一、裸DNA接种新途径:淋巴结内接种（论文文献综述）
胡英[1]（2014）在《微针介导的基于多重靶向于树突状细胞的抗肿瘤DNA疫苗纳米传递系统研究》文中进行了进一步梳理肿瘤免疫治疗是一种新的肿瘤治疗手段,在预防肿瘤复发、转移、治疗肿瘤病灶等方面有其独特的优势。DNA疫苗是很有发展前景的肿瘤治疗性疫苗,但常规的质粒DNA注射给药免疫效应不够理想,而且存在潜在的安全问题。研制具有强大免疫应答的DNA抗肿瘤疫苗给药系统与新型给药方法是药剂学研究人员面临的一个重大课题。为此,本研究针对现有DNA抗肿瘤疫苗转染率低,免疫性能不强等问题,利用树突状细胞膜表面的受体,设计两种新型的非病毒型纳米载体材料——甘露糖基化高分子PEI （PEI25k-Man）和甘露糖基化低分子PEI共价连接细胞穿膜肽CPP （CPP-PEI1800-Man）.本研究以恶性程度高、目前各种治疗方法极不敏感的恶性黑色素瘤为抗肿瘤治疗模型,构建黑色素瘤特异肿瘤抗原（Trp2）、细胞因子（GM-CSF）、Fc融合蛋白3种基因表达单位元件,以构成一种多元、靶向、高效的复合型DNA疫苗为模型药物。进一步通过理化性能和生物学手段评价载体的细胞转染效率、体外靶向性以及对原代培养的树突状细胞（DC）的刺激、分化、成熟的实验研究,借助微针阵列技术考察这两种纳米载体材料介导DNA疫苗复合物的体内靶向性、小鼠抗黑色素瘤治疗及抗肿瘤预防免疫治疗效果。首先通过PEI结构中的伯氨与MPITC结构中的异氰酸酯一步缩合得到甘露糖基化的高分子聚乙烯亚胺（PEI25k-Man）和甘露糖基化的低分子聚乙烯亚胺（PEI1800-Man）,再通过异型双功能交联剂SPDP分别与PEI18oo的伯氨和CPP的巯基进行反应,将两者结合在一起形合成CPP-PEI25k-Man。用IR和1H-NMR表征了所合成的两种阳离子聚合物载体材料。用MTT法考察了所合成的graft-PEI的细胞毒性,发现在相同作用时间、相同量的PEI及graft-PEI条件下,PEI25k-Man和CPP-PEI1800-Man对细胞的毒性均明显小于PEI25k的细胞毒性。通过PCR,成功扩增获得了黑色素瘤特异肿瘤抗原（Trp2）、GM-CSF和Fc目的基因片段,并将目的基因片段克隆到pUCm-T上,分别得到了Trp2-T质粒、GM-CSF-T质粒和Fc-T质粒。再从Trp2-T质粒、GM-CSF-T质粒和Fc-T质粒上分别进行BglⅡ、SaiⅠ双酶切和SaiⅠ、BamHI双酶切得到Trp2、GM-CSF、Fc基因,连接到pEGFP-N2载体上。由酶切鉴定和基因测序可知已成功构建了pEGFP-Trp2-GM-CSF-Fc多元质粒。对PEI25k-Man、CPP-PEI1800-Man分别进行理化性质考察,包括体外降解能力、缩合DNA能力、与DNA形成纳米复合物后的形态、粒径、电位及抗酶解和抗解离能力等性质。结果表明,graft-PEI/DNA纳米复合物的粒径大多都在80nm-250nm范围内,且各纳米复合物的粒径分布都比较窄（PDI<0.25）,符合用于体内外转染实验的纳米复合物粒径范围；当N/P>10, graft-PEI/DNA纳米复合物的Zeta电位值都大于20mV,但与相同N/P的PEI25k/DNA纳米复合物的Zeta电位值都有所降低；通过TEM和AFM观察,graft-PEI/DNA纳米复合物均成类球形；凝胶电泳阻滞实验证明,一定的N/P值以上,graft-PEI阳离子聚合物均有压缩、包裹DNA的作用,并具有抗DNase I酶和血清的作用。针对graft-PEI/DNA纳米复合物的对不同细胞毒性、细胞摄取、细胞转染,以阐明该两种阳离子聚合物作为基因载体的可行性,通过graft-PEI/DNA纳米复合物在不同细胞的摄取和转染实验以确定其体外对树突状细胞的靶向性；并对原代培养的人脐带血树突状细胞刺激、分化、成熟的实验研究。MTT结果显示,在DC2.4、B16、Hela三种细胞中graft-PEI/DNA纳米复合物的细胞毒性均明显低于PEI25k/DNA纳米复合物,特别是当N/P比大于10以后,各组细胞毒性都存在明显差异,其结果与单纯的聚合物细胞毒性结果相似。在该三种细胞中,相同N/P比例的graft-PEI/DNA复合物对DC2.4细胞毒性最大。通过共聚焦荧光显微镜及流式细胞仪检测,都证明graft-PEI/DNA纳米复合物在DC2.4细胞中的细胞摄取率明显高于PEI25k/DNA纳米复合物,且培养基中甘露糖的存在影响graft-PEI/DNA纳米复合物在DC2.4细胞摄取率,但PEI25k/DNA纳米复合物对此几乎无影响。通过共聚焦荧光显微镜观察到,纳米复合物转染DC2.4细胞48h后,细胞内绿荧光蛋白瞬时表达量是graft-PEI/DNA明显高于PEI25k/DNA纳米复合物。graft-PEI/DNA纳米复合物对DC2.4细胞和Hela细胞的摄取实验以及细胞转染实验的结果都证明graft-PEI/DNA纳米复合物具有体外DC靶向性。graft-PEI/DNA纳米复合物能刺激原代培养DC细胞表达表面共刺激因子。并使促使DC细胞分泌IFN-y和IL-12p70等细胞因子,与PEI25k/DNA组相比存在有显着性差异（P<0.01）。在微针作用下,graft-PEI纳米复合物在离体皮肤中的分布情况及体内靶向性研究。用激光共聚焦显微镜观察得到,微针作用于离体或在体皮肤,graft-PEI/DNA纳米复合物在皮肤活性表皮层的量明显大于PE125k纳米复合物。并且发现不同嫁接率的PEI25k介导QD在活性表皮层的量存在明显差异。在体外透皮扩散实验中,发现微针作用下,在预定时间内,纳米复合物无法透过皮肤层进入接受池中,且发现体外扩散后,graft-PEI/DNA纳米复合物在皮肤活性表皮层的量明显大于PEI25k纳米复合物。微针作用后48h, PEI25k-Man、CPP-PEI1800-Man组表皮层滞留量约为PEI25k增加2倍,在真皮层滞留量增加1.5倍。用流式细胞仪检测,在体小鼠微针给药后,graft-PEI/pEGFP-N2纳米复合物组的脾淋巴细胞中在CD11c阳性细胞中绿荧光蛋白表达量明显高于对照组PEI25k/pEGFP-N2,证明了graft-PEI/pEGFP-N2纳米复合物具有脾淋巴细胞靶向性。用活体荧光成像系统分析了graft-PEI/DNA纳米复合物在体内的淋巴靶向性。已构建的真核表达EGFP-Trp2-GM-CSF-Fc质粒与甘露糖基化修饰的graft-PEI/DNA形成纳米混悬液,作为肿瘤DNA疫苗,在微针的作用下对实验小鼠进行免疫接种,观察在小鼠体内诱导特异性免疫应答能力及抑制肿瘤效应。用ELISA检测免疫3次后小鼠脾淋巴细胞上清液IL-12、IFN-y的水平,发现PEI25k-Man/DNA和CPP-PEI1800-Man/DNA免疫组的淋巴细胞上清液中IFN-y浓度相对与裸DNA、PEI25k/DNA对照组水平明显提高。PEI25k-Man/DNA和CPP-PEI1800-Man/DNA免疫组的脾淋巴细胞上清液中IL-12与裸]DNA、PEI25k/DNA对照组相比,水平明显提高（P<0.01）。微针抗肿瘤预防免疫三次后,预先由PEI25k-Man/DNA和CPP-PEI1800-Man/DNA免疫过的小鼠肿瘤生长明显比PBS组缓慢,而PEI25k-Man/DNA免疫组小鼠肿瘤生长和CPP-PEI1800-Man/DNA免疫组没有明显差异。可见,PEI25k-Man/DNA和CPP-PEI1800-Man/DNA具有预防黑色素瘤生长的作用。这两组小鼠到100d后约90%还是成活的,而PBS组小鼠不到待接种肿瘤后50d内已全部死亡,PEI25k/DNA组到70d都死亡。微针抗肿瘤免疫治疗3次后,第7d,各组小鼠肿瘤体积无统计学差异,第14d及21d, PBS组肿瘤体积明显大于PEI25k-Man/DNA和CPP-PEI1800-Man/DNA组,PEI25k-Man/DNA和CPP-PEI1800-Man/DNA组小鼠肿瘤体积无统计学差异,第28d开始,PEI25k-Man/DNA和CPP-PEI1800-Man/DNA组小鼠肿瘤体积明显小于PBS组,且与PEI25k/DNA组小鼠肿瘤大小也具有统计学差异,说明PEI25k-Man和CPP-PEI1800-Man两种载体介导的EGFP-Trp2-GM-CSF-Fc质粒形成的纳米疫苗能够显着抑制黑色素瘤生长。