一、A novel tumor-suppressor candidate gene-ndr2 is differentially expressed between osteoarthritis synovium cells and rheumatoid arthritis synoviuni fibroblasts（论文文献综述）
代二琴[1]（2021）在《雷公藤红素作用RA-FLS的组学联合分析》文中研究指明类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）是一种慢性全身性的自身免疫性疾病,临床表现为滑膜细胞增生、血管翳形成以及关节软骨和骨破坏。RA患者的滑膜细胞在缺氧和低营养的封闭炎症环境中诱变为成纤维样滑膜细胞（Fibroblast-like synoviocytes,FLS）,成纤维样滑膜细胞作为滑膜炎的主要组成细胞,它的侵袭和抗凋亡特性,调节免疫反应和慢性炎症的能力,最终使它成为类风湿关节炎的主要参与者。已有研究表明雷公藤红素（Celastrol,CEL）具有抗炎和抗癌的作用,其具体机制尚未完全清晰。本研究计划以RA患者FLS为研究对象,以CEL处理为实验组（High Dose,HD）,以DMSO处理为对照组（Control,Ctrl）,对HD组和Ctrl组分别进行RNA-Seq和Label-free,筛选出差异表达基因和差异表达蛋白,进一步筛选出显着差异表达基因和显着差异表达蛋白进行组学联合分析,对GO功能和Pathway途径富集分析,挑选6个候选基因,进行分子对接模拟、q RT-PCR和Western blot验证,探索CEL治疗RA的机制。本研究获得以下结果:1.对HD vs Ctrl的转录水平鉴定得到26565个表达基因,其中差异表达基因7803个,上调4479个,下调3324个;蛋白水平分析鉴定到3372个表达蛋白,差异表达蛋白共687个,357个上调,330个下调;其中一组样品中两次及以上不为空值,另一组所有数据均为空值的差异蛋白393个,169个上调,224个下调;其余部分的差异表达蛋白294个,其中106个上调,188个下调。2.当某一个蛋白被鉴定到且在转录组水平有表达信息时,则认为基因和蛋白被关联到。所有定量蛋白与关联的基因的相关性系数为0.2067,显着差异蛋白与关联的显着差异基因的相关性系数为0.2507,说明转录本与其关联的蛋白质表达一致性并不高。3.本研究采用转录组学和蛋白组学联合分析的方法来研究CEL治疗类风湿关节炎机制,共得到1897个关联上的差异表达基因,在蛋白质水平和转录组均无显着差异的基因有1254个,均有显着差异的基因有80个（转录水平和蛋白水平均上调的有36个;均下调的有15个;转录水平下调蛋白水平上调的27个;转录水平上调蛋白水平下调的2个）;仅在蛋白质水平有显着差异的基因有103个;仅在转录组水平有显着差异的基因有460个。4.从关联上的80个显着差异基因的蛋白中筛选已有晶体结构的蛋白,挑选6个,与CEL进行分子对接模拟,验证分子层面CEL与候选蛋白可以相互作用,揭示CEL与候选蛋白的结合能、结合方式和最佳结合位置,用于后续CEL活性结构修饰。5.对候选基因进行q RT-PCR验证,仅ANXA6（p=0.0013）和THBS1（p=0.0077）显着差异表达,使得候选基因的目标范围进一步缩小。6.对候选基因ANXA6的蛋白进行Western blot验证,结果表明相对于Ctrl组,HD组ANXA6的蛋白表达量明显上调。本研究探索了CEL对RA-FLS凋亡作用的分子机制,为RA的靶向治疗提供了一定的理论依据。通过对转录组和蛋白组联合分析筛选出来的关键蛋白,验证后获得的靶蛋白Annexin A6,为Annexin A6在CEL治疗RA的机制奠定基础。
李晓辰[2]（2021）在《TRPM7介导膝骨关节炎中滑膜巨噬细胞M1型极化的机制研究及膝痹宁方的干预作用》文中研究指明目的:探究瞬时电位受体通道（Transient receptor potential melastatin 7,TRPM7）介导膝骨关节炎（Knee osteoarthritis,KOA）滑膜巨噬细胞M1型极化的分子机制以及膝痹宁方的干预效应。方法:1)体内实验采用内侧半月板失稳（destabilization of the medial meniscus,DMM）方法使C57BL/6小鼠膝关节失稳,ELISA检测血清中炎症因子IL-1β和TNF-α水平,通过HE染色评估滑膜炎症并行Krenn评分,通过番红O固绿染色评估软骨退变并行OARSI评分,采用免疫荧光双重染色技术标记F4/80与iNOS或CD206等巨噬细胞特异性标记物,以评估机械应力失常的KOA模型中滑膜巨噬细胞的极化方向。2)体外实验采用细胞应力加载系统,给与巨噬细胞5HZ的0%、7%、12%幅度的循环机械牵张力,Western Blot和PCR检测M1型巨噬细胞极化标记物iNOS、IL-1β及M2型巨噬细胞极化标记物CD206、Arg-1蛋白和基因的表达;应用TRPM7的选择性抑制剂NS8593,给与巨噬细胞5HZ的12%的循环机械牵张力,Western Blot和PCR检测iNOS、IL-1β、CD206、Arg-1蛋白和基因的表达。3)应用TRPM7的小干扰RNA,验证小干扰RNA效率,Western Blot检测TRPM7、ERK1/2及其磷酸化、P65及其磷酸化和IκBα等表达变化。4)应用TRPM7选择性抑制剂,通过HE染色、天狼星红染色和番红O固绿染色分别观察KOA小鼠滑膜炎症、纤维化及软骨退变并分别行滑膜Krenn和软骨OARSI评分,采用免疫荧光双重染色技术标记F4/80与iNOS或CD206等巨噬细胞特异性标记物,ELISA检测血清中炎症因子IL-1β和TNF-α水平,Western Blot检测滑膜组织中TRPM7、ERK1/2及其磷酸化、P65及其磷酸化和IκBα等蛋白表达变化,Western Blot和PCR检测软骨组织基质降解相关蛋白和基因表达变化。5)DMM方法建立KOA小鼠模型,TRPM7抑制剂组为阳性对照组,膝痹宁组为观察组,通过HE染色、天狼星红染色和番红O固绿染色分别观察KOA小鼠滑膜炎症、纤维化及软骨退变并分别行滑膜Krenn和软骨OARSI评分,ELISA检测血清中炎症因子IL-1β和TNF-α水平,Western Blot和PCR检测软骨组织基质降解相关蛋白和基因表达变化。6)DMM方法建立KOA小鼠模型,采用免疫荧光双重染色技术标记F4/80与iNOS或CD206等巨噬细胞特异性标记物,观察KOA模型中滑膜巨噬细胞的极化表型,Western Blot检测滑膜组织中TRPM7、ERK1/2及其磷酸化、P65及其磷酸化和IKBα等的蛋白表达。结果:1)DMM方法建立的KOA小鼠模型中,表现出滑膜炎症和软骨退变,血清IL-1β、TNF-α表达增高,滑膜巨噬细胞浸润增多,iNOS阳性细胞比率显着上调（P<0.05）。2)7%的循环机械牵张力干预巨噬细胞后,与0%组相比,CD206和Arg-1蛋白表达上调,iNOS、IL-1β蛋白表达下调（P<0.05）;而12%组iNOS、IL-1β蛋白相比于0%组表达显着上调,CD206和Arg-1蛋白表达下调（P<0.05）;应用TRPM7抑制剂后,12%循环牵张力造成的iNOS、IL-1β上调趋势下降,而CD206和Arg-1下调趋势回调（P<0.05）。3)12%的机械牵张力可以增强TRPM7的蛋白表达,ERK和P65的磷酸化增多,使IκBα表达下调（P<0.05）,在应用TRPM7的siRNA后,ERK和P65磷酸化减少,IκBα表达回调（P<0.05）。4)对比假手术组小鼠,KOA小鼠滑膜和软骨病理评分显着增高,滑膜组织中的TRPM7、ERK和P65磷酸化明显增多（P<0.05）;而在给与小鼠选择性抑制剂后,病理评分显着下降,软骨中MMP-3和MMP-13蛋白和基因及Adamts-4和-5基因表达显着下调,滑膜中TRPM7、磷酸化的ERK和P65也显着下调（P<0.05）。5)对比模型组小鼠,膝痹宁组小鼠血清IL-1β、TNF-α显着下调,滑膜和软骨病理评分减少,软骨中MMP-3和MMP-13蛋白和基因及Adamts-4和-5基因表达显着下调（P<0.05）。6)对比模型组小鼠,膝痹宁方显着降低小鼠滑膜组织中M1型巨噬细胞比率,同时也能降低滑膜组织中TRPM7、磷酸化ERK1/2、磷酸化P65等的蛋白表达,同时上调IκBα表达（P<0.05）。结论:1)DMM方法诱导的KOA模型中存在巨噬细胞极化,异常机械应力可以刺激滑膜巨噬细胞极化。2)循环机械牵张力通过激活TRPM7-ERK及NF-κB信号通路诱导巨噬细胞极化。3)膝痹宁方有效改善KOA小鼠滑膜炎症、滑膜纤维化和软骨退变。4)膝痹宁方的治疗效应是通过抑制TRPM7-ERK及NF-κB信号通路的活化,从而抑制滑膜巨噬细胞M1型极化实现的。
汪萧和[3]（2021）在《新橙皮苷在人类风湿滑膜细胞中通过抑制MAPK通路发挥治疗作用》文中研究说明研究背景:类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种慢性且原因不明的自身免疫性临床综合征,主要表现为慢性、全身性、侵蚀性外周关节滑膜组织。成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes,FLS）占据滑膜组织的绝大部分,并与RA发病过程有着密切关系。如何抑制FLS增殖或促进凋亡是研究RA的热点。在类风湿关节炎发病过程中,活化的成纤维样滑膜细胞（RA-FLSs）结合了类似肿瘤的增生特征和骨关节炎的炎症特征,最终导致关节破坏。因此,寻找能有效抑制RA-FLSs异常激活、延缓RA进展的药物势在必行。新橙皮苷（Neo）是黄酮类化合物中的一类活性成分,具有抗炎和抗氧化作用。本研究探讨了Neo对RA-FLSs的抗炎、抗迁移、抗侵袭、抗氧化及凋亡诱导作用,并探讨其作用机制。由于大多数丝裂原激活的蛋白激酶在细胞炎症反应、增殖和凋亡中是重要的信号分子,所以我们选择MAPK通路作为研究的出发点。研究目的:本研究旨在探索新橙皮苷对于人类风湿性滑膜细胞是否具有治疗作用及其作用机制。研究方法:通过在手术室采集类风湿性关节炎患者的膝关节滑膜组织,我们用酶组织块法提取类风湿性成纤维样滑膜细胞（以下称RA-FLS）进行体外培养和实验,培养出具有生物活性的RA-FLS。首先分别加入不同浓度新橙皮苷（0、10、20、30、40、50、60、70μmol/L）并培养48 h,CCK-8法检测新橙皮苷对RA-FLS活力的影响;Western Blot法检测[空白组、TNF-α组、TNF-α+NEO（5μM）组、TNF-α+NEO（10μM）组、TNF-α+NEO（30μM）组、NEO（30μM）组)]处理后MMP-3,MMP-9,MMP-13,p38,P-p38,JNK,P-JNK,ERK,P-ERK,Bcl-2,Bax and cleaved-caspase3的表达情况;q RT-PCR检测[空白组、TNF-α组、TNF-α+NEO（5μM）组、TNF-α+NEO（10μM）组、TNF-α+NEO（30μM）组、NEO（30μM）组)]处理后MMP9,MMP13,IL‐1β,IL‐6,IL-8,and TNF‐α、OPG、RANKL m RNA的表达情况;ELISA实验检测[空白组、TNF-α组、TNF-α+NEO（5μM）组、TNF-α+NEO（10μM）组、TNF-α+NEO（30μM）组、NEO（30μM）组)]处理后IL‐1β,IL‐6,IL-8,and TNF‐α的表达情况。细胞划痕实验检测了（0、5、10、30μM）经过新橙皮苷处理之后细胞迁移能力的变化。用Transwell法检测（0、5、10、30μM）经过新橙皮苷处理之前、之后细胞侵袭能力的变化。采用流式细胞术检测（0、5、10、30μM）新橙皮苷处理后RA-FLS凋亡情况;免疫荧光法检测[空白组、TNF-α组、TNF-α+NEO（5μM）组、TNF-α+NEO（10μM）组、TNF-α+NEO（30μM）组、NEO（30μM）组)]处理后,RA-FLS内活性氧表达变化情况。