一、重组人白细胞介素-18表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达（论文文献综述）
张艳雯,张鹤曦,覃静,周晴云,唐子琼[1]（2020）在《鸡白细胞介素2和白细胞介素18基因的原核及真核表达》文中指出【目的】克隆并原核和真核表达无特定病原（SPF）鸡白细胞介素2（ChIL-2）和白细胞介素18（ChIL-18）基因,为后续开展ChIL-2和ChIL-18蛋白功能、生物学活性及联合应用的免疫佐剂研究打下基础。【方法】运用RT-PCR扩增ChIL-2和ChIL-18基因,并进行测序和序列比对分析,分别构建其重组原核表达质粒pET32a-ChIL-2和pET28a-ChIL-18及重组真核表达质粒pVAX1-ChIL-2和pVAX1-ChIL-18,并将重组原核表达质粒pET32a-ChIL-2和pET28a-ChIL-18分别转化大肠杆菌BL21,将重组真核表达质粒pVAX1-ChIL-2和pVAX1-ChIL-18分别转染非洲绿猴肾（Vero）细胞。【结果】重组原核表达质粒pET32a-ChIL-2和pET28a-ChIL-18经IPTG诱导表达,其表达产物经SDS-PAGE和Western blotting分析,结果表明融合蛋白ChIL-2和ChIL-18在大肠杆菌中获得高效表达,表达的蛋白分子量分别为27和23 kD;重组真核表达质粒pVAX1-ChIL-2和pVAX1-ChIL-18转染Vero细胞24 h后进行倒置荧光显微镜检测,结果显示融合蛋白ChIL-2和ChIL-18在Vero细胞中均有较高表达。【结论】克隆获得的ChIL-2和ChIL-18基因可在原核和真核细胞中高效表达。
宋世斌[2]（2020）在《藏獒犬IFN-γ,IFN-α和IL-18基因克隆、表达及产物活性鉴定》文中认为干扰素（Interferon,IFN）是机体细胞受到病毒等生物诱导剂刺激而产生的一类分泌型糖蛋白类细胞因子,而白细胞介素18（Interleukin-18,IL-18）是一种具有促炎作用的细胞因子,由机体活化的单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等产生,能诱导IFN-γ等细胞因子的分泌,具有促进T细胞增殖、增强Th1型细胞、NK细胞及CTL细胞的细胞毒效应,与临床自身免疫性疾病及心血管系统疾病等多种疾病的发生发展呈现相关性,IFN和IL-18都具有抗病毒、抗寄生虫和细菌感染、抗肿瘤、免疫调节等多种生物学功能。因此,本实验开展藏獒犬IFN-γ、IFN-α和IL-18的相关研究,采用分子克隆和基因工程等技术获得了3个基因,体外制备了藏獒犬3个基因的重组蛋白,验证了其生物学活性,并开展了临床相关实验,丰富了犬细胞因子的知识,对犬疾病的检测和防控以及保障人类健康有着重要的意义,在犬疾病的防控上有着广阔的应用前景。第一,从藏獒犬血液中分离淋巴细胞,利用脂多糖（LPS）与植物血凝素（PHA）联合刺激淋巴细胞后提取RNA,经RT-PCR扩增IFN-γ、IFN-α和IL-18基因全长片段,将扩增到的基因分别克隆到pGEM-T-easy载体,经酶切、测序鉴定,结果表明:所克隆的IFN-γ基因与GenBank上登载的犬核苷酸序列同源性达99.6%,开放阅读框为501 bp,编码166个氨基酸（AA）,N端23个AA为信号肽,成熟蛋白编码143个AA,分子量为17.2 kD;克隆的IFN-α基因与GenBank上登载的犬核苷酸序列同源性达96.0%,其开放阅读框为564 bp,N端23个AA为信号肽,成熟蛋白编码164个AA,推测的分子量为19.0 kD;克隆的IL-18基因与GenBank上登载的犬核苷酸序列同源性达100%,其开放阅读框为582 bp,编码193个AA,N端36个AA为信号肽,成熟蛋白编码157个AA,推测的分子量为18.1 kD。第二,根据克隆的藏獒犬IFN-γ、IFN-α和IL-18基因阅读框序列,设计3个基因去掉信号肽的表达引物,克隆去信号肽后的目的片段,构建原核表达质粒pET-30a-IFN-γ、pET-30a-IFN-α和pET-30a-IL-18,转化大肠杆菌后诱导表达。经优化诱导条件后,3个重组菌都能够在温度为37℃,浓度为0.5 mM IPTG的诱导条件下成功的表达,3个重组菌在诱导后主要以包涵体形式表达,其中pET-30a-IFN-γ重组蛋白在上清中也有一定量的表达;经SDS-PAGE分析,pET-30a-IFN-γ、pET-30a-IFN-α和pET-30a-IL-18表达的蛋白分别约为23 kD、25kD和24 kD,表达的蛋白大约占菌体蛋白30%35%。第三,用镍琼脂糖凝胶纯化层析柱纯化pET-30a-IFN-γ、pET-30a-IFN-α和pET-30a-IL-18重组蛋白,纯度达到90%以上,通过梯度透析复性法复性蛋白。利用抑制病毒噬斑法测定重组藏獒犬IFN-γ和IFN-α的生物学活性,二者都具有抗病毒的活性,而且IFN-α抑制VSV的作用强于IFN-γ,二者的抗病毒活性在一定的浓度范围内有作用,在高于或低于这个浓度范围时发挥的效果一般;利用MTS法检测重组藏獒犬IL-18重组蛋白的生物学活性,纯化的重组IL-18具有诱导淋巴细胞增殖的能力,说明表达的蛋白具有生物学活性。第四,通过对总数为128只犬病毒性传染病病例（包括犬细小病毒病、犬冠状病毒病及犬瘟热3类宠物常见病）的IFN治疗组和对照治疗组的比较分析结果显示:IFN治疗组中3类疾病总计67只,治愈45只,平均治愈率67.2%,对照治疗组中3类疾病总计61只,治愈34只,平均治愈率55.7%,使用本实验获得的IFN-α重组蛋白治疗宠物犬病毒性传染病,能显着提高治愈率,有较好的临床治疗病毒性疾病的效果。本研究克隆了藏獒犬IFN-γ、IFN-α和IL-18基因,并应用分子生物学软件对序列进行生物信息学分析;首次成功的表达了3个基因,纯化、复性了重组蛋白,发现IFN-γ、IFN-α和IL-18基因具有较高的生物学活性,可以开发利用;通过藏獒犬IFN-α重组蛋白的临床病毒性犬病的治疗,验证了藏獒犬IFN的抗病毒活性。藏獒犬是中国特有的大型犬种,本研究为犬基因工程生物制品的进一步开发和相关疾病的检测及防治奠定了理论基础。