且PEI25k-Man/DNA和CPP-PEI1800-Man/DNA两组小鼠到100d后约70%以上还成活的,而PBS组不到45d已全部死亡,PEI25k/DNA组到60d都死亡。肿瘤组织常规石蜡切片HE染色,显微镜下观察CPP-PEI1800-Man/DNA组和PEI25k-Man/DNA治疗组肿瘤坏死较明显,在瘤体周围和瘤体内有大量炎性细胞浸润,PEI25k/DNA组也可见部分肿瘤坏死和炎性细胞浸润,但明显要少于CPP-PEI1800-Man/DNA组和PEI25k-Man/DNA治疗组。PBS组在显微镜下几乎无肿瘤坏死和炎性细胞浸润。用免疫组化法检测CPP-PEI1800-Man/DNA和PEI25k-Man/DNA两组均有CD8+T淋巴细胞浸润,其中CPP-PEI1800-Man/DNA组最多,其次为PEI25k-Man/DNA组,PEI25k/DNA组出现少量呈棕褐色的细胞核,PBS组几乎未见CD8+T淋巴细胞浸润。综上所有研究结果,表明我们已经成功合成PEI25k-Man和CPP-PEI1800-Man两种阳离子聚合物载体材料,它们具有相对较低的细胞毒性。成功构建了包含有黑色素瘤特异肿瘤抗原（Trp2）、细胞因子（GM-CSF）、Fc融合蛋白3种基因表达单位元件pEGFP-Trp2-GM-CSF-Fc质粒。graft-PEI/DNA纳米复合物对树突状细胞的体外细胞靶向性；能刺激原代培养的人脐带血树突状细胞、分化、成熟,并分泌相关细胞因子。体内免疫预防及抗肿瘤治疗实验证明在微针介导下,graft-PEI/pEGFP-Trp2-GM-CSF-Fc纳米复合物对黑色素瘤的预防和抗肿瘤治疗具有很好的应用潜力。本文成功地设计了新型的多重靶向于树突状细胞的DNA疫苗纳米粒给药系统,探索了DNA疫苗接种新途径,为新型经皮疫苗给药系统的设计和安全使用提供依据。
朴秉国[2]（2011）在《表达NDV HN基因重组腺病毒对BEL-7402细胞及转移模型的抑制作用》文中研究指明本研究对具有肿瘤特异性复制和肿瘤靶向性杀伤功能的重组腺病毒Ad-HP和Ad-HT的肝癌（BEL-7402）抑制作用进行了探讨。本研究首先利用MTT染色等方法,探讨了Ad-HT和Ad-HP对体外培养的人肝癌细胞BEL-7402的抑制作用。结果表明,Ad-HT和Ad-HP均可有效抑制BEL-7402细胞的增殖,且其作用在一定条件下呈现剂量和时间依赖关系。本研究利用台盼蓝染色、AO/EB染色、Annexin V染色和DAPI染色对Ad-HT和Ad-HP抑制BEL-7402细胞的方法进行了探讨。结果表明,Ad-HT和Ad-HP均可造成BEL-7402细胞的细胞膜通透性增加、细胞核凝聚、磷脂膜外翻。虽然不同检测方法所得到结果不尽相同,但仍可推断,Ad-HT和Ad-HP能够通过诱导细胞凋亡抑制BEL-7402肿瘤细胞的增殖。本研究利用流式细胞术、Western blot等方法探讨表达NDV HN基因重组腺病毒对细胞凋亡信号转导系统内线粒体膜电位、活性氧水平和Caspase酶活性等关键控制点信号分子的影响。实验结果表明,Ad-HP和Ad-HT均可不同程度的上调BEL-7402细胞Caspase酶活性和活性氧水平,并不同程度的降低BEL-7402细胞线粒体膜电位。可以推断,表达NDV HN基因重组腺病毒通过线粒体途径诱导BEL-7402细胞发生凋亡,从而体现其对BEL-7402细胞的抑制作用。本研究利用小鼠肝癌的肺转移和实体肿瘤模型探索了Ad-HP和Ad-HT在体内的抑瘤作用。结果表明,Ad-HP和Ad-HT具有减缓肿瘤组织生长速度、延长模型动物平均生存期和刺激免疫的作用。
常丽云[3]（2011）在《堆型艾美耳球虫3-1E重组质粒PLGA微球包被技术研究》文中研究表明堆型艾美耳球虫是集约化养鸡场中最常见的球虫种类之一。堆型艾美耳球虫寄生于小肠、属于中等毒力的球虫,给养禽业带来严重的经济损失。鸡球虫病主要依靠药物防治和活疫苗免疫,由于药物的耐药性和药物残留等问题,活疫苗免疫又存在成本高、免疫要求高等缺陷,防治球虫病急需寻求新途径。DNA疫苗的一个显着优势是刺激机体产生广泛的细胞免疫反应和持久的免疫记忆,但裸质粒DNA疫苗注射给药方式不够方便、组织刺激性大、生产成本高;裸质粒DNA疫苗口服免疫在实际应用时由于受到胃酸、胃蛋白酶等对抗原的裂解作用的影响,导致了质粒疫苗的失活,产生的免疫效果较低,常须加大免疫剂量才可获得足够的免疫力。本试验以疏水性材料乳酸/羟基乙酸共聚物（PLGA）为研究对象,将鸡堆型艾美耳球虫（E.acervulina）重组表达质粒pcDNA3.1-3-1E包裹,制成微球并用该微球进行动物试验,表明重组表达质粒pcDNA3.1-3-1E能成功的被PLGA包裹并发挥免疫功效。本试验用PLGA将重组表达质粒pcDNA3.1-3-1E,运用水包油包水（W/O/W）乳化技术制备pcDNA3-3-1E PLGA微球,分别测定微球的形态、粒径、质粒DNA包封率、载药量和释放程度,体外分别进行模拟鸡胃液和肠液试验并且比较肌注裸质粒鸡群和口服免疫鸡群的免疫效果。结果显示微球的包封率,载药百分比分别是82.7%,1.89%,它的粒径80%小于12μm。在模拟鸡的胃肠液累积释放试验中,它的累积释放能力依次为pH 3.0>pH 7.4,在模拟的鸡的肠液中,微球30d累积释放81.3%,表明了微球具有一定的缓释效果。裸质粒与微球中质粒超螺旋比例差距不明显,这表明在包被过程中的超螺旋质粒未发生降解。将PLGA微球口服免疫,重组质粒pcDNA3-3-1E肌注免疫,后1d,10d,30d样品,免疫后1d,10d口服微球免疫组和肌注组各组织均可检测到3-1E基因,免疫后30d,口服微球免疫组各组织均仍检测到3-1E基因,而肌注组仅在注射部位检测到3-1E基因,表明口服的pcDNA3-3-1E PLGA微球能在机体内释放表达且持续释放至少30d。pcDNA3-3-1E PLGA微球免疫后不同时间鸡体外周血淋巴细胞转化水平和不同时间鸡外周血中IgG含量显着增高,表明口服pcDNA3-3-1E PLGA微球免疫能有效的提高雏鸡的细胞免疫和体液免疫水平。通过增重、病变、卵囊产量、抗球虫指数（ACI ）等多项参数来对重组质粒pcDNA3-3-1E PLGA微球免疫效果进行评价。结果显示重组质粒pcDNA3-3-1E PLGA微球口服组攻虫后鸡的卵囊产量下降88.72%,肠道病变记分降低63.96%,并使鸡的相对增重率达96.89%,ACI值为165.19。PLGA能成功地包裹质粒pcDNA3-3-1E,能有效地保护pcDNA3-3-1E在胃肠环境中不受破坏,增强免疫应答。
胡慧珍[4]（2009）在《DNA疫苗的免疫调节和接种方案的研究进展》文中研究指明1993年Ulmer等报道将含有流感病毒基因的质粒直接肌注于小鼠体内可诱导全面的免疫应答,并可抵抗流感病毒攻击。至此,被誉为"疫苗的第三次革命"的DNA疫苗技术应运而生。DNA疫苗与
温建新[5]（2008）在《含有CpG基序的PRRSV ORF5基因的真核重组表达载体的构建及其免疫反应的研究》文中进行了进一步梳理猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为特征的病毒性传染病。细菌DNA具有广谱的免疫刺激作用,实验证明人工合成的CpG-ODN可以模拟细菌DNA诱发机体产生强烈的Th1型免疫应答。CpG-ODN作为一种新型的免疫佐剂已成为分子免疫学研究的热点之一。在本研究中,首先筛选出对猪具有最强免疫刺激活性的CpG-ODN,将PRRSV ORF5基因克隆至哺乳动物真核表达载体pVAX1,构建了pVAX1-ORF5真核重组质粒;将优选的CpG-ODN插入到pVAX1-ORF5中,构建成含有CpG基序的真核重组载体质粒CpG-pVAX1-ORF5。为了进一步检测其免疫原性,进行SPF小鼠动物试验,检测其免疫反应指标。用CpG-pVAX1-ORF5免疫仔猪,检测对本体动物的免疫保护效果。1、不同序列的CpG-ODN对猪体外周血淋巴细胞和脾脏免疫细胞免疫刺激作用的研究:为了筛选出对猪体有免疫刺激活性的CpG寡聚脱氧核苷酸（CpG-ODN）,人工设计合成了9种未甲基化CpG-ODN不同序列,分别作用于健康猪外周血淋巴细胞和脾脏免疫细胞,进行体外转化试验。用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测外周血淋巴细胞转化效果和脾细胞的增殖能力和代谢能力,通过测得的OD490值,计算出淋巴细胞增殖指数（SI）,筛选CpG-ODN的免疫刺激作用。