研究结果:（1）用酶组织块法于第3 d得到原代RA成纤维样滑膜细胞,扩大培养3代后用新橙皮苷处理;（2）CCK-8试验的结果可以提示:10,20和30μM Neo分别导致98%,92%和86%的细胞生存能力,然而,在较高浓度的Neo（>30μM）下,存活率低于80%,与30μM及其以内浓度的对照组存在显着差异（P<0.05）,因此我们研究了在5-30μM浓度下的Neo在RA-FLSs中的作用;（3）Western blot检测可以证明,TNF-α处理组MMP3、MMP9、MMP13显着升高。然而,Neo预处理导致了它们的减少（P<0.05）,而且是以剂量依赖性的方式。ELISA和q RT PCR分析显示,在Neo处理后,促炎细胞因子（包括IL-1,IL-6,IL-8,TNF-α）的水平呈浓度依赖性下降（P<0.05）。此外,q RT PCR检测显示Neo上调了RA-FLSs中OPG m RNA的表达,下调了RANKL的表达（P<0.05）;（4）Transwell实验提示到,同未处理组进行相比,伴随着药物浓度的提升,通过基质胶的细胞数量减少（P<0.05）。细胞划痕实验结果提示到:划痕之后24h,RA-FLSs开始向空白区域迁移。结果表明,5、10、30μM浓度的Neo处理的RA-FLSs细胞的迁移率低于对照组（26.0%、16.2%和9.2 vs.36.9%）（P<0.05）,36 h后这种差异更明显（41.0%、29.2%和18.2 vs.52.9%）（P<0.05）,这些结果表明,Neo以浓度依赖和时间依赖的方式显着减缓了RA-FLSs的迁移;（5）TNF-α处理后,绿色荧光强度高于空白组,然而,这种现象在新橙皮苷的处理中得到了显着的逆转（P<0.05）。细胞内ROS的数量浓度呈浓度依赖性地下降,这些结果表明Neo阻止了ROS在RA-FLSs内产生。（6）采用流式细胞仪检测Neo对细胞凋亡的影响,我们发现经过Neo处理后,RA-FLSs的凋亡率持续升高（P<0.05）。此外,伴随着Neo浓度的增加,其中凋亡细胞占有的百分比持续性升高。通过western blot检测bcl2、Bax和caspase3蛋白的表达水平,Neo显着下调了Bcl-2的表达而同时上调了Bax和caspase3的表达（P<0.05）,结果呈现Bcl-2/Bax比值下降。结果表明,新橙皮苷具有促进RA-FLS凋亡的作用,有助于抑制RA-FLSs的生长。（7）Western blot的实验结果可以证明:TNF-α处理显着激活MAPK通路中p38,JNK,ERK蛋白的磷酸化水平,随着新橙皮苷浓度的上升,MAPK通路蛋白呈浓度依赖式降低（P<0.05）。研究结论:（1）新橙皮苷能够在RA-FLSs中抑制IL-1β、IL-6、IL-8、MMP-9、MMP-13等细胞因子的表达,从而发挥抗炎作用;（2）各种不同浓度的Neo可以以一定的量效和时效关系减轻RA-FLSs的迁移性和侵袭性;（3）Neo拥有诱导RA-FLSs细胞凋亡的作用;（4）Neo可减少RA-FLS内ROS的积累,延缓细胞的氧化过程;（5）Neo显着抑制MAPK通道,表明Neo在RA-FLSs上发挥作用,而且至少部分是经过下调MAPK信号通路;（6）综上所述,我们的结果表明了Neo可能是一种有潜力的治疗类风湿性关节炎的药物。
贾梦莹[4]（2021）在《NLRP3/Caspase-1焦亡经典途径在异常咬合导致颞下颌关节软骨退变中的作用》文中进行了进一步梳理目的:颞下颌关节骨关节炎（Temporomandibular Joint Osteoarthritis,TMJOA）是影响口颌功能的颌面部高发病,髁突软骨缺损难以自愈,其退变分子机制不明。力学刺激直接作用软骨,炎症反应广泛参与髁突软骨破坏。细胞焦亡以释放炎性因子白细胞介素1β（Interleukin-1β）,IL-18为主要特征,参与慢性炎症,而细胞焦亡在TMJOA软骨细胞中的研究甚少。为此本研究旨在探索异常力学刺激下NLRP3/Caspase-1焦亡经典途径在软骨细胞的表达情况,为TMJOA的靶向治疗提供线索。方法:第一部分:（1）临床研究,收集就诊于新疆医科大学第一附属医院颞下颌关节紊乱病患者颞下颌关节滑液,根据CBCT或MRI检查分为伴髁突骨质破坏的TMJOA患者组与不伴髁突骨质破坏的颞下颌关节结构紊乱病（Temporomandibular Joint internal derangement,TMJID）组,分析临床基线资料。（2）酶联免疫法（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）分析焦亡相关炎性介质IL-1β,IL-18,Caspase-1,NLRP3在两组的表达差异。第二部分:（1）组织水平,通过SD大鼠单侧前牙反牙合（Unilateral anterior crossbite,UAC）干预4周,8周,12周,建立TMJOA模型,通过体式显微镜观察软骨形态结构,Micro-CT扫描软骨下骨,Mimics 20.0系统分析骨体积分数BV/TV,骨表面积与骨体积比BS/TV,骨小梁厚度Tb.Th及骨小梁个数Tb.N,评价软骨下骨改建情况,组织病理学检查及评分系统评价软骨病损特征。（2）使用免疫组织化学技术检测焦亡经典途径关键分子IL-1β,IL-18,NLRP3,ASC,Caspase-1,GSDMD在正常组与UAC诱导组颞下颌关节组织的表达及分布,实时聚合酶链式反应（Real time polymerase chain reaction,RT-PCR）以及蛋白印迹法（Western blot,WB）检测焦亡关键基因及蛋白在UAC诱导组与对照组的表达情况。第三部分:（1）分子水平,分离培养SD大鼠软骨细胞,分别采用0 dyn/cm2,4 dyn/cm2,12dyn/cm2,16 dyn/cm2的流体剪切力（Fluid Flow Shear Stress,FFSS）干预软骨细胞1h;采用12 dyn/cm2的FFSS干预软骨细胞1h,2h,4h,通过ELISA技术比较软骨细胞培养基上清液中IL-18,IL-1β的表达差异。（2）通过AO-EB染色比较细胞破膜死亡在各组的表达情况。（3）通过WB技术比较焦亡关键蛋白IL-1β,IL-18,NLRP3,ASC,Caspase-1,GSDMD在各组的表达差异。结果:第一部分:（1）伴髁突骨质破坏的TMJOA患者与不伴有髁突骨质破坏的TMJID患者好于发中青年女性,均有颞下颌关节疼痛及功能紊乱症状,TMJOA组功能紊乱人数占比较大。（2）颞下颌关节滑液焦亡相关炎性介质IL-1β,IL-18,Caspase-1,NLRP3的表达比较分析,证明了伴髁突骨质破坏的TMJOA患者IL-1β,IL-18,Caspase-1,NLRP3的浓度较高（P<0.05）。第二部分:（1）UAC可诱导TMJOA样表现,体式显微镜可见软骨形变,随UAC作用时间延长,较同时间正常对照组病损加重,Micro-CT显示BV/TV较同时间正常对照组降低,软骨下骨丧失明显,UAC诱导4周出现BS/BV增高（P<0.05）,短期骨改建,UAC诱导8周及12周,差异无统计学意义（P<0.05）,Tb.Th在UAC诱导12周减小,Tb.N在UAC诱导4周,8周减小（P<0.05）。UAC诱导组较同时间正常对照组组织病理学评分增加。（2）免疫组化显示UAC组焦亡关键蛋白IL-1β,IL-18,NLRP3,ASC,Caspase-1,GSDMD高表达于软骨层,RT-PCR及WB亦检测到UAC诱导组较同时间正常对照组表达高水平的焦亡相关基因及蛋白（P<0.05）。第三部分:（1）ELISA结果表明软骨均接受1h FFSS干预时,4 dyn/cm2,12 dyn/cm2,16 dyn/cm2FFSS干预组较0 dyn/cm2FFSS对照组比较,培养基上清炎性因子IL-1β,IL-18的表达水平增高（P<0.05）。在12dyn/cm2FFSS作用下,随FFSS干预时间延长,软骨细胞焦亡关键分子表达增高（P<0.05）。（2）AO-EB染色表明随FFSS载荷的增加以及作用时间的延长,破膜死亡细胞数增多。（3）WB显示软骨细胞焦亡关键蛋白IL-1β,IL-18,NLRP3,ASC,Caspase-1,GSDMD的表达也随FFSS载荷增加以及作用时间的延长而上调（P<0.05）。结论:（1）TMJOA患者滑液中可表达高浓度的焦亡相关炎性介质。（2）单侧前牙反牙合可诱导TMJOA病损,焦亡关键蛋白可表达于髁突软骨层,随OA病损程度加重,焦亡关键分子基因及蛋白的表达量增加。（3）软骨细胞存在细胞焦亡,随FFSS作用软骨细胞强度及时间的增加,软骨细胞焦亡现象加重。
贾琼[5]（2020）在《TNFTNF-α/TGF/TGF-β1信号轴调控半月板损伤后软骨下骨的研究》文中指出目的:半月板损伤导致的骨关节炎是常见外伤性疾病之一,国内外医学界对其防治是比较困难的。本课题通过动物模型研究半月板损伤后骨关节炎中软骨下骨的组织病理和影像学表现,以及与血清中的TNF-α和TGF-β1水平之间的相关性,一是探究半月板损伤后骨关节炎中软骨下骨的组织病理学表现TNF-α/TGF-β1信号轴的内在联系,试图用中医的阴阳平衡理论来解释其发病机制,旨在从中西医结合理论的角度阐释半月板损伤后骨关节炎中软骨下骨的变化机制;二是论述这两种细胞因子组成TNF-α/TGF-β1信号轴在该疾病发展中的作用以及反映该疾病组织结构病理学变化的可靠性,为将来临床诊疗方案的制定提供指导和借鉴工具。方法:临床部分:通过收集OA患者行全膝关节置换术后遗弃的胫骨平台组织,大体观察后,区分硬化与非硬化区,通过Micro-CT检测并比较骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数目（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁间隔（Tb.Sp）,计量资料以均值±标准差（Mean±SD）表示;实验部分:通过建立半月板损伤骨关节炎大鼠模型（MMT）,取8周龄健康SD大鼠90只,正常雄性,无关节病变。随机分为三组,手术组、空白对照组、假手术组各30只。分别于MMT术后第2、4、8和12周进行检测相关指标。研究观察软骨下骨板的形态结构和组织骨密度（TMD）,研究MMT术后不同时间与内侧平台骨小梁体积分数（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）和骨小梁数目（Tb.N）关系。采用共聚焦拉曼光谱分析软骨下骨的胶原矿质比（Proline/PO43-）,采用原位纳米压痕仪评估软骨下骨内在的弹性模量（Er）和硬度（H）。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清中TNF-α和TGF-β 1表达水平。结果:临床部分:内外侧平台比较中,两组BV/TV 比较为（t=8.335,P=0.024<0.05）;两组 Tb.Th 比较为（t=12.707,P=0.001<0.05）,两组 Tb.Sp 比较为（t=21.026,P=0.029<0.05）;两组Tb.N 比较为（t=5.293,P=0.02<0.05）均提示有差异。两组相比,TGF-β 1差异有统计学意义（t=13.28,P=0.032<0.05）;两组相比,TNF-α差异有统计学意义（t=39.10,P=0.017<0.05）;提示观察组与健康组之间外周血TGF-β 1和TNF-α有差异。实验部分:检测软骨下骨的形态结构和组织骨密度（TMD）,内侧平台骨小梁体积分数（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）,骨小梁数目（Tb.N）,软骨下骨的矿质/胶原比（Proline/PO43-）,软骨下骨内在的弹性模量（Er）和硬度（H）等,以及血清中TNF-α和TGF-β 1表达水平。