杨文静[3]（2019）在《猪NLRP6基因表达载体构建及其多克隆抗体的制备》文中研究指明核苷酸结合寡聚化结构域受体（NOD-like receptors,NLRs）是先天性免疫中病原识别受体之一,在机体防御中起着重要作用。NLRP6是NOD样家族中一类作用机理比较特别的蛋白,在免疫中的作用与其调节caspase-1和NF-κB活性的能力有关。本试验以猪NLRP6基因为研究对象。依据猪NLRP6全基因核苷酸序列（GenBank登录号:XM-003124236.4）设计特异性引物,利用PCR从pMD-19T-NLRP6重组载体中扩增获得NLRP6基因,将该基因片段连接到原核表达载体pET-32a（+）中,获得重组表达质粒pET-32a-NLRP6,通过抗性筛选、酶切、PCR鉴定重组质粒。将重组质粒pET-32a-NLRP6转化至大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞,IPTG诱导其高效表达,获得分子量大小约为34KDa的以包涵体形式存在的NLRP6重组融合蛋白,Western blot结果表明其与小鼠抗6×His单克隆抗体呈阳性反应。NLRP6重组融合蛋白经镍离子柱纯化、变性和复性后,即获得了可溶性NLRP6重组融合蛋白。以纯化的融合蛋白作为抗原,按合理免疫程序免疫BALB/c雌性小鼠,制备多克隆抗体,多抗血清经Western blot鉴定其特异性,结果显示鼠抗NLRP6多克隆抗体可以特异性识别NLRP6蛋白。本试验利用原核表达系统成功制备了NLRP6蛋白,并制备了免疫活性和特异性良好的鼠抗NLRP6多克隆抗体,为NLRP6蛋白生物学功能及相关疾病致病机制研究提供了基础材料。
石昂[4]（2018）在《共表达猪繁殖与呼吸综合征病毒膜蛋白GP5（GP5m）、M与猪IL-18重组变异猪伪狂犬病病毒的构建及免疫原性评价》文中研究说明伪狂犬病病毒（Pseudorabies Virus,PRV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome Virus,PRRSV）是影响世界养猪业发展的两大重要传染病病原,分别引起猪的伪狂犬病（PR）和猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）。PR和PRRS是引起母猪发生繁殖障碍、育肥猪发生呼吸道疾病及初生仔猪出现神经症状和高死亡率的主要病毒性传染病。这两种传染病在我国各种类型猪场中广泛存在,给我国养殖业造成巨大的经济损失,严重制约我国养殖业的发展。PRRS在世界上多个国家和地区都存在流行或暴发,由此造成经济损失的同时也带来了严重的生物安全问题。世界各国为了控制PRRS在世界上的流行和暴发,每年都投入大量的资金和资源并采取了积极的防控措施。针对传染病控制“防重于治”的原则对于PRRS疫苗的研发从其暴发时就已开始。在中国,各种类型的疫苗有很多,但仍以灭活疫苗和减毒活疫苗为主。从目前应用的效果看,目前PRRS疫苗的免疫效果不好,保护率不高,对PRRSV的感染只能起到部分保护作用。为弥补目前PRRS疫苗的缺点,开发新型PRRS疫苗则势在必行。近年来,随着基因工程技术的发展,PRRS基因工程疫苗的研发成为目前研究的热点。与灭活疫苗和减毒活疫苗相比,PRRS基因工程疫苗作为一种新型疫苗有更多优势,对PRRS基因工程疫苗的研发主要是重组活载体疫苗和核酸疫苗。2011年底以来,很多免疫猪伪狂犬病基因缺失活疫苗的猪场再次出现了疑似猪伪狂犬病的暴发,通过毒株分离和测序分析表明PRV在多个基因位点出现了不同程度的变异从而引起其毒力发生改变。结合临床调查结果发现,市场存在的猪伪狂犬病基因缺失活疫苗不能对目前PRV变异毒株提供100%保护。因此开发一种以目前流行毒株为亲本毒株的新型伪狂犬病基因缺失活疫苗对于目前PR的防治显得尤为重要。基于伪狂犬病基因缺失活疫苗的成功应用,使以PRV流行毒株为载体构建表达外源免疫原性基因的重组PRV成为目前猪伪狂犬病基因工程疫苗研究的热点。本研究选择与PRRSV中和抗体产生相关的膜蛋白GP5和M作为插入的外源免疫原基因,将GP5、M、修饰型GP5（GP5m）及猪白细胞介素18基因（IL-18）以不同的组合方式克隆至真核表达载体pTK,构建了五种重组转移载体:（1）pTK-GP5-M（2）pTK-GP5-M-IL-18（3）pTK-GP5m（4）pTK-GP5m-IL-18（5）pTK-IL-18。将重组转移载体pTK-GP5-M、pTK-GP5-M-IL-18、pTK-GP5m、pTK-GP5m-IL-18免疫家兔,进行初步免疫原性试验。在此基础上以本试验室分离到的PRV流行毒株构建的基因缺失株rPRV-gE-/TK-/GFP+为载体在293T细胞中通过同源重组的方式构建了五种重组伪狂犬病病毒（1）rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+（2）rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+/IL-18+（3）PRV-gE-/TK-/GP5m+（4）rPRV-gE-/TK-/GP5m+/IL-18+（5）rPRV-gE-/TK-/IL-18+并进行免疫原性研究。为了测定五种重组病毒的免疫原性,将45只雌性试验小鼠随机分成9组,每组5只,将已获得的5种不同的重组病毒按105.5TCID50/只的免疫剂量免疫小白鼠。第1组:rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+;第2组:rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+/IL-18+;第3组:rPRV-gE-/TK-/GP5m+;第4组:rPRV-gE-/TK-/GP5m+/IL-18+;第五组:rPRV-gE-/TK-/IL-18+;第六组:105.5TCID50rPRV-TK-/gE-;第七组:免疫104.6TCID500 PRRSV VR2332疫苗株;第八组:免疫105.5TCID50PRV HB-98疫苗株;第九组:DMEM。免疫途径均为皮下注射+滴鼻免疫,4周后加强免疫一次。首次免疫当天开始采血,每周小鼠尾静脉采血一次,间接ELISA检测特异性抗PRRSV ELISA抗体水平;每两周采血中和试验检测特异性抗PRRSV、PRV中和抗体水平;以此评价重组病毒对小白鼠的体液免疫水平;在2免后4周无菌分离小鼠脾脏T淋巴细胞,进行体外T淋巴细胞增殖试验及T淋巴细胞细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10表达检测试验以此评价免疫小白鼠的细胞免疫水平。抗PRRSV特异性中和抗体试验结果表明:首次免疫28d,VR2332疫苗株对照组抗PRRSV中和抗体水平达到3log2;rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+、rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+/IL-18+、rPRV-gE-/TK-/GP5m+/IL-18+组中和抗体水平较高,最高达到3log2;rPRV-gE-/TK-/GP5m+、rPRV-gE-/TK-/IL-18+组未检测到抗PRRSV中和抗体。