结果显示:九种不同序列的CpG-ODN对猪外周血淋巴细胞和脾脏免疫细胞均具有不同程度的刺激作用,其中CpG-ODN7对淋巴细胞增殖能力的增强效果最为明显（SI=3.5）,CpG-ODN6对猪脾脏免疫细胞的刺激指数最大（SI=2.7）。为研制猪DNA疫苗有效的CpG-ODN免疫佐剂奠定了基础。2、含CpG序列PRRSV SD1 ORF5基因真核表达载体的构建与表达:本研究利用已构建的PIRORF5S-ORF5重组质粒,重新设计酶切位点,将ORF5基因插入哺乳动物表达载体pVAX1中,构建出pVAX1-ORF5质粒。再将CpG-ODN6和CpG-ODN7有机组合,人工设计合成CpG-ODN序列,通过在其两端的粘性酶切末端定向插入到经相同酶切处理的真核表达质粒pVAX1-ORF5,成功构建含特定CpG序列的真核重组表达质粒CpG-pVAX1-ORF5。将重组质粒转染COS7细胞,经间接免疫荧光试验（IFA）证实CpG-pVAX1-ORF5可表达PRRSV GP5蛋白。构建成功的表达PRRSV GP5的DNA重组质粒,为研究其所诱导的免疫反应的效果和强度以及对猪体产生的保护性反应奠定基础。3、真核重组表达载体质粒CpG-pVAX1-ORF5免疫原性的研究:通过小鼠试验对CpG-pVAX1-ORF5真核重组表达载体质粒进行了免疫原性检测。免疫体重约22-26克SPF小鼠,检测体液免疫与细胞免疫水平。通过ELISA法检测鼠血清中抗猪繁殖障碍与呼吸道综合征病毒抗体水平,并用流式细胞仪检测外周血淋巴细胞的CD4+、CD8 +数值,用MTT法检测淋巴细胞增殖指数（SI）,试验结果表明:CpG-ODN能显着提高鼠的特异性抗体滴度以及淋巴细胞增殖反应。4、真核重组表达载体质粒CpG-pVAX1-ORF5对猪体免疫作用研究:通过猪体试验对含CpG-pVAX1-ORF5 DNA疫苗进行了免疫效力评价和病毒保护性试验。在猪体进行了免疫试验。检测猪PRRSV的特异性抗体滴度、IL-2水平以及淋巴细胞增殖反应（MTT法）水平,并做了攻毒保护试验。试验结果表明本试验构建的含CpG基序真核重组表达质粒CpG-pVAX1- ORF5能诱导产生针对PRRSV的体液免疫与细胞免疫（显着的淋巴细胞增值反应水平）。攻毒结果表明CpG-pVAX1-ORF5组能够有效地抵抗经鼻攻毒,可以保护猪轻微病毒血症,比对照组减少80%,也不表现临床症状,对肺的损害能提供部分保护。CpG的加入可使免疫猪的病变减轻或消失。从而表明含有CpG-ODN能作为PRRSV DNA疫苗的有效佐剂。
朱继红[6]（2008）在《NDV HN基因和CAV Apoptin基因对宫颈癌细胞的体外杀伤作用及其体内抑瘤效应研究》文中进行了进一步梳理本研究以新城疫病毒（NDV）血凝素-神经氨酸酶（HN）基因和鸡贫血病毒（CAV）凋亡素（Apoptin）基因为效应基因,以真核表达质粒pSFV为载体,分别构建了含HN和Apoptin基因的重组真核表达质粒pSFVHN、pSFVApoptin。利用以鸡痘病毒为载体的重组鸡痘病毒vFVHN、vFVApoptin及上述重组真核表达质粒对其进行了体内外抑瘤实验研究和抑瘤机制的初步探索,为上述两种基因在肿瘤生物治疗中的应用奠定实验和理论基础。本研究以真核表达质粒pSFV为载体,分别构建了能够有效表达NDVHN和CAV Apoptin的重组真核表达质粒pSFVHN和pSFVApoptin。通过电穿孔法将pSFVHN和pSFVApoptin转染入人宫颈癌Hela细胞通过RT-PCR、western-blot法及间接免疫荧光检测了重组体中外源基因在Hela细胞内表达,结果表明外源基因Apoptin和HN在Hela细胞中获得了有效转录和正确表达;采用MTT法分别检测了pSFVHN和pSFVApoptin对Hela肿瘤细胞的体外杀伤作用,结果表明,上述重组体对Hela细胞具有明显的杀伤作用;通过吖锭橙/溴化乙锭染色、DAPI染色、流式细胞仪结合DCFA染色、罗丹明123染色分别探讨了两种重组体对Hela肿瘤细胞的抑制机制,结果表明,pSFVHN和pSFVApoptin可诱导Hela肿瘤细胞凋亡,并可上调细胞内活性氧水平,降低线粒体膜电位,由此推测其所诱导的细胞凋亡可能是通过线粒体途径发生的;通过流式细胞仪结合MHC-Ⅰ分子表达检测等方法检测了两种重组体对细胞免疫功能的影响,结果表明,pSFVHN和pSFVApoptin可不同程度的上调肿瘤细胞表面MHC-Ⅰ分子的表达,提高肿瘤细胞的免疫原性。本研究利用重组鸡痘病毒vFVHN和vFVApoptin感染体外培养的人宫颈癌Hela细胞,运用Western blot、RT-PCR和间接免疫荧光等方法检测外源基因的表达,实验结果显示,重组鸡痘病毒所携带的外源基因可在Hela细胞中有效转录和正确表达。采用MTT法、吖锭橙/溴化乙锭染色、DAPI染色、流式细胞仪检测细胞内活性氧水平、线粒体膜电位及MHC-Ⅰ分子的表达等方法观察重组鸡痘病毒vFVHN和vFVApoptin对Hela肿瘤细胞的体外杀伤作用及其对肿瘤细胞免疫原性的影响,实验结果显示,上述重组病毒可有效抑制Hela细胞的生长,并可推测其可通过线粒体途径诱导人宫颈癌Hela细胞发生凋亡。另外,其次本研究还复制了C57BL/6小鼠荷H22肿瘤模型,利用瘤内注射的方法,通过抑瘤率检测和生存期检测等方法探讨了重组真核表达质粒pSFVHN、pSFVApoptin和重组鸡痘病毒vFVHN和vFVApoptin的体内抑瘤作用。结果显示,上述重组体可有效抑制荷瘤动物模型肿瘤组织的生长,并在一定程度上延长动物模型生存期。本研究还通过小鼠脾CD4+、CD8+T细胞亚群的数量、脾细胞特异性CTL杀伤活性等检测,探讨了上述重组体对荷瘤动物模型免疫功能的影响,结果显示,上述重组体可在不同程度内提高荷瘤动物模型CD4+、CD8+T细胞亚群的数量,并诱导产生抗肿瘤特异性CTL杀伤活性。本研究通过对重组真核表达质粒pSFVHN、pSFVApoptin和重组鸡痘病毒vFVHN和vFVApoptin的体内外抑瘤作用研究,说明了其对体外培养的人宫颈癌Hela细胞和C57BL/6小鼠荷H22肿瘤模型的抑制作用。提示,NDV HN和CAV Apoptin可作为效应基因应用于肿瘤生物治疗领域,但对其确切机制尚需进一步研究。
张辉[7]（2008）在《重组沙门菌表达结核分枝杆菌保护性抗原ESAT-6、CFP-10及其黏膜免疫机理研究》文中提出结核病（Tuberculosis, TB）由来已久,自有人类历史记录开始,就有了TB的记录。迄今为止,约2亿人被TB夺去生命,而这个数字仍在上升,世界卫生组织宣布TB是人类目前面临的最大威胁之一。1882年,Robert Koch证实了结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）是TB的病原。全世界已有1/3人口约20亿人感染了MTB,现有结核病人2千万,每年新发病人数约880万,每年死亡人数高达160万。目前广泛用于预防TB的唯一疫苗是卡介苗（Bacille Calmette Guérin, BCG）,但其免疫保护效果对于肺结核及弥散性结核分别约为50%和80%,存在显着差异。TB野毒株的高度耐药以及与人免疫缺陷病毒（ Human immunodeficiency virus,HIV）共感染的不断上升,使TB警戒再次升高,并强调要利用免疫手段来控制TB的感染和传播。TB特异性免疫应答在清除MTB感染中发挥重要作用。BCG对青少年TB的预防具有重要的作用,但对于成人肺结核的保护作用有限,因此在设计新型抗结核疫苗时要考虑到如何预防肺结核。基因组学比较分析显示BCG中要比MTB缺失约100多个编码序列,其中的一些序列编码重要的抗原,当这些抗原被重新重组入BCG中都能够增强抗结核的能力。BCG中缺失RD1（Regions of difference 1）,而RD1中的编码基因esxB和esxA基因分别编码培养滤液蛋白10（Culture filter protein 10, CFP-10）和早期分泌抗原靶6（Earlier secreted antigen target 6, ESAT-6）,它们仅存在于临床分离的致病性MTB及牛分枝杆菌野毒株（M. bovis）,能够诱导有效的Th1应答,并在动物实验中显示其对TB的保护效力,因而成为TB免疫诊断以及疫苗研究中最有力的候选抗原。为此,本研究以沙门菌及其鞭毛蛋白为载体,原核表达并运送ESAT-6、CFP-10蛋白,经滴鼻免疫,探讨了MTB保护性抗原ESAT-6和CFP-10蛋白诱导的黏膜免疫机理。