结果显示:①其中与假手术组、空白对照组相比:手术组（MMT组）的第 2 周（F=58.552,P=0.000<0.01）4 周（F=85.669,P=0.000<0.01）、8周（F=14.729,P=0.000<0.01）、12 周（F=95.961,P=0.000<0.01）的骨体积分数（BV/TV）均有显着差异（P<0.01）;②手术组（MMT组）在第2周的组织骨密度（TMD）均有差异（F=15.795,P=0.000<0.01）,4 周（F=23.626,P=0.000<0.01）、8 周（F=41.197,P=0.000<0.01）、12 周（F=263.033,P=0.000<0.01）的组织骨密度（TMD）均有显着的差异（P<0.01）;③手术组（MMT组）的第2周（F=70.122,P=0.000<0.01）、4 周（F=60.799,P=0.000<0.01）、8 周（F=825.365,P=0.000<0.01）、12周（F=1813.386,P=0.000<0.01）的骨小梁间隙（Tb.Sp）均有显着的差异（P<0.01）;④手术组（MMT 组）的第 2 周（F=31.299,P=0.000<0.01）、4周（F=46.216,P=0.000<0.01）、8 周（F=76.991,P=0.000<0.01）、12 周（F=2243.23,P=0.000<0.01）的骨小梁厚度（Tb.Th）均有显着差异（P<0.01）;⑤手术组（MMT组）的第 2 周（F=29.937,P=0.000<0.01）、4 周（F=43.307,P=0.000<0.01）、8 周（F=70.283,P=0.000<0.01）、12 周（F=104.784,P=0.000<0.01）的骨小梁量（Tb.N）均有显着的差异（P<0.01）;⑥手术组（MMT组）的第2周（F=69.158,P=0.000<0.01）、4 周（F=105.204,P=0.000<0.01）、8 周（F=216.123,P=0.000<0.01）、12 周（F=354.133,P=0.000<0.01）的胶原矿化比（Proline/PO43-）均有显着的差异（P<0.01）;⑦手术组（MMT组）的第2周的软骨下骨弹性模量（Er）有差异（F=7.948,P=0.003<0.01）,4 周（F=33.725,P=0.000<0.01）、8 周（F=5.034,P=0.018<0.05）、12 周（F=19.931,P=0.000<0.01）,软骨下骨弹性模量（Er）均有差异（P<0.05）;⑧手术组（MMT组）的第2周（F=15.998,P=0.000<0.01）、4 周（F=42.356,P=0.000<0.01）、8 周（F=48.658,P=0.000<0.01）、12 周（F=45.604,P=0.000<0.01）的骨小梁硬度（H）均有显着的差异（P<0.01）;⑨手术组（MMT组）的第 2 周（F=22.156,P=0.000<0.01）,4 周（F=44.051,P=0.000<0.01）、8周（F=133.707,P=0.000<0.01）、12 周（F=294.919,P=0.000<0.01）的 TNF-α 表达水平均有显着差异（P<0.01）;⑩手术组（MMT组）的第2周（F=3.973,P=0.037<0.05）,4 周（F=16.642,P=0.000<0.01）、8 周（F=60.168,P=0.000<0.01）、12 周（F=101.456,P=0.000<0.01）的 TGF-β 1 表达水平均有差异（P<0.05）。且测得各项参数中手术组间随时间变化有显着差异（P<0.01）,假手术组、空白对照组各组组间无明显差异（P>0.05）。结论:本研究发现胫骨外侧平台主要处于OA早期,而内侧平台多处于OA中、晚期,因此,采用骨组织形态计量学方法对比分析膝关节OA胫骨内、外侧平台骨软骨结构参数的差异,有助于定量分析OA早期和晚期骨软骨结构改变的程度。建立了大鼠膝关节半月板损伤模型（MMT模型）,采用自身对照方法分别观察了TNF-α和TGF-β1在不同时间点软骨下骨组织中的表达,发现了 TNF-α/TGF-β1信号轴在半月板损伤后骨关节炎软骨下骨改变病变中的作用机制为双向调节,正负反馈的机制,与中医阴阳平衡的理论不谋而合。研究分析MMT模型致骨关节炎（OA）,于伤后不同时间点检测软骨下骨微结构、矿化及力学性质的动态变化,定性、定量观测软骨下骨的组织形态学、分子生物、生物力学变化与TNF-α/TGF-β1信号轴变化的动态关系,总结TNF-α/TGF-β1信号轴可能为治疗半月板损伤后导致骨关节炎提供了科学依据和重要指导工具。
刘中兵[6]（2020）在《川陈皮素抑制IL-21/IL-21R介导类风湿关节炎的炎症反应研究》文中认为第一部分:川陈皮素抑制IL-21/IL-21R介导类风湿关节炎的炎症反应体外研究目的:充分探讨川陈皮素靶向IL-21调控类风湿关节炎免疫应答过程,确定其与IL-21/IL-21R及JAK1/STAT3信号通路在调控过程中的介导关系,确定川陈皮素在类风湿关节炎发生、发展过程中的价值性,为后期临床治疗类风湿关节炎提供研究方向。材料与方法:我们使用的是RASFs细胞系,即MH7A细胞,它来自RA患者,被认为是RA的主要效应细胞。MH7A细胞系使用含10%胎牛血清的1640完全培养基于37℃、5%CO2、100%的恒温培养箱中培养,具体分组如下:Control组（不做处理）;IL-21组（50 ng/ml IL-21处理MH7A细胞）;IL-21+Nobiletin 25μM组（50ng/ml IL-21+25μmol/L Nobiletin处理MH7A细胞）;IL-21+Nobiletin 50μM组（50ng/ml IL-21+50μmol/L Nobiletin处理MH7A细胞）;MH7A细胞干预结束后,继续培养48小时后进行相关项目分析:细胞因子分析:ELISA检测各组细胞中IL-6、TNF-α、HMGB1、MMP-3、MMP-13表达浓度分析;各组MH7A细胞ROS（活性氧）检测;各组MH7A细胞4-HNE（4-羟基壬烯醛）检测;RT-PCR检测IL-21R、IL-6、TNF-α、MMP-3、MMP-13表达浓度分析;Western-blot检测IL-21R及JAK1/STAT3信号通路关键蛋白表达分析;统计数据,给出结论。结果:ELISA化学检测:IL-6、TNF-α:各组MH7A细胞中的表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;HMGB1蛋白:各组MH7A细胞中的表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;MMP-3、MMP-13:各组MH7A细胞中的表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;4-HNE检测:各组MH7A细胞中的表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;ROS检测:各组MH7A细胞中的ROS表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;RT-PCR检测:IL-21R:各组MH7A细胞m RNA表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;IL-6、TNF-α:各组MH7A细胞中的表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;MMP-3、MMP-13:各组MH7A细胞中的表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;Westwen-blot检测:IL-21R:各组MH7A细胞蛋白浓度表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;JAK1/STAT3信号通路:各组MH7A细胞中JAK1、STAT3蛋白表达差异性较小,P>0.05,差异不具有统计学意义;在其磷酸的表达过程中,各组MH7A细胞中的表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义。结论:（1）川陈皮素可以靶向IL-21受体对MH7A细胞做出免疫应答过程,明显降低MH7A滑膜细胞内白细胞介素以及基质金属蛋白酶等浓度变化,缓解MH7A滑膜细胞的炎性进展过程,促进其修复过程,且随着川陈皮素浓度增加,这种趋势更加明显。（2）川陈皮素可以靶向IL-21受体对细胞经典信号通路JAK1/STAT3进行调控应答,降低细胞信号通路关键蛋白JAK1及STAT3等蛋白的磷酸化水平,减缓炎症过程,与上文的结论具有一致性。由此可以得知,川陈皮素在类风湿关节炎的发生、发展过程中可能具有潜在的研究价值,为后期临床治疗类风湿关节炎提供靶向研究导向。第二部分:川陈皮素抑制IL-21/IL-21R介导类风湿关节炎的炎症反应体内研究目的:在体外研究的基础上,体内研究进一步探讨了川陈皮素靶向IL-21调控类风湿关节炎的免疫应答过程,从而明确了其与IL-21/IL-21R及JAK1/STAT3信号通路在调控过程中的介导关系,表明了川陈皮素在抗类风湿关节炎症作用方向的价值性,为后期临床治疗类风湿关节炎提供研究方向。材料与方法:选取48只Wistar大鼠适应性饲养1周后将其随机分成4组,除去对照组大鼠,其余建立CIA模型;具体分组如下:Control组（大鼠不做处理）;IL-21组（CIA模型+50 ng/ml IL-21,腹腔注射）;IL-21+Nobiletin 25μM组（CIA模型+50 ng/ml IL-21+25μmol/L Nobiletin,腹腔注射）;IL-21+Nobiletin 50μM组（CIA模型+50 ng/ml IL-21+50μmol/L Nobiletin,腹腔注射）;继续饲养6周后将大鼠处死,进行相关项目分析:各组大鼠模型成功率检测:大体观察、体重指数、关节炎、关节指数分析;形态学分析:各组大鼠HE染色分析;ELISA检测分析:IL-21R、TNF-α、IL-6、HMGB1、MMP-3及MMP-13蛋白;RT-PCR检测分析IL-21R、TNF-α、IL-6、MMP-3及MMP-13m RNA表达分析;Western-blot检测分析IL-21R、TNF-α、IL-6、MMP-3及MMP-13及JAK1/STAT3通路分析,分析数据,给出结论。结果:模型成功率检测:临床表现:对照组大鼠精神状态较好,体重体现出稳步增长的趋势,毛发光泽性较差;模型组大鼠意志沉迷,进食量逐渐减少,毛发光泽性,2周后处于无法负重的状态;体重变化:两周后各组大鼠的体重变化趋势为IL-21<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21+Nobiletin 50μM<Control,各组之间体重比较,差异具有统计学意义（P<0.05）;关节炎发病率/关节指数:各组关节炎发病率比较趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,数据分析差异具有统计学意义（P<0.05）.形态学分析:HE染色:对照组大鼠踝关节组织细胞排列密集,形态规则,轮裹明显;模型组大鼠踝关节组织细胞层变厚,白细胞和淋巴细胞大量充斥,连续性减弱;川陈皮素干预后,大鼠的踝关节组织细胞排列密集性加强,细胞形态趋于正常。ELISA化学检测:IL-6、TNF-α:表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义;HMGB1蛋白:表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义;MMP-3、MMP-13:表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义。RT-PCR检测:IL-21R:表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义;IL-6、TNF-α:表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义;MMP-3、MMP-13:表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义。Westwen-blot检测:IL-21R:表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义;IL-6、TNF-α:各组MH7A细胞中的表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义;MMP-3、MMP-13:表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义;JAK1/STAT3信号通路:各组MH7A细胞中JAK1、STAT3蛋白表达差异性较小,P>0.05,差异不具有统计学意义;在其磷酸的表达过程中,表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义。结论:（1）川陈皮素可以较好的改善模型组大鼠关节炎效应,明显改善大鼠的精神状态,降低大鼠的类风湿关节炎症的程度及关节指数,为后续的研究提供帮助。（2）与体外研究结果一致,川陈皮素改善大鼠类风湿关节炎症的作用主要是通过靶向机体IL-21R浓度变化进而调控JAK1/STAT3的活性状态,充分降低白细胞介素、肿瘤坏死因子-α、高迁移率蛋白表达,逐渐恢复关节软骨基质合成及分解的平衡状态,加速类风湿关节炎疾病的康复过程,达到对类风湿关节炎的治疗效果,给予临床一定启发。
