LD50)的测定 |
| 2.2.7 组织载菌量试验 |
| 2.2.8 APEC感染雏鸡空肠组织病理切片观察 |
| 2.3 RNA-Seq数据处理与分析 |
| 2.3.1 RNA-Seq数据预处理结果 |
| 2.3.2 AE17菌株与ΔompT菌株基因组比对结果 |
| 2.3.3 AE17菌株与ΔompT菌株差异基因筛选 |
| 2.3.4 AE17菌株与ΔompT菌株差异表达基因的GO功能分类 |
| 2.3.5 AE17与ΔompT菌株差异基因的KEGG信号通路功能分类 |
| 2.3.6 RT-PCR验证差异基因 |
| 2.4 AE17与ΔompT感染雏鸡空肠炎症相关基因转录水平的检测 |
| 2.4.1 空肠中PTGDSmRNA转录水平的检测 |
| 2.4.2 空肠中MMEmRNA转录水平的检测 |
| 3 讨论 |
| 3.1 ompT基因缺失株、回复株的构建及其对生物学和致病性的影响 |
| 3.2 运用RNA-Seq筛选ompT基因缺失株差异表达基因 |
| 3.3 AE17及其ompT基因缺失株对雏鸡空肠炎症相关基因表达的影响 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（2）钩端螺旋体感染的转录组学与钩体结构生物学研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 第一部分 |
| 中文摘要（一） |
| Abstract（1） |
| 第二部分 |
| 中文摘要（二） |
| Abstract（2） |
| 第三部分 |
| 中文摘要（三） |
| Abstract（3） |
| 第四部分 |
| 中文摘要（四） |
| Abstract（4） |
| 第一部分 感染巨噬细胞系的问号钩端螺旋体（Leptospira interrogans）的转录组学研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 主要试剂配制方法 |
| 2.4 菌株及细胞系 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.5.1 巨噬样细胞感染模型 |
| 2.5.2 RNA纯化与双链cDNA合成 |
| 2.5.3 基因芯片设计与杂交 |
| 2.5.4 数据提取与统计分析 |
| 2.5.5 芯片数据的定量PCR验证 |
| 2.5.6 细菌总蛋白和外膜蛋白的提取 |
| 2.5.7 Western blotting验证蛋白表达调控 |
| 2.5.8 基因组注释,转录组数据的聚类和生物途径分析 |
| 2.5.9 转录因子的再定义与进化分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 基因组补充注释 |
| 3.2 转录组聚类分析 |
| 3.3 KEGG生物途径分析 |
| 3.4 能量,碳源和脂类代谢 |
| 3.5 抗氧化与DNA修复 |
| 3.6 信号传导,趋化和动力 |
| 3.7 LPS和O抗原合成 |
| 3.8 鞘磷脂酶和溶血酶 |
| 3.9 其他致病性相关基因 |
| 3.10 外膜蛋白与脂蛋白 |
| 3.11 转录因子预测与功能分析 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录1 钩体感染巨噬细胞后显着上调3倍以上的基因列表 |
| 附录2 钩体感染巨噬细胞后显着下调5倍或者5倍以上的基因列表 |
| 第二部分 感染问号钩端螺旋体（Leptospira interrogans）的鼠源和人源巨噬细胞系的比较转录组学研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 主要试剂配制方法 |
| 2.4 实验动物及菌株 |
| 2.4.1 实验动物 |
| 2.4.2 菌株 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.5.1 细菌和细胞的培养 |
| 2.5.2 感染模型 |
| 2.5.3 细胞总RNA的提取与cDNA合成 |
| 2.5.4 基因芯片杂交与数据分析 |
| 2.5.5 定量RT-PCR验证 |
| 3 结果 |
| 3.1 巨噬样细胞总RNA的完整性验证 |
| 3.2 芯片数据的定量RT-PCR验证 |
| 3.3 转录组学与途径分析 |
| 3.4 炎症细胞因子与其受体的调控 |
| 3.5 趋化因子与其受体的调控 |
| 3.6 抗原获取,处理及递呈途径的调控 |
| 3.7 凋亡途径的调控 |
| 3.8 Toll样受体途径的调控 |
| 3.9 补体与凝集途径的调控 |
| 3.10 NF-kB信号途径 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录1 感染问号钩体4h后的J774A.1细胞中上调最显着的100个功能基因列表 |
| 附录2 感染问号钩体4h后的J774A.1细胞中下调最显着的100个功能基因列表 |
| 附录3 感染问号钩体4h后的THP-1细胞中上调最显着的100个功能基因列表 |
| 附录4 感染问号钩体4h后的THP-1细胞中下调最显着的100个功能基因列表 |
| 第三部分 双曲钩端螺旋体（Leptospira biflexa）的Sigma N（RpoN）转录因子调控机理研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 主要试剂配制方法 |
| 2.4 菌株及质粒 |
| 2.5 RpoN基因敲除自杀质粒的构建 |
| 2.6 自杀质粒转染及单克隆检测 |
| 2.7 RpoN突变体的确认及极性效应检测 |
| 2.8 基因芯片设计及杂交 |
| 2.9 野生型与突变体的生长特点分析 |
| 2.10 突变体的Cryo-ET低温电镜分析 |
| 2.11 贮藏物PHB的尼罗红染色分析 |
| 2.12 EMJH中乳化反应现象和脂类成分定量分析 |
| 2.13 RpoN外膜蛋白及胞内蛋白调控分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 RpoN转录因子序列和功能结构域分析 |
| 3.2 RpoN基因敲除突变体的确认 |
| 3.3 RpoN突变体的操纵子和极性效应分析 |
| 3.4 双曲钩体RpoN调控基因分析 |
| 3.5 双曲钩体及其RpoN突变体生长对比分析 |
| 3.6 RpoN调控聚beta-羟基丁酸贮藏物合成 |
| 3.7 RpoN调控双曲钩体的脂类摄取 |
| 3.8 RpoN调控外膜脂溶性蛋白组分半定量分析 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 致病性问号钩端螺旋体（Leptospira interrogans）与腐生性双曲钩端螺旋体（Leptospira biflexa）的比较结构生物学研究 |
| 1 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 菌株及培养条件 |
