一、结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因疫苗的免疫效果观察（论文文献综述）
谭大权[1]（2021）在《结核分枝杆菌融合蛋白LT33的制备及免疫原性研究》文中指出结核病（Tuberculosis,TB）是一种主要由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,M.tuberculosis）感染引起的传染性疾病。预防和控制结核分枝杆菌感染的最佳方式是接种有效的疫苗。卡介苗（Bacille Calmette-Guerin,BCG）虽然能有效保护儿童免于结核分枝杆菌感染,但是随着年龄的增加,其保护效果不断下降。因此,为了控制结核病,我们需要应用当前的研究技术开发更有效的结核疫苗。本实验室前期制备了包括EAMM(ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4)、LT69(ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-Hsp X)和LT70(ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-Rv2626c)等包含结核分枝杆菌不同阶段抗原的融合蛋白,并与DP佐剂联合制成了蛋白亚单位疫苗。攻毒实验结果显示,接种这些疫苗的小鼠相比于接种BCG的小鼠,体内细菌载量明显更低。这提示将结核分枝杆菌不同阶段抗原组合成融合蛋白可能是一种开发有效结核疫苗的方式。抗原ESAT6和CFP10主要存在于致病性结核分枝杆菌中,是由BCG缺失区（region of deletion,RD）基因编码的早期分泌蛋白质。抗原Rv1738则是本实验室前期筛选中,保护效果较好的一种潜伏期抗原。目的:本研究以p ET30a（+）质粒作为表达载体,拟构建包含ESAT6、CFP10及Rv1738抗原的无标签融合蛋白ESAT6-CFP10-Rv1738（简称LT33）。制备纯度大于95%的融合蛋白LT33,并在小鼠模型中评价融合蛋白LT33与DDA-Poly I:C（简称DP）佐剂联合后诱导小鼠细胞免疫和体液免疫应答的能力。方法:1.融合蛋白LT33的构建和表达。通过PCR从p ET30a（+）-ESAT6-CFP10重组质粒中扩增表达ESAT6-CFP10融合蛋白的基因,并将其插入到含克隆位点的p ET30a（+）-CFP10-Rv1738质粒中,替换表达CFP10抗原的基因,构建p ET30a（+）-ESAT6-CFP10-Rv1738重组质粒,将重组质粒转化入大肠埃希菌BL21（DE3）中表达融合蛋白LT33。无标签融合蛋白LT33分别通过硫酸铵沉淀、离子交换层析、疏水层析和凝胶过滤层析等方式进行纯化。2.LT33/DP亚单位疫苗的免疫原性检测。将融合蛋白LT33和DP佐剂混合制成亚单位疫苗。将6-8周龄的SPF级雌性C57BL/6小鼠随机分为PBS组、BCG组、LT33蛋白组和LT33/DP组,每组10只。在第0、2、4周分别进行免疫接种,其中PBS组仅在第0周注射200μL PBS,BCG组仅在第0周免疫接种200μL BCG（约5×106CFU）,LT33蛋白组和LT33/DP组在第0、2、4周分别免疫接种200μL LT33蛋白和LT33/DP（各含10μg融合蛋白LT33）。在末次免疫6周后检测疫苗的免疫原性,通过间接ELISA法检测小鼠血清中ESAT6、CFP10和Rv1738抗原特异性Ig G、Ig G1和Ig G2c抗体滴度。无菌分离的小鼠脾脏淋巴细胞,在分别经ESAT6、CFP10和Rv1738抗原在体外刺激后,通过流式细胞术检测抗原特异性IFN-γ和IL-2的表达水平。3.单克隆抗体的制备。将融合蛋白LT33与DP佐剂联合使用,免疫BALB/c小鼠三次,腹腔加强注射纯蛋白一次。末次免疫3天后,分离小鼠脾脏淋巴细胞,并将其与SP2/0细胞通过PEG3350进行融合。经间接ELISA筛选分泌ESAT6、CFP10和Rv1738抗原特异性单克隆抗体的细胞株。