张琪[7]（2020）在《基于外泌体microRNA表达研究针刺治疗膝骨性关节炎的机制》文中研究表明目的:通过对比膝骨性关节炎（Knee Osteoarthritis,KOA）患者针刺治疗前后血清外泌体micro RNA表达的变化,筛选与针刺效应相关的关键micro RNA。比较文献报道的micro RNA与本次研究发现的micro RNA的差异,并根据筛选到的关键micro RNA进行体外实验,研究其对软骨细胞增殖与凋亡的影响,以期探索针刺治疗KOA的潜在调节机制。方法:1.利用文献计量可视化软件Citespace与VOSviewer对KOA micro RNA相关研究进行文献挖掘,筛选目前研究中的热点micro RNA及主要靶点;2.共纳入KOA患者40例和健康受试者17例,将KOA患者随机分为针刺治疗组与等待治疗组。针刺治疗组选择鹤顶、内膝眼、犊鼻、血海、梁丘、阴陵泉、阳陵泉、足三里进行针刺治疗,每周3次,隔天治疗1次,周末休息2天,连续治疗4周,共12次。等待治疗组在针刺干预同时期不进行干预,待4周后再给予患者针刺治疗。所有KOA患者分别于入组0周和入组4周采用西部安大略麦克马斯特大学骨关节炎指数可视化量表（Western Ontario and Mc Master Universities Osteoarthritis index,WOMAC评分）、SF-12生活质量量表对针刺疗效进行评定。3.各组中分别选取15例进行micro RNA研究,其中10例进行高通量测序,5例用于后期RT-PCR验证实验。KOA患者血样分别在入组0周、4周后进行采集;健康受试者血样于入组0周时采集。收集血清后,超速离心法离心,分离血清外泌体,透射电镜下观察所分离的外泌体形态;Western Blot检测外泌体表面标志蛋白CD9、CD63、CD81表达情况;纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis,NTA）技术对外泌体进行粒径分析,以鉴定外泌体。采用small RNA测序技术对分离的外泌体中的micro RNA进行高通量测序。根据P<0.05,差异倍数、表达丰度高的原则,筛选差异表达micro RNA。通过将KOA患者与健康受试者血清外泌体micro RNA的差异表达谱、针刺组治疗前后的血清外泌体micro RNA的差异表达谱、等待治疗组4周前后血清外泌体micro RNA的差异表达谱作韦恩图,筛选出针刺治疗KOA的关键micro RNA。对所筛选出的micro RNA进行RT-PCR检测,以验证测序的准确性。并通过Target Scan和mi RDB对所筛选的针刺治疗KOA的关键micro RNA进行靶基因预测;用GO与KEGG分析进一步明确靶基因相关功能与信号通路。4.基于文献研究、高通量测序及RT-PCR验证的结果,选择软骨细胞作为后续研究的目的细胞,提取并培养乳鼠软骨细胞,通过免疫组化、免疫荧光及甲苯胺蓝染色对其进行细胞鉴定后,分别用所筛选到的micro RNA 338-3p inhibitor、micro RNA 15b-3p mimic对软骨细胞进行转染,用脂多糖刺激软骨细胞模拟细胞炎症,利用CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果:1.KOA micro RNA研究文献挖掘结果:共检索到850篇文章,涉及骨关节炎mi RNA的研究从2007年开始出现,总体呈递增趋势;该领域内研究的热点micro RNA有:mi R-140、mi R-146、mi R-26、mi R-34、mi R-27、mi R-181、mi R-193、mi R-30、mi R-233、mi R-206。这些mi RNA的主要作用靶点在于软骨细胞的增殖与凋亡。2.针刺治疗KOA患者的疗效结果:针刺组四周治疗后,WOMAC总分、WOMAC疼痛评分有所降低,差异有统计学意义（P<0.05）;WOMAC僵硬评分、WOMAC功能评分、SF-12 PCS、SF-12 MCS改变不明显,差异无统计学意义（P>0.05）。等待治疗组四周后,WOMAC总分、WOMAC疼痛评分、WOMAC僵硬评分、WOMAC功能评分、SF-12 PCS、SF-12 MCS评分差异无统计学意义（P>0.05）。3.血清外泌体micro RNA表达的研究结果:KOA患者与健康受试者相比,共有207个差异表达的血清外泌体micro RNA,其中上调104个,下调103个;其中,hsa-mi R-490-3p与WOMAC疼痛评分呈负相关;hsa-mi R-1255b与WOMAC疼痛评分呈正相关。针刺组治疗前后相比,共有65个差异表达的外泌体micro RNA,其中上调32个;下调33个。等待治疗组经四周观察期后与基线比较,共有76个差异表达的micro RNA,其中上调43个;下调33个。4.针刺治疗KOA下调的mi RNA为:hsa-mi R-504-3p、hsa-mi R-1915-3p、hsa-mi R-103a-2-5p、hsa-mi R-887-3p、hsa-mi R-1228-5p、hsa-mi R-34c-3p、hsa-mi R-3168、hsa-mi R-518e-3p、hsa-mi R-1296-5p、hsa-mi R-338-3p、hsa-mi R-199b-5p;针刺治疗KOA上调的mi RNA为:hsa-mi R-514a-3p、hsa-mi R-4440、hsa-let-7f-5p、hsa-mi R-15b-3p。其中mi R-338-3p、mi R-15b-3p为文献中报道的mi RNA。5.RT-PCR验证结果:hsa-338-3p在KOA患者中的表达升高（P=0.332）,经过等待观察期后无明显变化（P=0.647）,针刺治疗后降低（P=0.149）,但差异无统计学意义（P>0.05）。hsa-199b-5p在KOA患者中的表达升高（P=0.305）,经过等待观察期后无明显变化（P=0.536）,针刺治疗后仍表现出升高（P=0.252）,差异均不具有统计学意义（P>0.05）。has-mi R-15b-3p在KOA患者中的表达升高（P=0.003）,差异有统计学意义;分别经过等待观察期及针刺后均略有降低（P=0.083,P=0.661,）,但差异不具有统计学意义（P>0.05）。hsa-mi R-1296-5p在KOA患者中的表达升高（P<0.001）,差异有统计学意义;在分别经过等待观察期及针刺后均有降低（P=0.024,P=0.015）,差异有统计学意义。hsa-mi R-3168在KOA病人与健康受试者中无明显差异（P=0.923）,经过等待观察期及针刺后略有上升（P=0.1736,P=0.881,）,差异均无统计学意义。6.生物信息学结果:对mi R-338-3p、mi R-15b-3p、mi R-199b-5p、mi R-1296-5p靶基因预测显示,mi RDB与Targetscan预测的交集共有262个靶基因。对262个预测靶基因进行KEGG pathyway富集分析共37条通路,主要涉及细胞凋亡、B细胞受体、胆碱能突触、多巴胺能神经突触、癌症等生化代谢途径,以及MAPK、TNF、m TOR、PI3K-Akt、Wnt、B细胞受体、HIF-1、AMPK、Erb B等通路;GO富集分析,主要参与调节RNA代谢过程、DNA模板化、核酸酶复合代谢、核酸模板转录、RNA生物合成过程等。7.mi R-338-3p inhibitor转染后软骨细胞增殖明显增加,差异有统计学意义（P<0.001）;mi R-338-3p inhibitor转染后软骨细胞凋亡率略有降低,差异无统计学意义（P>0.05）。mi R-15b-3p mimic转染后软骨细胞增殖力略微上升,差异无统计学意义（P<0.001）;mi R-15b-3p mimic转染后软骨细胞凋亡率降低,差异有统计学意义（P<0.01）。结论:1.通过对KOA mi RNA的文献研究发现,该领域以软骨细胞为核心,主要涉及细胞增殖、凋亡及软骨形成等机制。2.临床研究显示KOA患者经针刺治疗后可有效缓解KOA患者关节疼痛;3.KOA患者与健康人血清外泌体测序发现,KOA患者与健康人血清外泌体mi RNA表达谱存在差异,其中上调表达的104个,下调表达的103个。针刺治疗可调节KOA患者血清外泌体mi RNA表达,其中mi R-338-3p、mi R-15b-3p、mi R-199b-5p、mi R-3168、mi R-1296-5p可能是针刺治疗KOA作用的关键mi RNA;进一步的生物信息学分析初步发现,针刺可能通过影响MAPK通路及细胞凋亡等途径发挥治疗作用。4.通过体外细胞学实验验证发现,mi R-338-3p可促进软骨细胞增殖,mi R-15b-3p可抑制软骨细胞凋亡,提示这可能是针刺治疗KOA的机制之一。