| 2.2 Cryo-ET数据收集及三维重构 |
| 2.3 荧光染色及成像 |
| 2.4 外膜蛋白抽提及蛋白分析 |
| 2.5 钩体鞭毛基因的比较分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 钩体细胞膜精细结构 |
| 3.2 钩体细胞帽子结构 |
| 3.3 趋化蛋白列阵 |
| 3.4 钩体鞭毛马达结构 |
| 3.5 钩体基因组DNA结构 |
| 3.6 独特的细胞骨架结构 |
| 3.7 钩体的贮藏物 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在读期间所取得的科研成果 |
（3）问号钩端螺旋体粘附侵袭相关基因mce功能鉴定（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 目次 |
| 1 引言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 研究内容 |
| 1.3 技术路线 |
| 2 第一部分 MCE基因序列比对及原核表达系统的构建 |
| 2.1 主要试剂及仪器 |
| 2.2 实验方法和步骤 |
| 2.3 实验结果 |
| 3 第二部分 目的重组蛋白的表达及兔抗RMCE血清的粘附阻断作用 |
| 3.1 主要试验材料及仪器 |
| 3.2 实验方法和步骤 |
| 3.3 实验结果 |
| 4 第三部分 MCE MRNA表达水平变化的检测 |
| 4.1 主要仪器和试剂和实验材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 5 第四部分 MCE缺失突变株的构建及其粘附侵袭能力的变化 |
| 5.1 主要仪器和试剂 |
| 5.2 实验方法和步骤 |
| 5.3 实验结果 |
| 6 讨论 |
| 7 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 作者简历与攻读学位期间取得的科研成果 |
（4）赖型钩端螺旋体毒力基因mviN的克隆表达及功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 赖型钩端螺旋体毒力基因mviN原核表达质粒的构建及其表达 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 附图 |
| 第二部分 赖型钩端螺旋体毒力基因mviN真核表达质粒的构建及其表达 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 附图 |
| 第三部分 赖型钩端螺旋体毒力基因mviN表达产物的细胞效用研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 附图表 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 致谢 |
（5）问号钩端螺旋体鞭毛相关基因flhA、flhB和fliR突变株的构建及其功能的初步研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 文献回顾 |
| 1 细菌Ⅲ型分泌系统与细菌侵袭力 |
| 2 钩端螺旋体的致病机制 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 问号钩端螺旋体鞭毛相关基因FLHA、FLHB 和FLIR 的克隆及原核表达系统的构建 |
| 实验二 SIRNA 特异性抑制问号钩端螺旋体FLHA、FLHB 和FLIR 基因MRNA 表达的研究 |
| 实验三 应用基因打靶技术构建问号钩端螺旋体FLHA、FLH和FLIR 基因突变株 |
| 实验四 问号钩端螺旋体FLHA 和FLHB 基因突变株粘附和诱导J774A.1 细胞凋亡的研究 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 主要试剂配制法 |
| 攻读博士期间发表的学术论文 |
| 摘 要 |
| ABSTRACT |
| 致 谢 |
（6）赖型钩端螺旋体致病相关基因invA的克隆、表达及其功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 钩端螺旋体致病相关基因inv A基因原核表达质粒的构建及其表达 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 钩体InvA蛋白多克隆抗体的制备及其免疫学功能鉴定 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 钩端螺旋体InvA蛋白的促细胞增殖及细菌侵袭效应 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第四部分 大肠杆菌-钩端螺旋体重组穿梭质粒pGKINVA的构建及重组钩体的筛选 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 声明 |
（8）钩端螺旋体保守性抗原与疫苗研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 总论 |
| 第一部分 钩端螺旋体56609株保守性抗原编码基因的克隆、分析和表达 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二部分 钩端螺旋体DNA疫苗免疫保护性住研究 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三部 基于钩端螺旋体DNA疫苗的安全性分析──染色体DNA整合试验 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 总结 |
| 综述 |
| 论文发表情况 |
| 致谢 |
四、钩端螺旋体赖型017鞭毛钩相关蛋白K基因的克隆及序列分析（论文参考文献）
- [1]禽致病性大肠杆菌ompT缺失株特性及其对雏鸡小肠炎症相关基因表达的影响[D]. 王琦. 安徽农业大学, 2018(02)
- [2]钩端螺旋体感染的转录组学与钩体结构生物学研究[D]. 薛峰. 浙江大学, 2011(07)
- [3]问号钩端螺旋体粘附侵袭相关基因mce功能鉴定[D]. 张磊. 浙江大学, 2010(08)
- [4]赖型钩端螺旋体毒力基因mviN的克隆表达及功能研究[D]. 王中平. 四川大学, 2007(04)
- [5]问号钩端螺旋体鞭毛相关基因flhA、flhB和fliR突变株的构建及其功能的初步研究[D]. 王欣莹. 吉林大学, 2006(05)
- [6]赖型钩端螺旋体致病相关基因invA的克隆、表达及其功能研究[D]. 朱庆平. 四川大学, 2005(02)
- [7]钩端螺旋体赖型017鞭毛钩相关蛋白K基因的克隆及序列分析[J]. 于向华,鲍朗,谢勇恩,张会东. 生命科学研究, 2002(S1)
- [8]钩端螺旋体保守性抗原与疫苗研究[D]. 寇志华. 第二军医大学, 2001(01)