1.结核分枝杆菌ESAT-6、CFP-10蛋白的克隆、表达及免疫原性分析为分析结核分枝杆菌分泌性抗原ESAT-6和CFP-10蛋白的免疫原性,利用PCR扩增了ESAT-6、CFP-10编码基因,经克隆筛选和测序鉴定后,构建了原核表达质粒pBCX-esat及pET-cfp。将两质粒分别转化宿主菌BL21（DE3）,进行诱导表达。SDS-PAGE分析结果表明,重组的ESAT-6和CFP-10蛋白均获表达,融合蛋白的大小分别约为39kD和19kD。将CFP-10与本室研制的针对CFP-10蛋白的单克隆抗体6E8进行Western-blotting分析。结果显示,CFP-10融合蛋白能与特异性单克隆抗体6E8反应。同时,在ELISA实验中,重组ESAT-6蛋白与医院结核病人血清呈阳性反应。将ESAT-6及CFP-10融合蛋白分别以腹腔注射免疫C57BL/6小鼠,并于第二次免疫后7d,取小鼠脾脏细胞,用胞内细胞因子染色法检测ESAT-6及CFP-10蛋白特异性CD4+ T细胞分泌的IFN-γ及IL-4。结果两组蛋白均能诱导较高水平的IFN-γ,而IL-4水平低于IFN-γ水平。此外,经检测脾脏中CD3+ T细胞的CD69分子表达发现,ESAT-6和CFP-10蛋白免疫组的CD69水平显着上调。从而说明重组ESAT-6和CFP-10蛋白具有良好的免疫原性;免疫小鼠后,能够激活CD3+ T细胞,并诱导以细胞免疫为主的Th1应答,即重组蛋白ESAT-6及CFP-10具有Th1免疫原性。2.重组沙门菌表达的ESAT-6、CFP-10及其特异性免疫应答分析为了分析重组沙门菌诱导ESAT-6及CFP-10蛋白特异性免疫应答,将ESAT-6及CFP-10蛋白编码基因分别插入原核载体pYA3333中,将构建正确的质粒分别命名为pYA33-esat和pYA33-cfp。通过电穿孔法转化减毒鼠伤寒沙门菌X4550,获得重组菌X4550（33-esat）和X4550（33-cfp）。以每只1×108 cfu剂量的重组菌滴鼻免疫C57BL/6小鼠,间隔18d,在进行第2次免疫后10d取免疫小鼠脾脏、肺脏、肠系膜淋巴结（Mesenteric lymph node, MLN）及派伊尔氏结（Peyer’s patches, PP）细胞,以ESAT-6和CFP-10蛋白作为刺激原,检测抗原特异性的IFN-γ分泌细胞和IL-4分泌细胞。结果表明,经沙门菌表达运送的结核分枝杆菌抗原ESAT-6和CFP-10均能诱导特异性的免疫应答。在肺脏及PP细胞中,检测到较高水平的IFN-γ分泌细胞,与IL-4分泌细胞比较,差异显着。在脾脏和MLN中,免疫应答呈现平衡状态,IFN-γ分泌细胞和IL-4分泌细胞数量相当。此外,对脾脏、MLN、PP及支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid, BAF）细胞中的共刺激分子检测结果表明,两组重组菌均能上调共刺激分子的表达。利用ELISA分别在免疫鼠的血清和BAF /肠黏膜中检测到ESAT-6及CFP-10蛋白特异性的IgG和IgA抗体。从而表明,以滴鼻方式接种重组减毒沙门菌,能够诱导ESAT-6及CFP-10蛋白特异性的细胞免疫应答,在黏膜邻近器官组织中,免疫应答趋于细胞免疫,而在黏膜远端免疫器官和组织中,免疫应答则处于平衡状态。以滴鼻免疫重组菌,不仅能诱导有效的体液免疫还可以激发局部的黏膜免疫,这为呼吸道疾病的防控提供了新的依据。3.沙门菌鞭毛蛋白嵌合表达的ESAT-6及其免疫学特性分析为研究以沙门菌鞭毛系统作为运送载体诱导的ESAT-6特异性免疫应答,利用overlap PCR将ESAT-6蛋白编码基因插入沙门菌鞭毛蛋白基因fliC的高变区域,构建成嵌合鞭毛片段fliC/esat。将fliC/esat片段插入原核表达载体pET,构建的质粒命名为pET-fliC/esat。将质粒pET-fliC/esat通过电穿孔法转化沙门菌LB5000,重组菌命名为LB5000（fliC/esat）。用P22噬菌体介导LB5000（fliC/esat）向都柏林沙门菌SL5928的转导,利用PCR、动力学检测及凝集试验鉴定并获得阳性转导菌SL5928（fliC/esat）。将转导菌SL5928（fliC/esat）感染结肠癌细胞HT-29,证实转导菌具有良好的感染能力;黏附力试验证实,转导菌具有良好的黏附特性。利用RT-PCR技术检测转导菌SL5928（fliC/esat）感染BMDC、F4/80+ MФ和肠上皮细胞（Enterocyte, EC）后的TLR-5 mRNA表达,结果在3h时,三种细胞就能表达TLR-5 mRNA;至6h,TLR-5 mRNA表达量有所升高。在体内实验中,将转导菌以每只1×107cfu滴鼻免疫C57BL/6小鼠,并于第二次免疫后10d,检测脾脏、肺脏、MLN、PP及鼻咽相关淋巴结（Nasopharynx associated lymph node,NALT）细胞中的IFN-γ和IL-4分泌细胞数。结果在肺脏、PP及NALT细胞中,IFN-γ分泌细胞与IL-4分泌细胞水平相比较显着升高,免疫应答趋向于Th1型;而在脾脏及MLN中,IFN-γ与IL-4分泌细胞数无显着性差异,免疫应答呈现Th1/Th2混合应答,处于平衡状态。而在体内的CTL实验中发现,与重组菌X4550（33-esat）相比较,转导菌SL5928（fliC/esat）诱导的CTL具有较强的特异性杀伤力。在血清及BAF的抗体检测中显示,转导菌能够诱导一定水平的血清IgG和黏膜IgA抗体。综上所述,鞭毛中嵌合MTB抗原ESAT-6后,不影响鞭毛自身特性,经沙门菌鞭毛系统运送,能够诱导ESAT-6抗原特异的细胞及黏膜免疫应答,这为TB疫苗研究开辟了新的研究方向。4.嵌合鞭毛蛋白fliC/esat与BCG黏膜共免疫诱导的免疫应答分析为研究嵌合鞭毛蛋白在TB免疫的中作用,将原核表达质粒pET-fliC/esat及pET-fliC转化大肠杆菌BL21（DE3）,诱导表达嵌合蛋白fliC/esat及鞭毛蛋白fliC。SDS-PAGE分析结果表明,嵌合蛋白及fliC蛋白均以可溶性表达,大小分别约为64kD和57kD。将嵌合蛋白和fliC蛋白分别进行Western-blotting分析,以鼠伤寒沙门菌全菌血清作为一抗,结果显示嵌合蛋白及fliC蛋白均能与多抗血清反应。与ESAT-6蛋白相比较,嵌合蛋白及鞭毛蛋白fliC在体外均能诱导BMDC成熟。体外刺激F4/80+ MФ细胞实验表明,ESAT-6蛋白、fliC蛋白及嵌合蛋白均能上调腹腔MФ共刺激分子CD40、CD80、CD86和CD54。三种蛋白刺激BMDC及分选的F4/80+ MФ细胞分泌IL-12p70的检测结果显示,在刺激BMDC时,与ESAT-6蛋白组相比较,嵌合蛋白能够诱导分泌较高水平的IL-12p70;而在刺激F4/80+ MФ细胞时,与对照相比较,三种蛋白刺激后,F4/80+ MФ细胞均不能分泌有效的IL-12p70。在体内实验中,用嵌合蛋白静脉注射免疫C57BL/6小鼠,结果嵌合蛋白免疫组能够显着增强ESAT-6特异性免疫应答,而且免疫应答以Th1为主。此外,将BCG与嵌合蛋白共滴鼻免疫发现,在肺脏、PP、NALT及脾脏中均能诱导显着的Th1应答,与嵌合蛋白单一免疫组相比较,BCG能够增强ESAT-6特异性的免疫水平。检测CD8+CD69+细胞结果表明,BCG与嵌合蛋白共免疫组的CD8+CD69+细胞百分数均高于单独BCG及嵌合蛋白免疫组。从而说明,鞭毛嵌合表达ESAT-6抗原,有利于增强ESAT-6的特异性应答,鞭毛蛋白对ESAT-6抗原具有佐剂作用。BCG与嵌合蛋白共免疫结果提示,BCG与嵌合ESAT-6抗原的鞭毛蛋白之间具有协同作用,能够提高ESAT-6特异的免疫应答水平。