肖欣悦[8]（2020）在《EZH2表达缺陷在类风湿关节炎发病机制中的作用 VSTM1及其配体在系统性红斑狼疮发病机制中的作用》文中认为第一部分 EZH2表达缺陷在类风湿关节炎发病机制中的作用类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种以慢性、侵蚀性、对称性多关节炎为临床表现的自身免疫性疾病,可造成关节的严重破坏和畸形。病程反复迁延,其发病一年内的致残率高达20%,是造成人类劳动力丧失和致残的主要原因之一。其免疫学及病理学特征主要如下:T淋巴细胞等炎症细胞浸润并分泌的大量炎症细胞因子如TNF-α、IL-6、IL17,IFN-γ等,从而导致慢性、持续性的滑膜炎症,外周血Treg细胞比例却存在着下降的趋势,这提示了T亚群的失衡可能在RA的发病过程中发挥着重要的作用。T细胞的活化和分化过程受多种因素的调教,其中表观遗传调控发挥着重要的作用,包括调节DNA甲基化和组蛋白修饰酶对组蛋白的修饰。无论是DNA甲基化、去甲基化,还是组蛋白各种修饰,均在T细胞的发育、活化、分化中扮演者重要的角色。近期越来越多的研究表明,表观遗传调控参与了 RA的发病机制。虽然表观遗传调控参与了众多模型中的T细胞分化与功能调控,但在RA患者中异常的表观遗传调控是否调节T细胞分化尚不清楚。在本项工作中,我们首先对初治RA患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）、CD4+T细胞、CD19+B细胞和CD14+单核细胞的表观遗传调控基因进行mRNA水平上的初筛,发现zeste同源物2增强子（enhancer of zeste homolog 2,EZH2）等多个表观遗传调控因子在RA患者免疫细胞表达异常。紧接着,我们扩大样本进行验证发现相较于健康对照（healthy control,HC）,初治RA患者的CD4+T细胞中EZH2在mRNA水平与蛋白水平上的表达量均显着降低。为了进一步研究EZH2在类风湿关节炎发病机制中的潜在作用机制。我们使用EZH2抑制剂GSK126特异性的抑制EZH2的功能,并检测naive T细胞向Th1、Th17以及Treg分化的情况,同时也监测了naive T细胞的增殖和凋亡情况。我们发现EZH2抑制剂GSK126可抑制naive T细胞向Treg分化和FOXP3转录。利用siRNA干扰T细胞系中EZH2的表达后,FOXP3的转录也被抑制。为了明确EZH2对FOXP3相关调控通路是否存在影响,我们进一步检测了 EZH2抑制剂GSK126对T细胞中TGFβ-SMAD和RUNX1信号通路的影响。结果发现EZH2抑制剂可上调SMAD7同时下调RUNX1。最后,我们通过共培养体系探讨了 RA滑液以及成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes,FLS）是否调节T细胞EZH2的表达。结果发现RA滑液和FLS抑制可抑制T细胞EZH2的表达,而中和RA滑液中的IL17后,T细胞中的EZH2表达可部分恢复。综上所述,类风湿性关节炎患者CD4+T细胞中的EZH2表达存在缺陷,EZH2被抑制后可通过上调SMAD7和下调RUNX1来抑制FOXP3转录,并最终抑制Treg分化。类风湿关节炎滑液中IL17可能是导致CD4+T细胞EZH2低表达的原因。CD4+T细胞中EZH2表达缺陷可导致RA患者的Treg分化受抑制,进而比例下降。第二部分 VSTM1与生理性配体在系统性红斑狼疮发病机制中的作用系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）是一种多脏器多系统受累的自身免疫病。SLE好发于育龄期女性,以15-45岁年龄段为主。SLE的主要临床特征是血清中出现多种自身抗体,关节皮肤黏膜病变是SLE最常见的病变,但SLE也非常容易出现肾脏和神经系统等重要脏器受累,严重影响患者预后,造成较高致残、致死率。异常的免疫调控和自身免疫耐受缺失是SLE主要的发病机制之一,固有性和适应性免疫反应失调均参与了疾病的发生发展过程。在这个过程中,具有自身免疫原性的核抗原暴露,诱导自身抗体的产生,抗原抗体结合形成的免疫复合物在局部组织沉积,引起多器官受累。随着研究的深入,人们逐渐发现中性粒细胞也在SLE发病中起到重要作用。在系统性红斑狼疮中,自身抗体激活中性粒细胞,中性粒细胞释放含有DNA和抗菌肽复合物的网,又被称为中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps,NETs）。NETs结构中的组蛋白和DNA是SLE自身抗原的主要来源。作为一种免疫刺激物,加剧炎症并激活适应性免疫系统。导致NETs产生的机制并不完全清楚,但是活性氧（reactive oxygen species,ROS）的产生和组蛋白瓜氨酸化是两个必要条件。细胞中负向调控ROS的途径主要有两种:一种是利用酶活性或还原性分子进行还原反应清除ROS,另一种是通过免疫检查点受体通过抑制ROS相关信号通路抑制其产生。含V-set 和跨膜结构域蛋白 1（V-set and transmembrane domain containing 1,VSTM1）是一种新型免疫抑制性受体,在中性粒细胞表面高表达。近期报道发现VSTM1上的一些单核苷酸多态位点与多种自身免疫病相关。在本文工作中,我们首先通过流式细胞术验证了 SLE患者体内中性粒细胞ROS含量水平增高,SLE患者血清可显着促进中性粒细胞ROS和NETs形成增多。在病情活动的SLE患者中性粒细胞上,VSTM1无论是从mRNA的水平,还是蛋白水平的表达量均显着低于健康对照。SLE血清可下调中性粒细胞表面的VSTM1表达量。激活VSTM1可显着下调中性粒细胞ROS与NETs形成。通过质谱筛选,我们发现Galectin1、补体C1q和补体C4是VSTM1潜在生理性配体。通过表面等离子共振、co-IP与免疫荧光共聚焦可进一步证实Galectin1与VSTM1存在着较强的相互作用与共定位。Galectin1、补体C1q和补体C4在功能上也能够抑制中性粒细胞产生ROS,并且随着浓度的不断增加,抑制ROS产生能力越强。当细胞VSTM1表达存在缺陷时,三个候选配体抑制ROS的能力也下降。在调控机制方面,SLE患者血清可以显着促进中性粒细胞表达磷酸化ERK以及磷酸化p38。VSTM1激活抗体作用中性粒细胞后,可以抑制磷酸化p38蛋白的表达。候选配体对于磷酸化p38蛋白的影响与VSTM1激活抗体趋势一致。综上所述,我们的研究发现SLE患者的中性粒细胞的存在着ROS异常高表达,SLE血清参与了该异常现象的调控,并且促进了NETS的形成。SLE患者中性粒细胞在mRNA以及蛋白水平均存在VSTM1缺陷。激活VSTM1可逆转SLE血清导致的中性粒细胞ROS和NETs异常高表达。VSTM1潜在的生理性配体Galectin1、补体C1q和补体C4均可通过VSTM1抑制中性粒细胞ROS表达,该过程可能与抑制中性粒细胞磷酸化p38蛋白表达有关。
殷岳杉[9]（2020）在《电针治疗膝关节骨性关节炎临床疗效观察及对滑膜Toll样受体表达的机制研究》文中指出研究背景随着老龄化社会的到来,膝关节骨性关节炎（KOA）的发病率呈逐渐升高趋势,对KOA患者早期干预,降低关节置换类手术的发生率显得尤为重要。电针治疗KOA具有镇痛作用好、操作简便的优势,但其作用机理尚需从多角度进行探究。本研究从临床研究和实验研究两个方面探讨电针治疗KOA的临床疗效和作用机理。研究目的1.以经筋理论为指导确定穴位,观察电针对KOA患者疼痛、功能活动和生活质量的改善情况,同时测定膝关节周围屈伸肌肌力,综合分析电针对KOA的治疗效果。2.选择电针对兔KOA模型进行干预,观察各取材组织中细胞因子及基质金属蛋白酶含量及Toll样受体及其信号通路上主要元件的mRNA和蛋白表达情况,探讨电针对Toll受体信号通路上的主要元件在不同阶段KOA滑膜及软骨中表达的干预作用。研究方法1.临床研究1.1 治疗方案纳入轻中度KOA患者40例。随机分为电针组和硫酸氨基葡萄糖胶囊组。电针组:选取内膝眼、犊鼻、梁丘、血海、阳陵泉、阴陵泉、阿足穴。诸穴常规针刺,内膝眼、犊鼻穴斜刺,其余各穴直刺。得气后,选取内膝眼和犊鼻组,梁丘和血海一组,连接英迪牌电针仪,采用疏密波,留针25分钟。每周治疗3次,连续治疗4周为1个疗程。对照组:采用口服硫酸氨基葡萄糖胶囊治疗,每次0.628g,每日3次,连续服用4周。1.2 观察指标及评价时点主要疗效指标:膝关节疼痛VAS评分,膝关节骨关节炎指数评分（WOMAC评分）;等速肌力测试指标:峰力矩（PT）、总做功（TW）以及平均功率（AP）;次要疗效指标:生活质量健康调查表评分（SF-36）。评价时点:以上疗效指标分别于治疗前、治疗2周后、治疗4周后三个时间节点进行记录。2.实验研究2.1 实验方案选取兔44只,随机分成6组,其中空白组4只,假手术组、模型1组、模型2组、电针1组、电针2组每组8只。用改良的Hulth法建立兔左膝关节KOA模型,采用电针对KOA模型兔进行干预。取穴:阳陵泉、阴陵泉、内膝眼、犊鼻、梁丘、血海,其中内膝眼、犊鼻斜刺,其余各穴直刺。内膝眼和犊鼻一组,梁丘和血海一组连接电针,每次20分钟,以模型动物患肢微微抖动为度,每周治疗3次,共治疗4周。干预结束后取材,模型1组、电针1组于造模后6周取材,空白组、假手术组、模型2组、电针2 组造模后8周取材。其中空白组双膝取材,其余各组左侧膝关节取材。2.2 检测指标实验一:通过对各组实验兔血清、关节液中IL-1β、IL-6、TNF-α、MMP1、MMP3、MMP13的含量检测,观察KOA兔血清及关节液中细胞因子及基质金属蛋白酶表达情况;通过HE染色在光学显微镜下观察各组KOA兔滑膜及软骨的形态学变化。实验二:采用Real-timePCR和Western blot检测法,检测各组兔滑膜及软骨样品中TLR4、TLR2、NF-κB、MyD88、TRAF6的mRNA和蛋白表达情况,并对各组结果进行对比研究。研究结果1.临床研究1.1 膝关节疼痛VAS评分组内比较:电针组治疗2周后、治疗4周后VAS评分均低于治疗前（P<0.05）。组间比较:电针组在治疗2周后与治疗4周后VAS评分均低于对照组CP<0.05),说明电针有较好的止痛作用。1.2 WOMAC指数评分组内比较:治疗2周后、治疗4周后与同组治疗前相比差异均具有统计学意义（P<0.05）;治疗4周后与治疗2周后比较差异具有统计学意义（P<0.05）。组间比较:治疗前两组相比差异无统计学意义（P>0.05）,在治疗2周后、4周后不同时间节点两组评分相比差异均具有统计学意义（P<0.05）。从疼痛、僵硬、躯体功能等不同维度进行比较,电针组均优于对照组。1.3 SF-36生活质量量表评分躯体健康:组内比较,治疗2周后、治疗4周后与同组治疗前比较（P<0.05）;治疗4周后与治疗2周后相比（P<0.05）。组间比较:两组治疗前评分比较（P>0.05）,具有可比性;治疗2周后、治疗4周后与相同时间节点对照组比较,差异有统计学意义（P<0.05）。心理健康:组内比较,治疗2周后、治疗4周后与治疗前比较（P<0.05）;治疗4周后与治疗2周后相比（P<0.05）,差异有统计学意义。组间比较,治疗前两组评分比较（P>0.05）具有可比性,治疗2周后、治疗4周后两组之间比较电针组均较对照组改善明显（P<0.05）。1.4 等速肌力检测PT值比较:组内比较:电针组治疗2周后、治疗4周后屈伸肌群PT值分别与治疗前比较（P<0.05）;对照组治疗2周后与治疗前比较（P<0.05）,治疗4周后与治疗前比较差异有统计学意义（P<0.05）。组间比较:两组治疗前屈伸肌群PT值比较（P>0.05）;治疗2周后、治疗4周后电针组伸肌群及屈肌群PT值均优于相同时间节点的对照组（P<0.05）。TW值比较:组内比较:电针组治疗2周后、治疗4周后屈伸肌群TW值与治疗前比较（P<0.05）;对照组治疗2周后与治疗前比（P<0.05）,治疗4周后与治疗前比（P<0.05）,差异有统计学意义。组间比较:两组治疗前屈伸肌群TW值比较（P>0.05）,差异无统计学意义;治疗2周后、治疗4周后电针组屈伸肌群TW值均优于相同时间节点的对照组（P<0.05）。AP值比较:组内比较:电针组治疗2周后、治疗4周后屈伸肌群AP值较治疗前均有不同程度的改善（P<0.05）;对照组治疗2周后与治疗前比（P<0.05）,治疗4周后与治疗前比（P<0.05）,差异有统计学意义。组间比较:两组治疗前屈伸肌群AP值比较（P>0.05）,差异无统计学意义;治疗2周后、治疗4周后电针组屈伸肌群AP值均优于相同时间节点的对照组（P<0.05）。2.实验研究实验一:Elisa检测结果:与空白组比较,假手术组KOA兔血清及关节液中IL-1β、TNF-α、及IL-6及MMP1、MMP3及MMP13水平比较（P>0.05）,可以排除手术干扰因素。两模型组血清及关节液中IL-1β、TNF-α及IL-6及MMP1、MMP3及MMP13水平明显高于两电针治疗组及假手术组（P<0.05）。滑膜病理变化:与空白组和假手术组相比两模型组滑膜组织充血,局灶性淋巴、单核和浆细胞炎性浸润明显;模型2组甚至出现滑膜增生、纤维化,毛细血管硬化受累。电针1组及电针2组滑膜增生及淋巴细胞浸润明显少于两模型组。关节软骨病理变化:与空白组及假手术组比较,两模型组软骨表面欠光滑,细胞排列欠规则,潮线完整性欠佳。模型2组甚至出现浅表溃疡,软骨厚度变薄,潮线前移、紊乱的现象;两电针组镜下观察轮廓欠清晰,细胞排列欠规则,潮线略紊乱,分层欠清,但总体表现优于模型组。实验二:Real Time PCR检测结果:滑膜中TLR4、NF-κB、MyD88、TLR2及TRAF6的mRNA表达水平比较:模型1组与模型2组mRNA表达水平显着高于假手术组及空白对照组（P<0.05）;两电针组mRNA表达水平分别低于两模型组（P<0.05）,差异有统计学意义。软骨中TLR4、NF-κB、MyD88、TLR2及TRAF6的mRNA表达水平比较:模型1组与模型2组mRNA表达水平显着高于假手术组及空白对照组（P<0.05）;两电针组mRNA表达水平分别低于两模型组（P<0.05）,差异有统计学意义。Western Blot检测结果显示:滑膜中的TLR4、NF-κB、MyD88、TLR2及TRAF6的蛋白表达比较:模型1组与模型2组的蛋白表达明显高于空白组及假手术组（P<0.05）;两电针治疗组的蛋白表达水平比值均明显低于两模型组（P<0.05）,差异有统计学意义。软骨中的TLR4、NF-κB、MyD88、TLR2及TRAF6的蛋白表达比较:模型1组与模型2组的蛋白表达明显高于空白组及假手术组（P<0.05）;两电针治疗组的蛋白表达水平比值均明显低于两模型组（P<0.05）,差异有统计学意义。研究结论1.以经筋理论为指导选穴,电针治疗早中期膝关节骨性关节炎可有效缓解关节疼痛,改善关节功能,并有助于增强膝关节周围的屈伸肌肌力,提高患者生存质量。2.细胞因子水平及基质金属蛋白酶含量与KOA严重程度呈相关性,电针可以有效抑制血清及关节液中细胞因子及基质金属蛋白酶的水平,有助于控制关节炎症。3.Toll样受体的表达与KOA的严重程度存在相关性。电针可有效抑制TLRs/MyD88/NF-κB信号通路相关元件的mRNA及蛋白表达,提示针灸可能通过抑制这一炎症反应信号通路达到缓解关节炎症的作用。