抗PRRSV特异性ELISA试验结果表明:试验组rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+、rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+/IL-18+、rPRV-gE-/TK-/GP5m+/IL-18+、rPRV-gE-/TK-/GP5m+抗PRRSV ELISA IgG抗体水平在第二次免疫后一周达到高峰并持续2-3周且ELISA IgG抗体水平无太大差异。相比而言,抗PRRSV ELISA IgA抗体水平则较低。抗PRV特异性中和抗体试验结果表明:PRV HB-98株商品疫苗组中和抗体达到4log2;rPRV-TK-/gE-试验组中和抗体达到5log2;rPRV-gE-/TK-/IL-18+试验组抗PRV中和抗体水平较高,中和抗体水平最高达6log2。该试验结果表明临床所分离到的PRV流行毒株基因缺失株rPRV-TK-/gE-可以产生较高的抗PRV流行毒中和抗体且IL-18可以有效增强机体的特异性体液免疫。通过T淋巴细胞细胞因子表达检测试验可知,共表达IL-18试验组CD4+、CD8+T淋巴细胞比例增多且细胞因子表达水平更高,引起机体体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫反应更强烈。本研究为研发通过黏膜免疫途径接种的预防PRRS和PR有效的重组活载体疫苗奠定了坚实基础。
石昂,时庆贺,李新果,王玉国,杨利,李双双,陈陆,王川庆[5]（2017）在《猪白细胞介素18基因的克隆及真核表达重组质粒的构建》文中研究表明为获得表达猪白细胞介素18（interleukin-18,IL-18）的真核表达重组质粒,试验通过RT-PCR从猪脾脏、肺脏和淋巴结组织中扩增猪IL-18全基因并定向克隆到真核表达载体pZJ-1,测序分析和酶切鉴定正确后,转染至293T细胞中,并通过实时荧光定量PCR和Western blotting分别在基因和蛋白水平检测IL-18的表达。结果表明,试验成功构建了真核表达重组质粒pZJ-IL-18,且可以在293T细胞中表达IL-18基因。Western blotting试验证实,猪IL-18多克隆抗体能与约17ku的表达产物发生特异性反应,表明IL-18能正确表达且具有反应原性。本试验构建了表达猪IL-18基因的真核表达质粒,并在293T细胞中瞬时表达,为进一步研究IL-18的功能奠定基础。
杨兴武[6]（2017）在《猪PBD-1基因的扩增、克隆及成熟肽基因的原核表达》文中指出防御素（defensins）是机体抵御病原微生物时机体免疫防御过程中合成并分泌的一类重要的抗菌肽。它具有十分广泛的抗菌谱,对细菌、真菌、披膜病毒等多种病原都具有杀伤作用,对支原体、衣原体以及一些恶性细胞具有一定的抑制杀伤作用。其独特的杀菌机制,难以诱发细菌的耐药性,成为有巨大发展潜力的新型抗菌药物。猪β防御素-1（porcineβ-defensin-1,PBD-1）广泛存在于猪消化系统、呼吸系统和免疫系统等多个系统器官组织,在猪只固有免疫中具有重要作用。干酪乳酸杆菌（Lb.casei）广泛存在于人和动物肠道内,具有天然的抑菌作用,是一种公认的有益微生物。乳酸杆菌是至今发现的极少没有致病性的菌种,经过筛选的菌株能够抵抗胃酸和胆盐,所以Lb.casei可以通过口服的方式进入人和动物的肠道并大量定植进而达到大量运输异源蛋白的目的。而大肠杆菌作为首个重组蛋白表达宿主菌,其遗传背景清晰,易于控制表达、生产周期短等特性,成为外源基因表达的首选宿主。大肠杆菌Rosetta（DE3）含有6种稀有密码子对应的tRNA,可以避免密码子使用频率高而导致转录限制,可以提高外源真核基因的翻译水平。试验首先通过反转录-聚合酶链试反应（Reverse Transcription PCR,RT-PCR）方法从猪舌总RNA中扩增得到PBD-1的全基因（PBD1Q）,插入克隆载体pMD18-T。经酶切鉴定及序列测定,证实成功构建克隆载体pMD18T-PBD1Q。为构建干酪乳酸杆菌整合型表达载体,首先先人工合成150 bp的短小乳酸杆菌信号肽（SP）序列,构建出pUCK-SP载体。再从pMD18T-PBD1Q质粒上扩增出168bp的包含His-tag序列的猪PBD-1成熟肽基因的序列PBD1His,插入SP下游,构建pUCK-SP-PBD1His质粒。质粒经酶切回收SP-PBD1His片段,然后插入pMJ67载体。经序列测定证明成功构建出整合型表达质粒pMJ67-SP-PBD1His。利用电转化方法,将重组整合型质粒转进干酪乳酸菌,经鉴定,证实重组猪PBD1His基因的Lb.casei构建成功。经半定量RT-PCR和Western blot分析,证实猪PBD1His基因在重组Lb.casei菌体内获得了表达。而在构建大肠杆菌复制型表达载体时,在pET28a质粒的Nde I和BamH I之间插入SUMO蛋白标签,替代其原有的T7标签。通过PCR方法从pMD18-PBD1Q质粒上扩增出129 bp猪PBD-1成熟肽基因序列PBD1,插入pET28a-SUMO载体Bam HⅠ和Xho I酶切位点之间,随后测序结果证实大肠杆菌复制型表达质粒pET28a-SUMO-PBD1构建完成。采用物理热冲击方法,将pET28a-SUMO-PBD1复制型表达载体导入大肠杆菌Rosetta（DE3）细胞。经卡那霉素筛选及序列测定,证明重组PBD1大肠杆菌构建成功。经过SDS-PAGE和Western blot分析表明,经过IPTG诱导,猪PBD1在Rosetta（DE3）菌体内获得了表达。诱导条件经优化,重组菌菌体内表达PBD1最佳条件（诱导剂终浓度为0.6 mM,诱导时间为6 h）。
孙冬冬[7]（2013）在《重组大鼠白细胞介素18（rrIL-18）的毕赤酵母表达及其对大鼠肝细胞和肿瘤细胞的作用研究》文中研究表明白细胞介素18（IL-l8）又称IFN-γ诱导因子（IGIF），是上世纪90年代发现的一种细胞因子，主要由活化的巨噬细胞产生。IL-18能够诱导Thl、NK、T细胞产生IFN-γ，具有抗肿瘤、抗病原微生物以及抗超敏反应等生物学功能，另外IL-l8还与I型糖尿病、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病有关。由此可见，IL-18具有多种生物学功能并且有潜在的临床应用价值。本文研究了大鼠白细胞介素18在毕赤酵母（Pichia pastoris）中的表达，并摸索了重组大鼠IL-18的纯化工艺，以及rrIL-18对大鼠肝细胞的增殖作用研究。本文研究不同载体-菌株组合对rrIL-18表达水平的影响时发现：在表达rrIL-18时，pPICZα系列载体作为表达载体要优于pPIC9系列表达载体；而选用X-33菌株的rrIL-18表达水平要优于GS115菌株，说明选用X-33作为宿主菌有利于提高rrIL-18的表达量。