张亚丽[8]（2008）在《小鼠LIGHT真核表达载体的构建及其与乙肝核酸疫苗的联合免疫研究》文中进行了进一步梳理感染HBV能导致急性、慢性肝炎,与肝硬化及肝细胞癌有密切关系。目前,控制HBV感染的有效方法是接种乙肝疫苗。基因疫苗的兴起和发展为乙型肝炎病毒感染的防治提供了新的途径。基因疫苗可诱导机体产生细胞及体液免疫反应,特别是诱导细胞免疫反应的能力优于蛋白、多肽类疫苗,在乙型肝炎病毒的清除方面具有较好的应用前景,更适应于慢性病毒感染的预防与治疗。核酸疫苗的免疫效果在不同动物个体中差异较大,某些肿瘤及病毒的T、B细胞表位抗原性弱,难以诱导有效的T、B细胞免疫应答,提高核酸疫苗的免疫效果已成为研究热点。基因佐剂是将编码某些细胞因子及T、B细胞表面共刺激分子等的基因与目的基因克隆于同一载体或不同载体共同免疫动物,其表达的相应蛋白可起到佐剂的作用,从而大大增强T、B细胞的免疫应答水平。LIGHT是TNF配体家族的成员,可以共刺激T细胞增殖。HVEM是LIGHT介导T细胞活化的受体,LIGHT通过与HVEM结合发挥共刺激作用,参与T细胞增殖和细胞因子的产生。越来越多的证据表明LIGHT与其受体的相互作用可作为控制细胞免疫应答的潜在目标。本研究对小鼠LIGHT作为乙肝核酸疫苗的基因佐剂方面进行了初步研究。在克隆小鼠LIGHT基因的基础上,构建其胞外段基因的原核表达载体,在大肠杆菌中进行诱导表达并对其表达条件进行了初步的探索;构建LIGHT全长基因的真核表达质粒并在体外转染细胞,检测结果表明真核表达质粒中的LIGHT基因可在哺乳动物细胞中进行表达;混合淋巴细胞反应中LIGHT转染的树突状细胞可显着增强同种异体T淋巴细胞增殖;将LIGHT真核表达质粒与乙肝核酸疫苗质粒联合免疫Balb/c小鼠,细胞免疫与体液免疫功能检测结果表明LIGHT可以增强小鼠体内的特异性免疫应答,从而发挥免疫佐剂的作用。
霍晓溪[9]（2008）在《WT1在卵巢癌中的表达及其反义核酸诱导卵巢癌细胞凋亡的实验研究》文中研究表明目的研究WT1在上皮性卵巢癌组织中的表达及其反义核酸在体内、体外实验中对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响,探讨WT1基因的临床病理学意义和其反义核酸应用于卵巢癌治疗研究的可能性。方法检测各种不同病理类型卵巢组织及经紫杉醇治疗后裸鼠卵巢癌皮下移植瘤组织中WT1和相关凋亡基因的表达,应用WT1反义寡核苷酸转染卵巢癌SKOV3细胞株,检测、观察转染前后卵巢癌细胞体内、体外增殖和凋亡的改变。结果上皮性卵巢癌、尤其是浆液性囊腺癌组织中WT1的表达明显高于其它组织学类型,且与临床分期、组织学分级相关。经紫杉醇治疗后的裸鼠卵巢癌皮下移植瘤组织中WT1表达下降,同时出现凋亡。WT1反义寡核苷酸转染后的卵巢癌SKOV3细胞株生长缓慢,早期即发生凋亡,且体外成瘤能力降低。结论WT1在上皮性卵巢癌中高表达,可作为临床诊断的辅助性指标,其生物学效应是通过调节细胞的增殖和凋亡过程来实现的,可能成为卵巢癌治疗新的生物学靶点。
金明兰[10]（2007）在《口蹄疫病毒基因重组鸡痘病毒活载体疫苗系统鉴定研究》文中研究指明本研究以共表达FMDV衣壳蛋白前体P1-2A和蛋白酶3C基因的重组鸡痘病毒vUTAL3CP1为研究对象,较系统地进行遗传稳定性、理化学特性、生物学特性、病毒毒种系统鉴定等方面的研究,探索实验室的疫苗制备工艺;将重组鸡痘活载体疫苗分别接种小鼠、豚鼠、猪、牛,以及妊娠小鼠、豚鼠、猪、牛及其新生子代动物,利用临床观察、病理组织学、PCR、RT-PCR、ELISA、IFA、中和抗体检测、免疫组织化学等方法检测其病毒在体内的分布、病毒基因的残留、抗体消长规律、细胞毒性、组织毒性、生态环境影响;将接种动物与非接种动物同居,通过抗体水平和病毒基因检测,证明重组鸡痘活载体疫苗不会造成同居感染,接种动物不会造成垂直感染。通过临床观察、病理组织学检测等方法证明该疫苗在接种动物体内有无毒性;利用PCR、RT-PCR方法检测在免疫动物体内残留时间短,正常剂量和超大剂量对妊娠动物和子代动物无安全威胁,对生态环境无影响,从而进一步证明所构建的重组鸡痘病毒活载体疫苗的生物安全性。
二、裸DNA接种新途径:淋巴结内接种（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、裸DNA接种新途径:淋巴结内接种（论文提纲范文）
（1）微针介导的基于多重靶向于树突状细胞的抗肿瘤DNA疫苗纳米传递系统研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩写、术语表 |
| 引言 |
| 第一部分 PEI的支链修饰和表征 |
| 1 实验材料与仪器 |
| 1.1 试剂 |
| 1.2 仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 甘露吡喃异硫氰酸苯酯(MPITC)的合成 |
| 2.2 PEI的支链修饰合成 |
| 2.3 嫁接后graft-PEI结构鉴定 |
| 2.4 graft-PEI细胞毒性测定 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 甘露吡喃异硫氰酸苯酯(MPITC)合成结构鉴定 |
| 3.2 PEI的支链修饰后的结构鉴定 |
| 3.3 接枝率计算 |
| 3.4 Graft-PEI的细胞毒性 |
| 4 小结 |
| 第二部分 EGFP-TRP2-GM-CSF-FC重组质粒构建 |
| 1 实验材料与仪器 |
| 1.1 试剂 |
| 1.2 仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 引物序列设计 |
| 2.2 总RNA提取及cDNA合成 |
| 2.3 用PCR扩增目的基因片段 |
| 2.4 琼脂糖凝胶电泳分离目的基因片段 |
| 2.5 PCR产物胶回收 |
| 2.6 目的基因片段(Trp_2、GM-CSF)分别与T载体连接,并转化,鉴定筛选 |
| 2.7 Trp_2质粒,GM-CSF质粒以及pEGFP-N2质粒的提取 |
| 2.8 三种质粒双酶切、电泳纯化 |
| 2.9 目的片段(Trp2、GM-CSF、EGFP)与载体连接、转化 |
| 2.10 EGFP-Trp_2-GM-CSF-Fc质粒的鉴定 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 PCR扩增后目的基因片段的鉴定结果 |
| 3.2 中间克隆载体质粒的鉴定结果 |
| 3.3 EGFP-Trp_2-GM-CSF-Fc表达载体质粒的鉴定结果 |
| 4 小结 |
| 第三部分 GRAFT-PEI/DNA纳米复合物的制备及性质考察 |
| 1 实验材料与仪器 |
| 1.1 试剂 |
| 1.2 仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 质粒的提取 |
| 2.2 Graft-PEI/DNA纳米复合物的制备 |
| 2.3 Graft-PEI/DNA纳米复合物粒径和Zeta电位测定 |
| 2.4 纳米复合物的形态测定 |
| 2.5 凝胶电泳阻滞分析 |
| 2.6 载体材料的降解及抗DNase Ⅰ降解实验 |
| 2.7 纳米复合物在血清中对DNA保护 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 质粒的质量浓度及纯度测定 |
| 3.2 graft-PEI/DNA纳米复合物的粒径及Zeta电位测定 |
| 3.3 纳米复合物的形态观察 |
| 3.4 graft-PEI/DNA纳米复合物的凝胶电泳阻滞实验 |
| 3.5 载体材料降解及释放DNA能力及抗DNase Ⅰ酶解能力 |
| 3.6 聚合物在血清中对DNA保护 |
| 4 小结 |
| 第四部分 GRAFT-PEI/DNA纳米复合物体外转染效率和靶向性评价 |
| 1 实验材料与仪器 |
| 1.1 试剂 |
| 1.2 仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 MTT法考察Graft-PEI/DNA纳米复合物细胞毒性 |
| 2.2 用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪评价纳米复合物细胞摄取 |
| 2.3 用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪评价纳米复合物细胞转染 |
| 2.4 体外靶向性评价 |
| 2.5 人脐带血树突状细胞(DC)培养 |
| 2.6 纳米复合物对DC细胞的表型影响 |
| 2.7 ELISA法测DC细胞因子IFN-γ、IL-12p70分泌情况 |
| 2.8 统计分析 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 细胞毒性实验 |