邢学武[10]（2020）在《miR-496靶向MMP10调控类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞活性的机制研究》文中认为[目的]类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）是一种常见的以滑膜炎症为特征的慢性自身免疫性疾病。然而,RA的病因和潜在的分子事件尚不清楚。在此,我们应用生物信息学分析来识别RA中涉及的关键基因和miRNA。越来越多的证据表明,miRNA可以通过多种生物学过程调控RA的发病机制。miR-496已被发现是多种疾病的重要分子。但其在RA中的作用及机制尚未阐明。[方法]从GEO（Gene expression Omnibus）数据库中下载GSE72564的表达谱,该数据集包含8个样本,其中RA样本4例,OA样本4例,利用GEO2R工具对control组和RA组的差异表达miRNA（DEMs）进行筛选,以p<0.05和|log2（fold change）|≥1为筛选条件。通过TargetScan、miRanda和miRDB数据库,从理论上预测了关键miRNA与其靶基因之间的相互作用。从GEO数据库中下载GSE29746的表达谱,该数据集包含20个样本,其中RA样本9例,OA样本11例,使用R软件limma软件包筛选差异表达基因（DEGs）,其阈值为P<0.05,|log2（fold change）|≥1。利用DAVID数据库对常见DEGs进行功能和通路富集分析,利用STRING数据库构建常见DEGs的蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络,并使用Cytoscape软件进行可视化处理。通过Cytoscape的ClueGO插件构建了 DEGs与信号通路的交互网络,筛选出与RA发展相关的重要通路。利用Cytoscape的MCODE插件对网络中的hub基因和PPI网络的模块分析。最后将预测的靶基因与差异表达基因的取交集得到关键基因。在组织样本中,对关键基因的mRNA表达水平进行了验证,为体外实验提供依据。GEO数据集提供了用于分析miR-496和MMP10在RA中的表达的临床样本。使用IL-1β（10 ng/mL）处理MH7A细胞以建立RA体外模型。采用CCK-8和流式细胞仪检测MH7A细胞的增殖和凋亡。用TargetScan预测miR-496和MMP10的潜在结合部位,并用双荧光素酶报告基因实验进行验证。分别构建miR-496 mimic、miR-496 inhibitor、si-MMP10 以及 pcDNA3.1-MMP10,通过qRT-PCR、western blot实验分析了细胞表型、靶向关系以及NF-κB通路标志蛋白的表达情况。[结果]GSE72564数据集共获得23个DEMs,其中17个上调,6个下调。综合现有文献,选择miR-496进一步研究。通过三个miRNA网站预测miR-496作用的靶基因,三个数据库都预测到的基因共180个。GSE29746数据处理后共获得418个DEGs,包括206个上调基因和212个下调基因。GO功能富集分析结果表明,上调DEGs富集的生物过程（biological process,BP）包括内肽酶活性的负调控、细胞粘附、免疫反应、G蛋白偶联受体信号通路、嗅觉中化学刺激的检测、化学突触传递。下调的DEGs富集的生物过程包括细胞粘附、离子跨膜运输、嗜同性细胞通过质膜粘附分子粘附、轴突的导向、蛋白质同寡聚、基因表达的正调控、大脑发育。在分子功能（molecularfunction,MF）方面,上调的DEGs富集于生长因子活性、钙离子结合、受体结合、嗅觉感受器活动、G蛋白偶联受体活性。而下调DEGs富集于钙离子结合、RNA聚合酶Ⅱ调控区序列特异性DNA结合、细胞外基质结构组成、肌动蛋白单体绑定、蛋白结合参与细胞间的异型黏附、细胞外基质成分赋予弹性。细胞成分（cellular component,CC）分析显示,上调DEGs主要位于细胞外空间、细胞质膜、细胞外基质、细胞连接、细胞表面,下调DEGs主要位于细胞质膜、蛋白质的细胞外基质、细胞质膜顶端、细胞外区域、粘着斑。KEGG通路富集分析结果显示DEGs主要富集于以下过程:移植物抗宿主病、吞噬体、哮喘、炎症性肠病、吗啡成瘾、金黄色葡萄球菌感染、类风湿关节炎、弓形虫病、细胞粘附分子、阿米巴病。为了筛选与RA发展相关的重要通路,我们使用Cytoscape平台的ClueGO插件构建了 DEGs与信号通路的交互网络,结果表明NF-κB通路可能通过TLR4等交互基因参与了 RA的发病机制。使用Cytoscape软件的MCODE插件筛选到13个重要模块,共获得出10个hub基因,包括 MMP10、TRIM3、THEMIS2、DLX2、SPAG5、MIP、ASB2、CXCL2、CUX2、FRZB。将miR-496预测的靶基因与GSE29746数据集的差异表达基因取交集,共得到 7 个关键基因,分别是 ST6GALNAC5、LIMCH1、MMP10、CDH2、PTPRB、PAPPA和PDE3A。结合RA组织中MMP10的高表达,故假设 MMP10为miR-496靶基因。miR-496在RA组织和体外细胞模型IL-1β-treated MH7A中低表达。上调miR-496显着抑制IL-1β-induced MH7A细胞的增殖能力,而miR-496下调却可以增强其细胞的活性。双荧光素酶报告基因实验表明MMP10和miR-496存在相互作用。MMP10可被miR-496负调控。miR-496可以靶向MMP10抑制IL-1β-treated MH7A细胞增殖并诱导其凋亡。p-P65和p-κBα的蛋白水平在转染miR-496 mimic后显着降低,而上调MMP10可以逆转的miR-496 mimic对p-P65和p-κBα的表达抑制。相反,MH7A细胞转染miR-496 inhibitor后p-P65和p-IκBα表达升高,而敲低MMP10可以逆转miR-496 inhibitor对p-P65和p-κBα表达的促进作用。[结论]生物信息学分析筛选的RA关键基因和miRNA有助于我们了解RA的发生机制。更重要的是,miR-496/MMP10轴可能通过NF-κB通路参与了 RA的发病机制,为下一步的体外验证提供了基础。miR-496/MMP10轴的影响通过介导NF-κB通路来影响FLS的增殖和凋亡。这些结果提示miR-496可能RA疾病进展中的一个新的关键基因,这可以进一步阐明RA的发病机制并为RA治疗提供新靶点。
二、A novel tumor-suppressor candidate gene-ndr2 is differentially expressed between osteoarthritis synovium cells and rheumatoid arthritis synoviuni fibroblasts（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、A novel tumor-suppressor candidate gene-ndr2 is differentially expressed between osteoarthritis synovium cells and rheumatoid arthritis synoviuni fibroblasts（论文提纲范文）
（1）雷公藤红素作用RA-FLS的组学联合分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要符号表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 类风湿关节炎研究进展 |
| 1.1.1 类风湿关节炎的基本概述 |
| 1.1.2 类风湿关节炎的病因 |
| 1.1.3 类风湿关节炎发病机制 |
| 1.1.4 类风湿关节炎的治疗 |
| 1.2 CEL的研究进展 |
| 1.2.1 CEL的基本概述 |
| 1.2.2 CEL治疗RA的研究进展 |
| 1.3 转录组学 |
| 1.3.1 转录组学概述 |
| 1.3.2 转录组学在RA治疗中的研究进展 |
| 1.4 蛋白组学 |
| 1.4.1 蛋白组学概述 |
| 1.4.2 蛋白组学在RA治疗中的研究进展 |
| 1.5 本课题的研究内容和意义 |
| 1.6 技术路线 |
| 第2章 转录组学分析 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 主要材料、试剂、仪器 |
| 2.1.2 细胞培养及活性鉴定 |
| 2.1.3 RNA提取与纯化 |
| 2.1.4 文库构建 |
| 2.1.5 文库质控 |
| 2.1.6 上机测序 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 细胞培养及活性鉴定 |
| 2.2.2 RNA浓度和纯度测定 |
| 2.2.3 转录组测序数据质控 |
| 2.2.4 与参考基因组比对分析 |
| 2.2.5 样品间相关性评估 |
| 2.2.6 主成分分析和基因表达聚类分析 |
| 2.2.7 差异表达基因筛选 |
| 2.2.8 差异基因GO功能富集分析 |
| 2.2.9 差异基因Pathway富集分析 |
| 第3章 蛋白组学分析 |
| 3.1 实验分析流程 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 主要试剂、配置的溶液和仪器 |
| 3.2.2 蛋白质提取和肽段酶解 |
| 3.2.3 LC-MS/MS数据采集 |
| 3.2.4 蛋白质鉴定和定量分析 |
| 3.2.5 GO功能注释 |
| 3.2.6 KEGG通路注释 |
| 3.2.7 GO注释和KEGG注释的富集分析 |
| 3.2.8 蛋白质聚类分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 肽段离子质量控制 |
| 3.3.2 蛋白质和肽段特性鉴定 |
| 3.3.3 蛋白鉴定结果 |
| 3.3.4 差异表达蛋白质筛选和聚类分析 |
| 3.3.5 差异蛋白GO功能富集分析 |
| 3.3.6 差异蛋白Pathway富集分析 |
| 3.3.7 与转录组数据的表达关联分析 |
| 第4章 候选基因验证 |