本文研究3L发酵罐规模下不同因素对rrIL-18表达水平的影响时发现，不同的起始诱导密度、溶解氧体积分数（DO）、pH、温度、甲醇浓度以及甘油添加量等培养条件对rrIL-18表达水平均有影响。最佳表达条件为一级种子以10%的接种量接入基础盐培养基中，起始诱导密度为750，发酵过程中保持DO在20%，诱导温度22℃，pH=5.75，甲醇电极控制甲醇浓度在0.25%，诱导过程中添加甘油2g/（L·h），发酵全过程由发酵罐控制系统进行在线控制和数据采集。最佳表达条件下，诱导144h后rrIL-18表达量接近0.35g/L。本文摸索了分离纯化rrIL-18的条件，结果表明，运用超滤、等电点沉淀、乙醇沉淀以及疏水层析依次对rrIL-18的3L发酵液进行分离纯化，可获得纯度90%左右的目的产物。本文初步检测了rrIL-18对大鼠肝细胞生长增殖作用，BrdU免疫荧光法测得结果发现rrIL-18对大鼠肝细胞有增殖作用，其增殖作用随浓度的升高而增强；但当其浓度超过一定值后对肝细胞的增殖作用不明显。从而为进一步搞清rrIL-18的其它生物学作用奠定了基础。
段莉姣[8]（2013）在《重组人白细胞介素-18（rhIL-18）的毕赤酵母表达及其对肿瘤细胞凋亡的诱导作用研究》文中研究指明在抗肿瘤等方面，IL-18具有潜在的应用价值。之前关于重组人IL-18表达的研究主要是原核表达系统，不仅表达量低，而且活性低，分离纯化也较困难。为此，本文选用毕赤酵母菌GS115为宿主菌，成功构建了pPIC9K-rhIL-18表达载体，从重组毕赤酵母菌中得到能正确表达的工程菌Pichia pastoris GS115/hIL-18，然后进一步探讨其3L罐规模的发酵条件、产物纯化工艺以及体外的生物学作用。本文首先对重组表达载体pPIC9K-rhIL-18进行鉴定，并将其经电转化整合到毕赤酵母受体菌GS115的基因组中，再通过基因组PCR鉴定和筛选，MD板筛选单克隆，BMGY培养基诱导培养，SDS-PAGE和Western Blot蛋白鉴定等检测，最终得到能正确表达的重组菌株。本文发现不同的起始诱导菌体密度、温度、pH、溶解氧体积分数（DO）和甲醇诱导浓度等培养条件均影响3L罐规模rhIL-18的表达水平。经研究得到最佳表达条件：一级种子接入1.5LBSM培养基，起始诱导菌体密度为600，发酵过程中DO保持在20%左右，最佳pH为6.0，诱导温度23℃，甲醇诱导浓度为0.25%，整个发酵过程通过发酵罐控制软件系统进行在线控制和数据采集。本文初步摸索了rhIL-18分离纯化的工艺条件，研究结果显示，采用低温离心除去菌体，0.22μm膜过滤，30kD和10kD膜超滤，低温乙醇结合等电点沉淀，疏水层析的分离纯化方法，可以得到纯度在90%左右，收率42%的rhIL-18。本文通过MTT法和Hoechst33258染色检测了rhIL-18对人肝癌细胞株BEL-7402、人肝癌细胞株QGY-7703、人肝癌细胞株QSG-7701、人宫颈癌细胞株HeLa和人乳腺癌细胞株MCF-7的体外生物学作用，研究发现rhIL-18均能抑制这五种癌细胞的活性，并且其抑制程度与rhIL-18的浓度成正比；此外，rhIL-18还能促进上述五种细胞不同程度的凋亡。从而为进一步研究rhIL-18的生物学作用机理奠定了基础。
张海滨[9]（2012）在《鸡白介素18成熟蛋白的发酵工艺及其对新城疫疫苗免疫增强作用研究》文中研究说明鸡白介素18（Chicken interleukin-18, ChIL-18）是2000年发现的一种细胞因子，它具有广泛的生物学活性，除能够促进γ-干扰素（IFN-γ）的产生，刺激淋巴细胞转化，增强NK细胞的杀伤活性，还在介导细胞免疫、抵抗微生物感染方面具有重要的作用。毕赤酵母表达系统是目前最为成功的外源蛋白表达系统之一，该系统操控简单、经济，表达量高，具有翻译后修饰的能力。目前已有多种外源蛋白在毕赤酵母表达系统中得到成功表达。因此可用毕赤酵母表达获得高产量且具有生物活性的鸡白介素18成熟蛋白（mature Chicken interleukin-18, mChIL-18）。本试验我们对表达重组鸡白介素18（mChIL-18）的毕赤酵母工程菌株GS115/pPIC9K-mChIL-18进行中试发酵表达，优化各种发酵条件以提高表达产量。然后将mChIL-18制备成脂质体制剂以提高其生物利用度，测定其对新城疫疫苗的免疫增强作用,为mChIL-18的研究与开发打下基础。本研究的主要结果如下：复苏工程菌GS115/pPIC9K-mChIL-18于YPD培养基，在其OD600达到5.2左右时转入发酵罐中，采用分批补料方式对毕赤酵母工程菌进行高密度发酵。控制和优化各种发酵条件，经历84h结束发酵。将发酵液离心，用6×His镍柱对上清中的表达产物进行纯化。经优化表达条件，证明在pH5.5，溶氧值20%-30%，温度28℃，诱导72h，mChIL-18的表达产量为560mg/L，发酵上清经纯化后纯度可达70%以上。用逆向蒸发法制备半胱胺脂质体将mChIL-18与胆固醇和磷酸卵磷脂按照一定的比例减压蒸馏制成，包封率为25.4%。同时，针对IL-18具有免疫治疗及免疫增强作用这一功能，将SPF鸡随机分成4组，I组为单纯疫苗组；II组为联合免疫组，每组注射0.2mL mChIL-18脂质体；III组为空载体免疫组；IV组为空白对照组，只注射生理盐水。7日龄首免，从体液免疫和细胞免疫水平上分析试验结果。结果表明，mChIL-18脂质体与疫苗联合接种试验鸡所产生的HI抗体在接种14d后一直高于单纯疫苗免疫组，且在接种后第14、21和28天时差异显着（P<0.05）；同时，流氏细胞术检测试验鸡CD4+和CD8+T细胞增殖试验表明，接种mChIL-18脂质体的试验鸡CD4+和CD8+T细胞增殖反应均强于单纯疫苗免疫组。其中，CD4+和CD8+T细胞都呈上升趋势，但一免的7d后呈下降趋势，在二免后又呈上升趋势且持续时间比较长，在各阶段与其它组差异显着（P<0.05）；攻毒试验表明，在免疫后第28天时应用新城疫强毒F48E9攻击，单纯疫苗免疫组的保护率仅为66.7%，而同时注射mChIL-18脂质体组的保护率为86.7%，明显高于单纯疫苗免疫组。因此，IL-18作为免疫增强佐剂有利于提高机体免疫力，提高疫苗的免疫效力，较好地提高机体抵抗力，为以后在生产实践中的应用打下良好的基础。