| 3.2 细胞摄取实验 |
| 3.3 DC2.4细胞转染 |
| 3.4 体外靶向性评价 |
| 3.5 人脐带血树突状细胞(DC)培养及表征 |
| 4 小结 |
| 第五部分 微针作用下GRAFT-PEI纳米复合物透皮情况 |
| 1 实验材料与仪器 |
| 1.1 试剂 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物皮肤处理 |
| 2.2 微针针孔的观察 |
| 2.3 微针阵列的皮肤刺入实验 |
| 2.4 基于微针递送的Graft-PEI纳米复合物在皮肤中的分布 |
| 2.5 体外透皮实验 |
| 2.6 微针作用下,Graft-PEI纳米复合物体内靶向性评价 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 微针针孔的观察 |
| 3.2 微针阵列的皮肤刺入实验 |
| 3.3 微针递送的Graft-PEI/DNA纳米复合物在皮肤中的分布 |
| 3.4 体外透皮实验 |
| 3.5 体内靶向性评价 |
| 4 小结 |
| 第六部分 微针作用下GRAFT-PEI/DNA纳米复合物体内免疫效果评价 |
| 1 实验材料与仪器 |
| 1.1 试剂 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 Graft-PEI/DNA纳米复合物的经皮免疫效果检测 |
| 2.2 Graft-PEI/DNA纳米复合物的经皮抗肿瘤免疫治疗 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 Graft-PEI/DNA纳米复合物的经皮免疫效果检测 |
| 3.2 肿瘤免疫治疗各组小鼠抑瘤效果及生存率 |
| 3.3 免疫治疗后组织学考察 |
| 4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在读期间所取得的科研成果 |
（2）表达NDV HN基因重组腺病毒对BEL-7402细胞及转移模型的抑制作用（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 肝细胞癌治疗方法的研究进展 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 肝癌的流行病学 |
| 1.3 肝病的检查及鉴别诊断 |
| 1.4 肝癌的发病机理 |
| 1.5 局部治疗 |
| 1.6 手术疗法 |
| 1.7 当前肝癌的治疗手段 |
| 1.8 遗传图谱 |
| 1.9 肿瘤的基因治疗 |
| 1.10 展望 |
| 第2章 肝癌基因治疗的研究进展 |
| 2.1 概述 |
| 2.2 分子发病机制的概述 |
| 2.3 分子治疗肝细胞癌 |
| 2.4 特殊药物对HCC的治疗 |
| 2.5 基因治疗 |
| 2.6 HCC与JNK1的激活作用 |
| 2.7 血管内皮生成因子的作用 |
| 2.8 复制腺病毒靶向的肿瘤病毒疗法 |
| 2.9 肿瘤微环境调节 |
| 2.10 小结 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 Ad-HP和Ad-HT对BEL-7402细胞的抑制作用 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 Ad-HP和Ad-HT对BEL-7402细胞的抑制方式 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 Ad-HP和Ad-HT对信号分子的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 Ad-HP和Ad-HT的体内抑瘤作用研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（3）堆型艾美耳球虫3-1E重组质粒PLGA微球包被技术研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 综述 |
| 1 鸡球虫病的国内外研究现状 |
| 1.1 球虫疫苗的种类 |
| 1.2 DNA 疫苗在球虫领域中的研究 |
| 2 鸡的黏膜免疫 |
| 2.1 鸡的的肠道免疫系统 |
| 2.2 鸡的黏膜免疫的特点 |
| 2.3 黏膜免疫的机制 |
| 3 DNA 疫苗微球化技术 |
| 3.1 微球化技术 |
| 3.2 微球疫苗的释放 |
| 4 口服DNA 疫苗微球的研究 |
| 4.1 口服DNA 疫苗的优越性 |
| 4.2 口服DNA 疫苗的常用载体材料 |
| 4.3 口服DNA 疫苗的制备 |
| 4.4 微球型口服DNA 疫苗的小肠吸收 |
| 4.5 影响微球吸收的因素 |
| 4.6 提高微球吸收率的方法 |
| 4.7 体内外免疫效果的评价 |
| 4.8 展望 |
| 5 存在问题 |
| 6 本研究的目的和意义 |
| 第二章3-1E 重组质粒PLGA 微球制备方法的研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 质粒DNA 纯度和浓度的测定 |
| 3.2 不同条件对PLGA 微球性能的影响 |
| 3.3 最佳工艺条件制备的PLGA 微球形态观察 |
| 3.4 疫苗微球载药量和包封率 |
| 3.5 微球中重组质粒的完整性 |
| 3.6 微球模拟胃液中的释放 |
| 3.7 微球模拟肠液中的释放 |
| 4 讨论 |
| 第三章 口服3-1E 重组质粒PLGA 微球的体内评价 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 免疫用DNA 疫苗 |
| 2.2 引物 |
| 2.3 实验动物 |
| 2.4 主要试剂和试剂盒 |
| 2.5 试验所用溶液及其配制 |
| 2.6 主要仪器设备 |
| 2.7 实验动物的饲养条件 |
| 2.8 质粒疫苗的稀释 |
| 2.9 雏鸡分组与免疫 |
| 2.10 给药方案 |
| 2.11 样品采集 |
| 2.12 各组织总DNA 的提取 |
| 2.13 鸡体内各种组织中3-1E 基因的检测 |
| 2.14 鸡外周血淋巴细胞培养及检测 |
| 2.15 间接ELISA 检测血清中IgG 含量 |
| 3 结果 |
| 3.1 总基因组DNA 琼脂糖凝胶电泳结果 |
| 3.2 pcDNA3-1E 在雏鸡各组织中的分布情况 |
| 3.3 血清中IgG 含量变化结果 |
| 3.4 MTT 法检测鸡外周血淋巴细胞转化试验 |
| 4 讨论 |
| 第四章 不同方式接种DNA 疫苗免疫效果的比较 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 疫苗 |
| 2.2 试验所用溶液及其配制 |
| 2.3 主要仪器设备 |
| 2.4 实验动物的饲养条件 |
| 2.5 试验分组及免疫方案 |
| 2.6 给药方案 |
| 2.7 接种卵囊 |
| 2.8 抗球虫效果判定 |
| 2.9 微球稳定性试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 接种卵囊后的临床表现 |
| 3.2 增重影响 |
| 3.3 十二指肠内容物卵囊数及十二指肠病变值变化 |
| 3.4 抗球虫指数 |
| 3.5 微球稳定性试验 |
| 4 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
（4）DNA疫苗的免疫调节和接种方案的研究进展（论文提纲范文）
| 1 质粒设计 |
| 2 目的基因的选择 |
| 3 通过基因的改造影响免疫反应 |
| 4 转录组件 |
| 5 接种方案 |
| 6 接种方法 |
| 7 佐剂 |
| 8 初免-加强或混合免疫接种 |
| 9 结论 |
（5）含有CpG基序的PRRSV ORF5基因的真核重组表达载体的构建及其免疫反应的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 一、前言 |
| 二、文献综述 |