| 4.1 分子对接模拟 |
| 4.1.1 材料和方法 |
| 4.1.2 分子对接结果 |
| 4.2 qRT-PCR检测基因 |
| 4.2.1 试验主要仪器与试剂 |
| 4.2.2 实验步骤 |
| 4.2.3 实验结果 |
| 4.3 Western blot检测候选蛋白 |
| 4.3.1 试验主要仪器 |
| 4.3.2 试验主要试剂 |
| 4.3.3 实验步骤 |
| 4.3.4 实验结果 |
| 第5章 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得与学文论文相关的科研成果目录 |
| 致谢 |
（2）TRPM7介导膝骨关节炎中滑膜巨噬细胞M1型极化的机制研究及膝痹宁方的干预作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 理论研究 |
| 第一节 KOA的现代医学研究进展 |
| 1 流行病学 |
| 2 发病机制 |
| 3 治疗进展 |
| 第二节 膝痹宁方治疗KOA的理论依据 |
| 1 膝骨关节炎病因病机沿革 |
| 2 膝痹宁方方解和现代医学根据 |
| 第三节 巨噬细胞极化调控KOA病理过程 |
| 1 巨噬细胞极化简述 |
| 2 巨噬细胞极化在OA中的作用研究进展 |
| 3 以巨噬细胞极化作为OA靶标的治疗方法研究现状 |
| 第四节 机械应力调控巨噬细胞极化研究进展 |
| 1 机械应力通过巨噬细胞调控组织器官内炎症环境 |
| 2 机械应力调控巨噬细胞极化研究进展 |
| 第五节 力学敏感离子通道瞬时电位受体M7 |
| 第六节 研究假说 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一节 TRPM7介导KOA模型小鼠关节滑膜巨噬细胞M1型极化机制研究 |
| 1 KOA模型小鼠膝关节滑膜巨噬细胞极化表型探究 |
| 2 TRPM7对循环牵张力诱导的小鼠巨噬细胞极化的介导作用 |
| 3 循环牵张力通过TRPM7-ERK1/2及NF-κB通路诱导小鼠巨噬细胞M1型极化 |
| 4 TRPM7抑制剂对KOA模型小鼠滑膜炎症、软骨退变及滑膜巨噬细胞极化的影响 |
| 第二节 膝痹宁方阻抑TRPM7介导的滑膜巨噬细胞M1型极化干预KOA的机制研究 |
| 1 膝痹宁方对KOA模型小鼠滑膜炎症、软骨退变的干预作用 |
| 2 膝痹宁方抑制TRPM7-ERK及NF-κB通路激活阻抑滑膜巨噬细胞M1型极化 |
| 结论 |
| 本研究的创新与不足 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词 |
| 攻读博士学位期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
（3）新橙皮苷在人类风湿滑膜细胞中通过抑制MAPK通路发挥治疗作用（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1.前言 |
| 2.实验材料 |
| 3.实验方法 |
| 4.实验结果 |
| 5.讨论 |
| 6.结论 |
| 7.创新点 |
| 8.参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 类风湿关节炎和骨性关节炎中的软骨破坏机制 |
| 参考文献 |
（4）NLRP3/Caspase-1焦亡经典途径在异常咬合导致颞下颌关节软骨退变中的作用（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 TMJOA患者与TMJID患者颞下颌关节滑液焦亡相关炎性介质的表达研究 |
| 1 研究内容及方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.3 质量控制 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 NLRP3/Caspase-1焦亡经典途径在大鼠TMJOA组织的表达研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象及材料 |
| 1.2 研究内容 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 流体剪切力干预对软骨细胞焦亡的作用研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象及分组 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 靶向NLRP3炎性小体治疗炎症疾病 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 新疆医科大学博士研究生学位论文 导师评阅表 |
（5）TNFTNF-α/TGF/TGF-β1信号轴调控半月板损伤后软骨下骨的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 祖国医学对半月板损伤和骨关节炎的认识 |
| 第一节 祖国医学对半月板损伤的认识 |
| 一、病名 |
| 二、中医病因病机 |
| 三、证候分型 |
| 四、中医治疗 |
| 第二节 祖国医学对膝骨关节炎的认识 |
| 一、病名 |
| 二、中医病因病机 |
| 三、证候分型 |
| 四、中医治疗 |
| 第三节 祖国医学对半月板损伤与膝骨关节炎的理论基础 |
| 一、筋骨并重理论 |
| 二、中医“治未病”理念 |
| 第二章 文献研究 |
| 第一节 半月板损伤的研究概况 |
| 一、半月板的研究历史 |
| 二、半月板损伤的流行病学 |
| 三、半月板的解剖结构与功能 |
| 四、半月板损伤的机制 |
| 五、半月板损伤的类型 |
| 六、半月板损伤的诊断 |
| 七、半月板损伤的治疗 |
| 第二节 半月板损伤骨关节炎的研究概况 |
| 一、半月板损伤骨关节炎的现代医学研究介绍 |
| 二、半月板损伤骨关节炎动物模型的研究介绍 |
| 第三节 半月板损伤骨关节炎软骨下骨改变的研究概况 |
| 一、软骨下骨的介绍 |
| 二、半月板损伤骨关节炎软骨下骨改变的研究介绍 |
| 第四节 TNF-α/TGF-β1 信号轴的研究概况 |
| 一、TNF-α的研究进展 |
| 二、TGF-β1 的研究进展 |
| 三、TNF-α/TGF-β1 信号轴的研究介绍 |
| 第三章 临床部分 |
| 第一节 人半月板损伤后膝骨关节炎的实验研究 |
| 一、Micro-CT检测软骨下骨改变 |
| 第二节 血清中TNF-α/TGF-β1 信号轴的改变 |
| 一、临床资料 |
| 第四章 实验材料与动物分组 |
| 第一节 实验内容 |
| 第二节 实验材料 |
| 第三节 实验方法 |
| 一、分组和模型 |
| 二、方法 |
| 三、TNF-α和 TGF-β1 的检测 |
| 四、统计分析 |
| 第四节 实验结果 |
| 一、各组甲苯胺蓝染色比较 |
| 二、各组胫骨近端横断位的Micro-CT成像图比较 |
| 三、软骨下骨微结构参数变化 |
| 四、各组血清中TNF-α表达水平比较 |
| 五、各组血清中TGF-β1 表达水平比较 |
| 第五章 讨论 |
| 第一节 MMT大鼠模型构建及结果分析 |
| 第二节 半月板损伤骨关节炎中软骨下骨改变的意义 |
| 第三节 TNF-α/TGF-β1 信号轴在软骨下骨改变中的机制研究 |
| 第四节 中医对TNF-α/TGF-β1 信号轴与半月板损伤后骨关节炎软骨下骨改变的理解 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
（6）川陈皮素抑制IL-21/IL-21R介导类风湿关节炎的炎症反应研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 1.类风湿关节炎 |
| 1.1 疾病介绍 |
| 1.2 滑膜成纤维细胞代谢与类风湿关节炎 |
| 1.3 细胞因子与类风湿关节炎 |
| 2.IL-21/IL-21R信号转导途径 |
| 2.1 IL-21/IL-21R产生及来源 |
| 2.2 IL-21/IL-21R对疾病的调节 |
| 2.3 IL-21/IL-21R与类风湿关节炎 |
| 3.JAK/STAT信号通路与类风湿关节炎 |
| 3.1 JAK/STAT信号通路 |
| 3.2 基本过程及调节 |
| 3.3 JAK/STAT与类风湿关节炎 |
| 4.川陈皮素药理性作用 |
| 4.1 名称介绍 |
| 4.2 药代动力学 |
| 4.3 药理作用 |
| 5.本研究的目的和内容 |
| 第一部分 :川陈皮素抑制IL-21/IL-21R介导类风湿关节炎炎症反应体外研究 |
| 材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 实验试剂及设备 |
| 1.3 实验过程 |
| 1.4 实验分析 |
| 1.5 统计学分析 |
| 结果 |
| 2.1 川陈皮素对MH7A细胞活力的影响 |
| 2.2 川陈皮素能够抑制IL-21受体的表达 |
| 2.3 川陈皮素抑制IL-21诱导的氧化应激反应 |
| 2.4 川成皮素抑制促炎细胞因子的表达 |
| 2.5 川陈皮素抑制IL-21 诱导的基质金属蛋白酶(MMPs)表达 |
| 2.6 川陈皮素的作用通过JAK1/STAT3 信号通路介导 |
| 讨论 |
| 研究结论 |
| 第二部分 :川陈皮素抑制IL-21/IL-21R介导类风湿关节炎炎症反应体内研究 |
| 材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 实验试剂及设备 |
| 1.3 实验试剂配置 |
| 1.4 实验过程 |
| 1.5 统计学分析 |
| 结果 |
| 2.1 模型成功率检测 |
| 2.2 形态学分析表明川陈皮素对类风湿关节炎的改善作用 |
| 2.3 ELISA检测IL-21R、TNF-α、IL-6、HMGB1、MMP-3及MMP-13 提示川陈皮素对类风湿关节炎炎症的的抑制效应 |
| 2.4 RT-PCR检测IL-21R、TNF-α、IL-6、MMP-3、MMP-13从m RNA水平进一步表明川陈皮素抑制类风湿关节炎炎症的水平 |
| 2.5 Western-blot检测IL-21R、TNF-α、IL-6、MMP-3、MMP-13、JAK1/STAT3从蛋白水平进一步充分表明川陈皮素的类风湿关节炎炎症抑制作用 |
| 讨论 |
| 研究结论 |
| 参考文献 |
| 综述 白细胞介素21在类风湿关节炎中的作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词 |
| 攻读学位期间公开发表的论文 |
| 致谢 |
（7）基于外泌体microRNA表达研究针刺治疗膝骨性关节炎的机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词表 |
| 引言 |
| 1 研究背景 |
| 1.1 针刺治疗KOA临床疗效确切,但其机制尚不明确 |
| 1.2 从外泌体开展KOA机制研究具有重要意义 |
| 1.3 针刺可能通过外泌体miRNA发挥治疗作用 |
| 2 研究内容 |
| 第一部分 KOA miRNA相关研究现状及热点分析 |
| 1 技术路线图 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 文献检索 |
| 2.2 Citespace与VOSviewer分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 骨关节炎miRNA相关研究的文献发表量 |
| 3.2 骨关节炎miRNA相关研究的国家、研究机构合作网络 |
| 3.3 骨关节炎miRNA相关研究文献共被引情况 |