段永兰,赵丽[10]（2012）在《河南长白猪白细胞介素18基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达》文中进行了进一步梳理为了获取河南长白猪白细胞介素18（IL-18）基因的表达产物,试验从6月龄河南长白猪脾脏分离的淋巴细胞中提取总RNA,然后进行RT-PCR扩增,对扩增产物克隆、测序后获得河南长白猪IL-18基因成熟蛋白序列。利用基因重组技术将河南长白猪IL-18成熟蛋白编码区（500 bp）定向插入原核表达载体pQE30中,构建重组表达质粒pQE-pIL-18,转化大肠杆菌M15,并用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导。结果表明:经序列分析,河南长白猪IL-18基因全长为500 bp;SDS-PAGE分析可检测到分子质量约为45 ku的重组蛋白。
二、重组人白细胞介素-18表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、重组人白细胞介素-18表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达（论文提纲范文）
（1）鸡白细胞介素2和白细胞介素18基因的原核及真核表达（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 菌种和克隆载体 |
| 1.1.2 主要仪器设备 |
| 1.1.3 工具酶和试剂 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 引物合成 |
| 1.2.2 无特定病原(SPF)鸡脾淋巴细胞分离培养及总RNA提取 |
| 1.2.3 ChIL-2和ChIL-18基因克隆与鉴定 |
| 1.2.4 ChIL-2和ChIL-18基因原核表达 |
| 1.2.5 ChIL-2和ChIL-18基因真核表达 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 ChIL-2和ChIL-18基因克隆结果 |
| 2.1.1 ChIL-2和ChIL-18基因PCR扩增结果 |
| 2.1.2 重组质粒pMD19-T-ChIL-2和pMD19-T-ChIL-18酶切鉴定结果 |
| 2.1.3 ChIL-2和ChIL-18基因的测序 |
| 2.2 ChIL-2和ChIL-18蛋白的原核表达情况 |
| 2.2.1 重组原核表达质粒pET32a-ChIL-2和pET28a-ChIL-18鉴定结果 |
| 2.2.2 融合蛋白ChIL-2和ChIL-18的诱导表达情况 |
| 2.3 ChIL-2和ChIL-18基因的真核表达情况 |
| 2.3.1 重组真核表达质粒pVAX1-ChIL-2和pVAX1-ChIL-18鉴定结果 |
| 2.3.2 融合蛋白ChIL-2和pVAX1-ChIL-18在Vero细胞内的表达情况 |
| 3 讨 论 |
| 4 结 论 |
（2）藏獒犬IFN-γ,IFN-α和IL-18基因克隆、表达及产物活性鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 缩略语表 |
| 第一章 犬干扰素研究进展 |
| 1 IFN概述 |
| 1.1 IFN分类 |
| 1.2 犬IFN理化特性及基因组成 |
| 1.3 IFN的空间结构及受体研究 |
| 1.4 IFN生物学活性及作用机制 |
| 2 犬IFN基因工程研究 |
| 2.1 犬Ⅰ型IFN基因工程研究 |
| 2.2 犬Ⅱ型IFN基因工程研究 |
| 2.3 犬Ⅲ型IFN基因工程研究 |
| 2.4 犬长效IFN研究 |
| 3 犬IFN临床应用 |
| 3.1 治疗犬病毒性传染病 |
| 3.2 治疗犬皮肤性疾病 |
| 3.3 治疗眼科及其他疾病 |
| 4 犬IFN应用展望 |
| 第二章 白细胞介素18研究进展 |
| 1 IL-18概述 |
| 1.1 IL-18的发现、结构、特性 |
| 1.2 IL-18受体及信号传导途径 |
| 1.3 IL-18结合蛋白 |
| 2 IL-18生物学作用 |
| 2.1 IL-18抗肿瘤作用 |
| 2.2 IL-18抗感染作用 |
| 2.3 IL-18免疫调节作用 |
| 3 IL-18与临床疾病的关系 |
| 3.1 IL-18与自身免疫性疾病 |
| 3.2 IL-18与心血管系统疾病的关系 |
| 3.3 IL-18与神经系统疾病的关系 |
| 3.4 IL-18与肿瘤疾病的关系 |
| 3.5 IL-18与糖尿病等其他疾病的关系 |
| 4 IL-18应用展望 |
| 5 本研究的目的及意义 |
| 第三章 藏獒犬IFN-γ和 IFN-α基因克隆与序列分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 淋巴细胞的体外刺激活化 |
| 2.2 RT-PCR扩增藏獒犬IFN-γcDNA |
| 2.3 重组质粒的酶切及PCR鉴定 |
| 2.4 藏獒犬IFN-γ序列测定及分析 |
| 2.5 藏獒犬IFN-α序列测定及分析 |
| 3 讨论 |
| 第四章 藏獒犬IFN-γ和 IFN-α基因的表达、纯化及活性鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 藏獒犬pET-30a-IFN-γ和 pET-30a-IFN-α重组表达质粒的鉴定 |
| 2.2 藏獒犬pET-30a-IFN-γ和 pET-30a-IFN-α重组蛋白Western bloting分析 |
| 2.3 藏獒犬pET-30a-IFN-γ和 pET-30a-IFN-α重组蛋白纯化分析 |
| 2.4 藏獒犬IFN-γ抗病毒活性检测 |
| 2.5 藏獒犬IFN-α抗病毒活性检测 |
| 2.6 藏獒犬IFN-α抗病毒临床应用 |
| 3 讨论 |
| 第五章 藏獒犬IL-18基因克隆、表达及生物学活性鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 藏獒犬IL-18基因的克隆 |
| 2.2 藏獒犬IL-18基因序列测定及分析 |
| 2.3 藏獒犬IL-18基因比较分析及进化分析 |
| 2.4 pET-30a-IL-18 重组质粒的鉴定 |
| 2.5 pET-30a-IL-18 重组蛋白表达及Western bloting分析 |
| 2.6 pET-30a-IL-18 重组蛋白纯化结果 |
| 2.7 藏獒犬IL-18基因生物学活性鉴定 |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 攻读博士学位期间发表论文 |
| 导师简介1 |
| 导师简介2 |
（3）猪NLRP6基因表达载体构建及其多克隆抗体的制备（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 模式识别受体 |
| 1.2 炎性小体的研究 |
| 1.3 NLRP6 样受体研究进展 |
| 1.4 本实验研究的目的与意义 |
| 第二章 NLRP6 重组表达载体的构建 |