| 2.1 猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）的研究进展 |
| 2.1.1 病原学特性 |
| 2.1.2 流行病学特点 |
| 2.1.3 临床症状 |
| 2.1.4 发病机制及病理变化 |
| 2.1.5 PRRSV 的持续感染 |
| 2.2 猪繁殖与呼吸综合征病毒（PPRSV）的分子生物学研究进展 |
| 2.2.1 病毒的基因组结构 |
| 2.2.2 病毒基因组的表达及所编码的蛋白 |
| 2.2.3 病毒变异与基因重组 |
| 2.3 猪繁殖与呼吸综合征病毒（PPRSV）的免疫 |
| 2.3.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的体液免疫 |
| 2.3.2 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的细胞免疫 |
| 2.4 猪繁殖与呼吸综合征病毒（PPRSV）疫苗的研究进展 |
| 2.4.1 灭活油剂疫苗 |
| 2.4.2 弱毒疫苗 |
| 2.4.3 基因疫苗 |
| 2.5 提高基因工程疫苗免疫效果的策略 |
| 2.5.1 CpG-ODN 的细胞激活作用 |
| 2.5.2 CpG-ODN 的生物体内效应 |
| 2.5.3 对天然免疫的刺激效果 |
| 2.5.4 对获得性免疫反应的刺激效果 |
| 2.5.5 CpG-ODN 免疫刺激增强作用的机制 |
| 2.5.6 CpG-ODN 生物学活性的投递运载工具 |
| 2.5.7 CpG ODN 作为新型免疫佐剂的前景及用途 |
| 三、实验部分 |
| 实验一：不同序列的CpG-ODN对猪体外免疫细胞免疫刺激作用的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 CpG-ODN 的合成 |
| 1.1.2 试验动物 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 猪外周血、脾脏的采 |
| 1.2.2 外周血淋巴细胞的分离培养 |
| 1.2.3 脾脏免疫细胞的分离 |
| 1.2.4 活力检测与计数 |
| 1.2.5 外周血淋巴细胞和脾脏免疫细胞增殖试验（MTT 法） |
| 1.2.6 数据处理 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同序列 CpG-ODN 对猪外周血淋巴细胞的刺激作用的结果分析 |
| 2.2 不同序列CpG-ODN 对猪脾细胞的刺激作用的结果分析 |
| 实验二：含CpG 序列 PRRSV SD1 ORF5 基因真核表达载体质粒构建及 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 质粒及工程菌 |
| 1.1.2 所用引物 |
| 1.1.3 CpG-ODN序列 |
| 1.1.4 主要试剂和仪器 |
| 1.1.5 细胞和抗原 |
| 1.1.6 实验动物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 PCR 扩增ORF5 基因 |
| 1.2.2 ORF5 基因的纯化 |
| 1.2.3 pVAX1-ORF5 载体的构建 |
| 1.2.4 CpG-pVAX1-ORF5 重组质粒的构建 |
| 1.2.5 CpG-pVAX1-ORF5 重组质粒质粒的序列测定 |
| 1.2.6 重组质粒的纯化和转染细胞 |
| 1.2.7 重组质粒转染细胞 |
| 1.2.8 间接免疫荧光实验（IFA） |
| 1.2.9 基因的转录鉴定 |
| 1.3 免疫小鼠 |
| 1.3.1 免疫用质粒DNA 的制备 |
| 1.3.2 实验分组 |
| 1.3.3 脾T 淋巴细胞的制备 |
| 1.3.4 脾T 淋巴细胞亚群数量的检测 |
| 1.3.5 淋巴细胞转化试验 |
| 1.4 免疫小鼠血清抗体检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组质粒的构建 |
| 2.1.1 PCR 扩增结果 |
| 2.1.2 pVAX1-ORF5 和CpG-pVAX1-ORF5 重组质粒的鉴定 |
| 2.1.3 CpG-pVAX1-ORF5 测序鉴定 |
| 2.2 质粒CpG-pVAX1-ORF5 的转染与RT-PCR 鉴定基因的转录 |
| 2.2.1 质粒 CpG-pVAX1- ORF5 的体外表达 |
| 2.3 T 细胞亚类数量的检测 |
| 2.4 小鼠外周血淋巴细胞和脾脏免疫细胞转化试验（MTT 法） |
| 2.4.1 小鼠外周血淋巴细胞的刺激作用的结果分析 |
| 2.4.2 小鼠脾脏细胞的刺激作用的结果分析 |
| 2.5 实验小鼠血清中 PRRSV 特异性抗体测定 |
| 实验三：含 CpG 序列 PRRSV SD1 ORF5 基因真核表达载体质粒对猪体免疫作用研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 病毒和抗原 |
| 1.3 质粒和引物 |
| 1.4 主要试剂和仪器 |
| 1.4.1 试剂 |
| 1.4.2 主要仪器 |
| 1.4.3 溶液的配制 |
| 1.5 实验动物分组及免疫 |
| 1.6 攻毒 |
| 1.7 淋巴细胞转化试验 |
| 1.7.1 淋巴细胞悬液的制备 |
| 1.7.2 实验猪淋巴细胞增值反应的测定 |
| 1.7.3 数据处理 |
| 1.8 免疫血清特异性抗体和中和抗体的检测 |
| 1.8.1 血清特异性抗体的检测 |
| 1.8.2 血清的中和抗体的检测 |
| 1.9 IL-2 的定量检测 |
| 1.9.1 准备工作 |
| 1.9.2 试验步骤 |
| 1.10 实验猪PRRSV的RT-PCR检测和病理学观察 |
| 1.10.1 临床观察 |
| 1.10.2 病理组织切片观察 |
| 2、结果 |
| 2.1 实验猪淋巴细胞增殖反应的测定 |
| 2.2 血清的 ELISA 抗体水平和中和抗体水平的检测 |
| 2.2.1 血清的 ELISA 抗体水平 |
| 2.2.2 特异性中和抗体效价的测定 |
| 2.3 重组质粒对猪血清中 IL-2 浓度的影响 |
| 2.4 实验猪PRRSV 的RT-PCR 检测和病理学观察 |
| 2.4.1 免疫猪攻毒后4 周的临床症状和病理变化 |
| 2.4.2 组织和血清中 PRRSV 核酸的检测 |
| 2.4.3 病理切片观察 |
| 四、讨论 |
| 4.1 淋巴细胞转化试验（MTT 法）进行体外筛选不同CpG-ODN序列的讨论 |
| 4.2 不同长度的 CpG-ODN 活性不同的机制探讨 |
| 4.3 对 CpG 骨架进行了硫代修饰必要性的讨论 |
| 4.4 关于PRRSV ORF5 基因免疫方面的研究 |
| 4.5 在构建DNA疫苗时，载体的选择是一个很关键的问题 |
| 4.6 真核重组表达质粒表达外源基因水平的讨论 |
| 4.7 CpG-ODN 免疫增强活性的讨论 |
| 4.8 CpG-ODN 对猪体攻毒保护试验的讨论 |
| 4.9 PRRSV 攻毒试验中对猪体造成病理损伤及致病机制的探讨 |
| 4.10 CpG-ODN 的研究意义和发展前景的讨论 |
| 五、结论 |
| 六、参考文献 |
| 七、附录 |
| 八、致谢 |
| 九、在博士期间发表录用的文章及获奖情况 |
（6）NDV HN基因和CAV Apoptin基因对宫颈癌细胞的体外杀伤作用及其体内抑瘤效应研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 免疫疫苗用于治疗和预防癌症的研究进展 |
| 1.前言 |
| 2.肿瘤抗原的类型 |
| 3.癌症疫苗的特征 |
| 4.关于提高癌症疫苗有效性的展望 |
| 5.结论 |
| 第二章 抗肿瘤基因治疗 |
| 1.前言 |
| 2.肿瘤抑制基因 |
| 3.肿瘤抑制基因的抗肿瘤作用 |
| 4.相关抑癌基因的研究现状 |