| 3.4 骨关节炎miRNA研究领域的关键词共现网络 |
| 第二部分 针刺治疗KOA的临床疗效及其主要影响的miRNA |
| 1 技术路线图 |
| 2 实验仪器与材料 |
| 2.1 主要仪器与试剂 |
| 2.2 PCR引物 |
| 3 研究方法 |
| 3.1 临床研究方法 |
| 3.2 外泌体miRNA研究方法 |
| 3.3 生物信息学分析方法 |
| 3.4 统计学处理方法 |
| 4 研究结果 |
| 4.1 基线资料 |
| 4.2 针刺组4周前后组内比较 |
| 4.3 等待治疗组4周前后组内比较 |
| 4.4 血清外泌体鉴定 |
| 4.5 KOA患者与健康受试者差异表达的miRNA |
| 4.6 针刺组四周前后差异表达的miRNA |
| 4.7 等待治疗组四周前后差异表达的miRNA |
| 4.8 KOA患者差异miRNA与WOMAC疼痛评分的相关性分析 |
| 4.9 针刺作用关键miRNA筛选 |
| 4.10 RT-PCR验证 |
| 4.11 靶基因预测 |
| 4.12 GO富集分析 |
| 4.13 KEGG pathway分析 |
| 第三部分 针刺作用的关键miR-338-3P、miR-15B-3P对软骨细胞的影响 |
| 1 技术路线图 |
| 2 实验仪器与试剂 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 软骨细胞原代提取 |
| 3.2 软骨细胞传代、冻存与复苏 |
| 3.3 Ⅱ型胶原免疫组化与免疫荧光 |
| 3.4 软骨细胞甲苯胺蓝染色 |
| 3.5 细胞转染 |
| 3.6 CCK8细胞增殖检测 |
| 3.7 流式细胞仪凋亡检测 |
| 3.8 统计学方法 |
| 4 结果 |
| 4.1 软骨细胞培养 |
| 4.2 细胞的鉴定 |
| 4.3 软骨细胞转染 |
| 4.4 LPS刺激软骨细胞 |
| 4.5 转染后细胞增殖情况 |
| 4.6 转染后细胞凋亡情况 |
| 讨论 |
| 1 对膝骨关节炎的认识 |
| 1.1 中医对膝骨关节炎的认识 |
| 1.2 现代医学对KOA的认识 |
| 2 针刺治疗KOA疗效肯定,能从多方面发挥对KOA的治疗作用 |
| 2.1 针刺治疗KOA的临床研究疗效确切 |
| 2.2 针刺治疗KOA穴位的选择 |
| 2.3 针刺治疗KOA的机理研究 |
| 3 外泌体MIRNA可能是针刺治疗KOA的作用靶点之一 |
| 3.1 外泌体主要特性与研究方式 |
| 3.2 外泌体miRNA为疾病诊断与治疗提供了可能 |
| 3.3 血清外泌体miRNA可用于OA的临床诊断 |
| 3.4 对外泌体miRNA的调节是针刺治疗KOA途径之一 |
| 4 MIRNA在骨关节炎中的作用 |
| 4.1 miRNA参与KOA病理进程 |
| 4.2 骨关节炎miRNA研究热点 |
| 4.3 骨关节炎研究中的热点miRNA分子 |
| 5 针刺作用的关键外泌体MIRNA对KOA影响的可能途径 |
| 5.1 针刺可能通过MAPK信号通路对KOA进行调节 |
| 5.2 miR-338-3p、miR-15b-3p在KOA中可能的作用机制 |
| 5.3 基于针刺效应筛选的外泌体miRNA的应用前景 |
| 5.4 本研究与同类型研究相比的优势与缺陷 |
| 结论 |
| 创新与特色 |
| 问题与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附件 |
| 附件一:文献综述 膝骨关节炎的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附件二:骨关节炎miRNA研究领域中关键词共现网络miRNA词频表 |
| 附件三:在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
（8）EZH2表达缺陷在类风湿关节炎发病机制中的作用 VSTM1及其配体在系统性红斑狼疮发病机制中的作用（论文提纲范文）
| 中文摘要1 |
| Abstract2 |
| 中文摘要1 |
| Abstract2 |
| 第一部分 EZH2表达缺陷在类风湿关节炎发病机制中的作用 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 第二部分 VSTM1及其配体在系统性红斑狼疮发病机制中的作用 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述及参考文献 组蛋白修饰在自身免疫疾病中的进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录A.缩略词表 |
| 附录B.2010年美国风湿病学院(ACR)制定的RA分类标准 |
| 附录C.2009年SLICC修改的ACR新的SLE分类标准 |
| 致谢 |
| 论文发表 |
（9）电针治疗膝关节骨性关节炎临床疗效观察及对滑膜Toll样受体表达的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 针灸治疗膝关节骨性关节炎研究现状 |
| 1 针灸治疗 |
| 2 选穴规律 |
| 3 针灸治疗KOA机理研究 |
| 4 结语 |
| 参考文献 |
| 综述二 KOA发病机制与Toll样受体信号通路的相关性研究 |
| 1 固有免疫应答与OA |
| 2 Toll样受体概述 |
| 3 Toll样受体在OA中的表达 |
| 4 Tol1样受体信号传导通路与OA治疗 |
| 5 结语 |
| 参考文献 |
| 第二部分 临床研究电针治疗膝关节骨性关节炎疗效观察 |
| 前言 |
| 1 临床资料 |
| 2 研究方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 实验研究 |
| 实验一 电针对实验性KOA模型兔细胞因子水平的影响及病理形态学观察 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 数据处理 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 实验二 电针对实验性KOA模型兔滑膜Toll样受体mRNA及蛋白表达的影响 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 数据处理 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 在学期间的主要成果 |
（10）miR-496靶向MMP10调控类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞活性的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、生信分析预测调控RA-FLS活性的关键miRNA及靶基因 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 GEO 数据集 GSE72564、GSE29746 |
| 1.1.2 差异miRNA筛选 |
| 1.1.3 miR-496靶基因预测 |
| 1.1.4 差异基因筛选 |
| 1.1.5 GO和KEGG富集分析 |
| 1.1.6 PPI蛋白互作网络分析 |
| 1.1.7 关键基因筛选 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 获取差异miRNA |
| 1.2.2 预测的miR-496下游靶基因 |
| 1.2.3 获取差异基因 |
| 1.2.4 差异基因GO功能富集分析 |
| 1.2.5 差异基因KEGG通路富集分析 |
| 1.2.6 差异基因PPI分析 |
| 1.2.7 获取关键基因 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 miRNA在RA临床诊断和治疗中的作用 |
| 1.3.2 RA关键miRNA的筛选 |
| 1.3.3 RA关键基因的筛选 |
| 1.4 小结 |
| 二、miR-496靶向MMP10调控RA-FLS活性的机制研究 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 临床样本、实验试剂与仪器 |
| 2.1.2 细胞模型 |
| 2.1.3 细胞转染 |
| 2.1.4 细胞活性检测 |
| 2.1.5 流式细胞术 |
| 2.1.6 双萤光素酶报告基因实验 |
| 2.1.7 qRT-PCR |
| 2.1.8 Western blot |
| 2.1.9 统计学方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 临床标本和细胞模型中miR-496的表达情况 |
| 2.2.2 miR-496调节IL-1β-treated MH7A细胞活性 |
| 2.2.3 MMP10是miR-496的靶基因且两者负相关 |
| 2.2.4 miR-496靶向MMP10调节细胞模型的增殖和凋亡 |
| 2.2.5 miR-496/MMP10通过NF-κB通路参与RA的发病机制 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 miR-496可能是RA治疗的潜在靶标 |
| 2.3.2 MMP10作为miR-496靶基因参与RA |
| 2.3.3 NF-κB通路在RA的发病机制中的作用 |
| 2.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 miRNA在类风湿关节炎中的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、A novel tumor-suppressor candidate gene-ndr2 is differentially expressed between osteoarthritis synovium cells and rheumatoid arthritis synoviuni fibroblasts（论文参考文献）
- [1]雷公藤红素作用RA-FLS的组学联合分析[D]. 代二琴. 信阳师范学院, 2021(09)
- [2]TRPM7介导膝骨关节炎中滑膜巨噬细胞M1型极化的机制研究及膝痹宁方的干预作用[D]. 李晓辰. 南京中医药大学, 2021(01)
- [3]新橙皮苷在人类风湿滑膜细胞中通过抑制MAPK通路发挥治疗作用[D]. 汪萧和. 安徽医科大学, 2021(01)
- [4]NLRP3/Caspase-1焦亡经典途径在异常咬合导致颞下颌关节软骨退变中的作用[D]. 贾梦莹. 新疆医科大学, 2021(08)
- [5]TNFTNF-α/TGF/TGF-β1信号轴调控半月板损伤后软骨下骨的研究[D]. 贾琼. 广州中医药大学, 2020(09)
- [6]川陈皮素抑制IL-21/IL-21R介导类风湿关节炎的炎症反应研究[D]. 刘中兵. 苏州大学, 2020(06)
- [7]基于外泌体microRNA表达研究针刺治疗膝骨性关节炎的机制[D]. 张琪. 成都中医药大学, 2020
- [8]EZH2表达缺陷在类风湿关节炎发病机制中的作用 VSTM1及其配体在系统性红斑狼疮发病机制中的作用[D]. 肖欣悦. 北京协和医学院, 2020(05)
- [9]电针治疗膝关节骨性关节炎临床疗效观察及对滑膜Toll样受体表达的机制研究[D]. 殷岳杉. 北京中医药大学, 2020(04)
- [10]miR-496靶向MMP10调控类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞活性的机制研究[D]. 邢学武. 天津医科大学, 2020(06)