| 2.1 试验材料与方法 |
| 2.2 氯化钙法制备大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞 |
| 2.3 重组原核表达载体构建 |
| 2.4 重组质粒pET-32a-NLRP6 在大肠杆菌中表达 |
| 2.5 结果与分析 |
| 2.6 讨论 |
| 第三章 NLRP6 重组蛋白诱导表达及其多克隆抗体制备 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.2 重组蛋白诱导表达条件优化及鉴定 |
| 3.3 重组蛋白的可溶性分析及纯化 |
| 3.4 鼠抗NLRP6 多克隆抗体制备 |
| 3.5 结果与分析 |
| 3.6 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）共表达猪繁殖与呼吸综合征病毒膜蛋白GP5（GP5m）、M与猪IL-18重组变异猪伪狂犬病病毒的构建及免疫原性评价（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中英文缩写表 |
| 摘要 |
| 文献综述 |
| 1 猪繁殖与呼吸综合征概述 |
| 1.1 猪繁殖与呼吸综合征病原 |
| 1.2 猪繁殖与呼吸综合征病毒生物学特征 |
| 1.3 PRRSV编码蛋白及其功能研究 |
| 1.4 PRRS疫苗的研究进展及未来的发展趋势 |
| 2 猪伪狂犬病病毒及作为载体的研究进展 |
| 3 黏膜免疫疫苗 |
| 3.1 黏膜免疫系统及黏膜免疫 |
| 3.2 IL-18 作为黏膜免疫佐剂的研究进展 |
| 4 本研究的目的 |
| 实验一 猪白细胞介素18基因的克隆及真核表达重组质粒的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 组织材料 |
| 1.2 试剂与菌种 |
| 1.3 引物设计与合成 |
| 1.4 猪脾脏、肺脏和淋巴结组织样品总RNA的提取 |
| 1.5 猪IL-18 全基因RT-PCR反应 |
| 1.6 猪IL-18 基因的克隆及鉴定 |
| 1.7 猪IL-18 基因真核表达载体的构建与鉴定 |
| 1.8 阳性重组质粒转染 293T细胞 |
| 1.9 RT-PCR检测 293T细胞中IL-18 基因 |
| 1.10 Western-blot检测IL-18 的表达 |
| 2 结果 |
| 2.1 猪IL-18 基因的RT-PCR扩增 |
| 2.2 猪IL-18 基因的克隆与鉴定 |
| 2.3 猪IL-18 基因真核表达质粒p ZJ-18 的构建和鉴定 |
| 2.4 RT-PCR检测 293T细胞中IL-18 基因 |
| 2.5 Western-blot检测IL-18 基因在蛋白水平上的表达 |
| 3 讨论 |
| 实验二、共表达猪繁殖与呼吸综合征病毒膜相关蛋白GP5(GP5m)、M与猪IL-18 重组质粒的构建及免疫原性评价 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 引物设计与合成 |
| 1.3 GP5、M和IL-18 蛋白基因的RT-PCR扩增 |
| 1.4 重组载体PZJ-GP5-2A-M、PZJ-GP5-2A-M-2A-IL-18、PZJ-GP5m、PZJ-GP5m-2A-IL-18 及PZJ-IL-18 的构建 |
| 1.5 重组质粒pTK-GP5m、pTK-GP5m-IL-18、pTK-GP5-M、pTK-GP5-M-IL-18、pTK-IL-18 的构建与鉴定 |
| 1.6 Western-blot检测重组质粒目的基因的表达 |
| 1.7 重组质粒对家兔免疫原性研究 |
| 2 结果 |
| 2.1 目的基因GP5、GP5m、M、IL-18 的扩增 |
| 2.2 重组质粒PZJ-GP5-2A-M-2A-IL-18、PZJ-GP5-2A-M、PZJ-GP5m、PZJ-GP5m-2A-IL-18、PZJ-IL-18 的构建及鉴定 |
| 2.3 重组质粒pTK-GP5m、pTK-GP5m-IL-18、pTK-GP5-M、pTK-GP5-M-IL-18、pTK-IL-18 的构建及鉴定 |
| 2.4 Western-blot检测目的基因GP5、GP5m、M及IL-18 蛋白水平的表达 |
| 2.5 重组质粒免疫原性试验 |
| 3 讨论 |
| 实验三、共表达猪繁殖与呼吸综合征病毒膜蛋白GP5(GP5m)、M与猪IL-18 重组变异猪伪狂犬病病毒的构建及免疫原性试验 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 引物设计 |
| 2 方法 |
| 2.1 rPRV-gE~-/TK~-/GFP~+基因组的提取 |
| 2.2 同源重组质粒基因片段的扩增 |
| 2.3 重组病毒的构建与蚀斑纯化 |
| 2.4 Western-blot鉴定重组病毒GP5、GP5m、M、IL-18 基因蛋白水平表达 |
| 2.5 重组病毒在Vero细胞中的一步生长曲线测定 |
| 2.6 重组病毒对小白鼠免疫原性研究 |
| 2.7 重组病毒免疫小白鼠后血清中和抗体效价测定 |
| 2.8 间接ELISA法检测抗PRRSV IgG和IgA抗体水平 |
| 2.9 小白鼠血液T淋巴细胞转化试验及小白鼠T淋巴细胞细胞因子的检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组病毒的鉴定 |
| 3.2 重组病毒的Western-blot鉴定 |
| 3.3 重组病毒一步生长曲线的测定 |
| 3.4 小白鼠血清中和抗体试验 |
| 3.5 PRRSV间接ELISA IgG和IgA抗体水平检测 |
| 3.6 小白鼠脾脏T淋巴细胞转化试验及小白鼠T淋巴细胞细胞因子的表达检测 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 附:作者读研期间发表文章 |
（5）猪白细胞介素18基因的克隆及真核表达重组质粒的构建（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 样品采集 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 引物设计与合成 |
| 1.4 总RNA提取 |
| 1.5 猪IL-18全基因RT-PCR反应 |
| 1.6 猪IL-18基因的克隆及鉴定 |
| 1.7 猪IL-18基因真核表达载体的构建与鉴定 |
| 1.8 阳性重组质粒转染293T细胞 |
| 1.9 RT-PCR检测293T细胞中IL-18基因的表达 |