| 5.未来前景 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 甲病毒复制子介导表达NDV HN,CAV Apoptin真核表达质粒的构建及在Hela细胞中的表达 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 第二章 重组真核表达质粒pSFVApoptin和pSFVHN对Hela细胞的杀伤作用 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 第三章 重组鸡痘病毒vFVApoptin和vFVHN的对体外培养人宫颈癌Hela细胞的抑制作用 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3 讨论 |
| 4.小结 |
| 第四章 重组质粒及重组鸡痘病毒的体内抑瘤实验及对动物模型免疫功能的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的学术论文和其他成果 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 致谢 |
| CURRICULUM VITAE |
（7）重组沙门菌表达结核分枝杆菌保护性抗原ESAT-6、CFP-10及其黏膜免疫机理研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 综述一 不同类型免疫应答在疾病中的重要作用 |
| 1 免疫类型 |
| 2 天然免疫 |
| 3 获得性免疫 |
| 4 黏膜免疫 |
| 5 结语 |
| 参考文献 |
| 综述二 结核分枝杆菌和沙门菌研究进展 |
| 1 结核病（Tuberculosis, TB）及病原背景 |
| 2 沙门菌研究进展 |
| 3 结语 |
| 参考文献 |
| 第一章 结核分枝杆菌ESAT-6 和CFP-10 蛋白的克隆、表达及免疫原性分析 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 重组沙门菌表达的ESAT-6、CFP-10 及其特异性免疫应答分析 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 沙门菌鞭毛蛋白嵌合表达的ESAT-6 及其免疫学特性分析 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 嵌合鞭毛蛋白fliC/esat与BCG黏膜共免疫诱导的免疫应答分析 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文目录 |
| 致谢 |
（8）小鼠LIGHT真核表达载体的构建及其与乙肝核酸疫苗的联合免疫研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 一、核酸疫苗 |
| 二、乙肝核酸疫苗 |
| 三、基因佐剂 |
| 四、LIGHT |
| 实验一 小鼠LIGHT基因的克隆及其胞外段在大肠杆菌中的表达 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 实验二 LIGHT在真核细胞中的表达及功能检测 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 实验三 乙肝核酸疫苗与LIGHT真核表达质粒的联合免疫研究 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 |
（9）WT1在卵巢癌中的表达及其反义核酸诱导卵巢癌细胞凋亡的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 详细摘要 |
| 缩略词表 |
| 第一部分 WT1在上皮性卵巢癌组织中的表达及临床病理学意义 |
| 材料和对象 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 紫杉醇诱导卵巢癌凋亡过程中WT1表达的变化 |
| 材料和对象 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 WT1反义寡核苷酸对卵巢癌细胞增殖和凋亡作用的研究 |
| 材料和对象 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 WT1反义寡核苷酸诱导卵巢癌细胞凋亡的体外研究 |
| 材料和对象 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 全文总结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）口蹄疫病毒基因重组鸡痘病毒活载体疫苗系统鉴定研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 重组病毒活载体疫苗的研究进展 |
| 1 反转录病毒载体 |
| 2 腺病毒载体 |
| 3 腺相关病毒载体 |
| 4 单纯疱疹病毒载体 |
| 5 辛德毕斯病毒载体 |
| 6 痘病毒 |
| 7 结语 |
| 第二章 口蹄疫病毒重组载体疫苗的研究进展 |
| 1 口蹄疫的危害 |
| 2 FMDV 的特点 |
| 3 载体的选择 |
| 4 FMDV 重组病毒活载体疫苗应用 |
| 5 结语 |
| 第三章 重组鸡痘病毒疫苗安全性研究进展 |
| 1 基因工程生物制品的安全性评价要求 |
| 2 鸡痘病毒 |
| 3 重组鸡痘病毒活载体疫苗安全评价的研究 |
| 4 结语 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 重组鸡痘病毒遗传稳定性和理化学特性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 重组鸡痘病毒毒种鉴定及生物学特性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 重组鸡痘病毒在小鼠、豚鼠体内的毒性、分布及抗体消长规律研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 重组鸡痘病毒在猪、牛体内的毒性、分布、抗体消长规律研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 重组鸡痘疫苗对妊娠动物和子代动物毒性实验 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第六章 重组鸡痘病毒毒性试验和环境释放安全试验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表论文 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| CURRICULUM VITAE |
四、裸DNA接种新途径:淋巴结内接种（论文参考文献）
- [1]微针介导的基于多重靶向于树突状细胞的抗肿瘤DNA疫苗纳米传递系统研究[D]. 胡英. 浙江大学, 2014(01)
- [2]表达NDV HN基因重组腺病毒对BEL-7402细胞及转移模型的抑制作用[D]. 朴秉国. 吉林大学, 2011(05)
- [3]堆型艾美耳球虫3-1E重组质粒PLGA微球包被技术研究[D]. 常丽云. 河北农业大学, 2011(07)
- [4]DNA疫苗的免疫调节和接种方案的研究进展[J]. 胡慧珍. 当代畜禽养殖业, 2009(10)
- [5]含有CpG基序的PRRSV ORF5基因的真核重组表达载体的构建及其免疫反应的研究[D]. 温建新. 山东农业大学, 2008(02)
- [6]NDV HN基因和CAV Apoptin基因对宫颈癌细胞的体外杀伤作用及其体内抑瘤效应研究[D]. 朱继红. 吉林大学, 2008(11)
- [7]重组沙门菌表达结核分枝杆菌保护性抗原ESAT-6、CFP-10及其黏膜免疫机理研究[D]. 张辉. 扬州大学, 2008(01)
- [8]小鼠LIGHT真核表达载体的构建及其与乙肝核酸疫苗的联合免疫研究[D]. 张亚丽. 华东师范大学, 2008(11)
- [9]WT1在卵巢癌中的表达及其反义核酸诱导卵巢癌细胞凋亡的实验研究[D]. 霍晓溪. 第二军医大学, 2008(02)
- [10]口蹄疫病毒基因重组鸡痘病毒活载体疫苗系统鉴定研究[D]. 金明兰. 吉林大学, 2007(03)