| 1.1 0 Western blotting检测IL-18蛋白的表达 |
| 2 结果 |
| 2.1 猪IL-18基因的RT-PCR扩增 |
| 2.2 猪IL-18基因的克隆与鉴定 |
| 2.3 猪IL-18基因真核表达质粒pZJ-IL-18的构建和鉴定 |
| 2.4 RT-PCR检测293T细胞中IL-18基因的表达 |
| 2.5 Western blotting检测IL-18基因在蛋白水平上的表达 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
（6）猪PBD-1基因的扩增、克隆及成熟肽基因的原核表达（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 文献综述 |
| 引言 |
| 试验一 猪β防御素-1全基因扩增、克隆及序列测定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 结论与讨论 |
| 试验二 乳酸杆菌整合型表达质粒pMJ67-SP-PBD1_(His)的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 结论与讨论 |
| 试验三 猪PBD1_(His)基因在干酪乳酸杆菌中的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 结论与讨论 |
| 试验四 猪PBD1基因在大肠杆菌中的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 结论与讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 附件 |
（7）重组大鼠白细胞介素18（rrIL-18）的毕赤酵母表达及其对大鼠肝细胞和肿瘤细胞的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 缩略语表 |
| 1 综述 |
| 1.1 白细胞介素 18(IL-18)的性质与作用 |
| 1.1.1 白细胞介素 18 的结构与理化性质 |
| 1.1.2 白细胞介素 18 的药理作用与应用 |
| 1.1.3 白细胞介素 18 的生物学作用与应用 |
| 1.2 重组白细胞介素 18(rIL-18)的表达 |
| 1.2.1 rIL-18 的原核表达 |
| 1.2.2 rIL-18 的真核表达 |
| 1.2.3 rIL-18 的哺乳动物细胞表达 |
| 1.2.4 rIL-18 的其它系统表达 |
| 1.3 重组大鼠白细胞介素 18(rrIL-18)的毕赤酵母表达 |
| 1.3.1 毕赤酵母受体菌 |
| 1.3.2 毕赤酵母表达载体 |
| 1.3.3 工程质粒的构建 |
| 1.3.4 毕赤酵母的转化 |
| 1.3.5 工程菌的鉴定与筛选 |
| 1.3.6 外源蛋白的表达及修饰 |
| 1.3.7 影响外源基因表达的因素 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要实验材料 |
| 2.1.2 主要试剂盒及试剂 |
| 2.1.3 贮存液和培养基 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 rrIL-18 基因序列的设计 |
| 2.2.2 重组表达质粒的鉴定 |
| 2.2.3 重组质粒的线性化 |
| 2.2.4 毕赤酵母感受态的制备及电转化 |
| 2.2.5 基因组 PCR 法鉴定阳性重组子 |
| 2.2.6 MM 和 MD 平板筛选 Mut+表型 |
| 2.2.7 重组菌的诱导表达及检测 |
| 2.2.8 蛋白浓度的测定 |
| 2.2.9 免疫印迹鉴定 |
| 2.2.10 中试发酵条件优化实验 |
| 2.2.11 分离纯化方法与步骤 |
| 2.2.12 细胞培养 |
| 2.2.13 MTT 检测 |
| 2.2.14 Hochest 33258 染色 |
| 2.2.15 制作大鼠 2/3 肝切除模型 |
| 2.2.16 BrdU 免疫荧光染色 |
| 2.2.17 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 rrIL-18 表达质粒的结构及分子量 |
| 3.2 表达 rrIL-18 的工程菌 |
| 3.3 rrIL-18 工程菌的 3L 罐发酵条件 |
| 3.4 分离纯化 rrIL-18 的纯度和收率 |
| 3.5 rrIL-18 对五种肿瘤细胞活性的影响 |
| 3.6 rrIL-18 对五种肿瘤细胞凋亡的影响 |
| 3.7 rrIL-18 对大鼠肝细胞增殖的影响 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间参加的科研项目及待发表的论文 |
| 致谢 |
（8）重组人白细胞介素-18（rhIL-18）的毕赤酵母表达及其对肿瘤细胞凋亡的诱导作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 1 前言 |
| 1.1 白细胞介素-18(IL-18)的性质与作用 |
| 1.1.1 IL-18 的来源 |
| 1.1.2 IL-18 的结构 |
| 1.1.3 IL-18 的性质 |
| 1.1.4 IL-18 的生物学作用 |
| 1.2 重组白细胞介素-18(rIL-18)的表达 |
| 1.2.1 rIL-18 的原核表达 |
| 1.2.2 rIL-18 的酵母表达 |
| 1.2.3 rIL-18 的其他表达系统 |
| 1.3 重组人白细胞介素-18(rhIL-18)的毕赤酵母表达 |
| 1.3.1 毕赤酵母表达系统的优点 |
| 1.3.2 宿主菌和表达载体 |
| 1.3.3 外源蛋白在必赤酵母中的表达 |
| 1.3.4 毕赤酵母表达系统的优化方式 |
| 1.3.5 毕赤酵母的高密度发酵 |
| 2 实验材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要试剂及培养基配制 |
| 2.1.4 主要实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 rhIL-18 基因序列的设计及合成 |
| 2.2.2 表达质粒 pPIC9K-rhIL-18 的构建及鉴定 |
| 2.2.3 表达质粒 pPIC9K-rhIL-18 的线性化 |
| 2.2.4 GS115 感受态的制备 |
| 2.2.5 电转化 |
| 2.2.6 基因组 PCR 法筛选阳性克隆 |
| 2.2.7 rhIL-18 工程菌的诱导表达、检测及鉴定 |
| 2.2.8 重组酵母菌在 3L 发酵罐中的最佳表达条件试验 |
| 2.2.9 rhIL-18 分离纯化方法 |
| 2.2.10 MTT 法 |
| 2.2.11 Hoechst33258 染色 |
| 2.2.12 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 rhIL-18 表达质粒的结构及分子量 |
| 3.2 表达 rhIL-18 的工程菌 |
| 3.3 rhIL-18 工程菌的 3L 罐发酵条件 |
| 3.4 分离纯化 rhIL-18 的纯度和收率 |
| 3.5 rhIL-18 对 5 种肿瘤细胞活性的影响 |
| 3.6 rhIL-18 对 5 种肿瘤细胞凋亡的影响 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间参加的科研项目及已发表的论文 |
（9）鸡白介素18成熟蛋白的发酵工艺及其对新城疫疫苗免疫增强作用研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 细胞因子的研究进展 |
| 1.2 白细胞介素 18 的研究进展 |
| 1.2.1 IL-18 的发现 |
| 1.2.2 IL-18 的分子结构 |
| 1.2.3 IL-18 的分布及产生 |
| 1.2.4 IL-18 的受体及信号转导机制 |
| 1.3 鸡 IL-18 的研究进展 |
| 1.3.1 鸡 IL-18 的发现 |
| 1.3.2 鸡 IL-18 的研究 |
| 1.3.3 鸡 IL-18 的生物学功能 |
| 1.3.4 鸡 IL-18 在疾病发展过程中的作用 |
| 1.3.5 鸡 IL-18 作为新型免疫佐剂的研究现状 |
| 1.4 毕赤酵母的研究进展 |
| 1.4.1 毕赤酵母表达系统的特性 |
| 1.4.2 毕赤酵母菌株 |
| 1.4.3 毕赤酵母表达载体 |
| 1.4.4 巴斯德毕赤酵母表达系统的转化方式 |
| 1.4.5 外源蛋白在毕赤酵母中的表达机理 |
| 1.4.6 外源蛋白的表达 |
| 1.5 毕赤酵母高密度发酵方式 |
| 1.6 本研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株及实验动物 |
| 2.1.2 所用试剂及耗材 |
| 2.1.3 主要培养基及试剂的配制方法 |
| 2.1.4 主要仪器及设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 重组酵母菌株 GS115/pPIC9K-mChIL-18 的鉴定 |
| 2.2.2 毕赤酵母大规模表达 mChIL-18 条件的优化 |
| 2.2.3 Bradford 法测定表达上清中 mChIL-18 蛋白含量 |
| 2.2.4 mChIL-18 的纯化 |
| 2.2.5 脂质体包被 mChIL-18 |
| 2.2.6 mChIL-18 脂质体对新城疫疫苗免疫增强作用的研究 |
| 2.2.7 细胞免疫检测(流氏细胞术) |
| 2.2.8 血凝血抑试验 |
| 2.2.9 攻毒试验 |
| 2.2.10 数据处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 重组酵母菌株 GS115/pPIC9K-mChIL-18 的鉴定 |
| 3.1.1 PCR 法鉴定重组酵母菌株 |
| 3.1.2 表达产物的 SDS-PAGE 分析 |
| 3.1.3 表达产物的 Western blot 分析 |
| 3.2 毕赤酵母大规模表达 mChIL-18 条件的优化 |
| 3.2.1 发酵液 pH 值对 mChIL-18 发酵产量的影响 |
| 3.2.2 溶解氧对 mChIL-18 发酵表达产量的影响 |
| 3.2.3 培养基成分对 mChIL-18 发酵表达产量的影响 |
| 3.2.4 温度对 mChIL-18 发酵表达产量的影响 |
| 3.2.5 甲醇流加速度对 mChIL-18 发酵表达产量的影响 |
| 3.2.6 消泡剂对 mChIL-18 发酵表达产量的影响 |
| 3.2.7 mChIL-18 大规模发酵时细胞湿重和 OD600 监测结果 |
| 3.3 Bradford 法测定表达上清中 mChIL-18 蛋白含量 |
| 3.4 mChIL-18 的纯化结果 |
| 3.5 脂质体包被 mChIL-18 |
| 3.6 mChIL-18 脂质体对新城疫疫苗的免疫增强作用 |
| 3.6.1 mChIL-18 脂质体促进细胞免疫水平检测 |
| 3.6.2 mChIL-18 脂质体对 HI 抗体的影响 |
| 3.6.3 mChIL-18 攻毒保护试验 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间论文发表情况 |
四、重组人白细胞介素-18表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达（论文参考文献）
- [1]鸡白细胞介素2和白细胞介素18基因的原核及真核表达[J]. 张艳雯,张鹤曦,覃静,周晴云,唐子琼. 西南农业学报, 2020(12)
- [2]藏獒犬IFN-γ,IFN-α和IL-18基因克隆、表达及产物活性鉴定[D]. 宋世斌. 甘肃农业大学, 2020(01)
- [3]猪NLRP6基因表达载体构建及其多克隆抗体的制备[D]. 杨文静. 天津农学院, 2019(08)
- [4]共表达猪繁殖与呼吸综合征病毒膜蛋白GP5（GP5m）、M与猪IL-18重组变异猪伪狂犬病病毒的构建及免疫原性评价[D]. 石昂. 河南农业大学, 2018(05)
- [5]猪白细胞介素18基因的克隆及真核表达重组质粒的构建[J]. 石昂,时庆贺,李新果,王玉国,杨利,李双双,陈陆,王川庆. 中国畜牧兽医, 2017(09)
- [6]猪PBD-1基因的扩增、克隆及成熟肽基因的原核表达[D]. 杨兴武. 河南农业大学, 2017(01)
- [7]重组大鼠白细胞介素18（rrIL-18）的毕赤酵母表达及其对大鼠肝细胞和肿瘤细胞的作用研究[D]. 孙冬冬. 河南师范大学, 2013(S2)
- [8]重组人白细胞介素-18（rhIL-18）的毕赤酵母表达及其对肿瘤细胞凋亡的诱导作用研究[D]. 段莉姣. 河南师范大学, 2013(S2)
- [9]鸡白介素18成熟蛋白的发酵工艺及其对新城疫疫苗免疫增强作用研究[D]. 张海滨. 山东农业大学, 2012(02)
- [10]河南长白猪白细胞介素18基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达[J]. 段永兰,赵丽. 黑龙江畜牧兽医, 2012(09)