结果:1.融合蛋白LT33的构建和表达。通过分子克隆技术最终成功构建了p ET30a（+）-ESAT6-CFP10-Rv1738重组质粒。融合蛋白LT33在大肠埃希菌BL21（DE3）中主要以可溶性蛋白的形式表达,分子量为32453.5Da。蛋白上清经硫酸铵沉淀初步纯化后,融合蛋白LT33依然保持了良好的可溶性,并且能去除大部分的杂蛋白。再依次使用Hi Trap Q HP离子交换层析柱和Hi Load 16/600Superdex 75 pg凝胶过滤层析柱进行精细纯化。最终,得到了纯度大于95%的融合蛋白LT33。2.LT33/DP亚单位疫苗的免疫原性检测。亚单位疫苗LT33/DP免疫C57BL/6小鼠3次后,与BCG组和纯LT33蛋白组相比,LT33/DP组小鼠血清中ESAT6、CFP10和Rv1738抗原特异性Ig G、Ig G1和Ig G2c抗体滴度明显更高（P<0.05）。在ESAT6、CFP10和Rv1738抗原刺激后,LT33/DP组小鼠脾脏CD4+IFN-γ+T细胞、CD4+IL-2+T细胞以及CD8+IFN-γ+T细胞的比例也明显高于BCG组和LT33蛋白组（P<0.05）。3.单克隆抗体的制备。亚单位疫苗LT33/DP免疫BALB/c小鼠3次后,通过杂交瘤技术获得了4株稳定分泌单克隆抗体的细胞株。其中1H3可以特异性识别ESAT6抗原,3C9和4C10能识别Rv1738抗原,4A5则能识别CFP10抗原。在体外大量培养杂交瘤细胞后,通过Protein A层析柱从培养上清中分离出了纯度较高的单克隆抗体。结论:融合蛋白LT33在BL21（DE3）中主要以可溶性表达为主。依次通过硫酸铵沉淀,离子交换层析和凝胶过滤层析制备了纯度高于95%的融合蛋白LT33。LT33联合DP佐剂接种C57BL/6小鼠后,可同时对ESAT6、CFP10和Rv1738抗原产生抗原特异性细胞免疫和体液免疫,具有较好的免疫原性。在BALB/c小鼠接种LT33/DP后,通过将小鼠脾脏淋巴细胞与SP2/0细胞融合,成功筛选获得了表达ESAT6、CFP10和Rv1738抗原特异性抗体的杂交瘤细胞株。
张真[2]（2020）在《结核分枝杆菌新型疫苗的制备及其免疫效果研究》文中研究表明第一部分:结核分枝杆菌Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6融合基因DNA疫苗株的构建及免疫原性研究目的构建结核分枝杆菌Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6 DNA疫苗,并对其在体外真核细胞及C57BL/6小鼠中表达,初步探究这两种DNA疫苗的免疫原性。方法从Gen Bank中获取M.tuberculosis H37Rv的Ag85B、ESAT6和Hsp65基因序列送生工合成。然后经PCR、酶切、连接与真核表达载体PVAX1重组,测序鉴定正确后应用TIANGEN试剂盒大量纯化无内毒素的质粒DNA。体外转染验证其表达后,免疫C57BL/6小鼠,检测特异性细胞免疫应答,流式检测升高细胞因子所属细胞亚型。结果Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6 DNA疫苗在体内外均能表达。体外Western Blot检测显示,DNA疫苗体外转染293T细胞24h可以检测到蛋白Hsp65、Ag85B、ESAT6的表达,48h时细胞内蛋白表达量达最高。C57BL/6小鼠中Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6 DNA疫苗激起了很好的免疫反应,可诱导机体产生分泌高水平TNF-α的Th型免疫应答。结论Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6DNA疫苗都具有较强的免疫原性,呈Th型细胞介导的免疫应答;Hsp65-Ag85B DNA疫苗的保护效力比Hsp65-ESAT6 DNA疫苗强,有待进一步研究其应用价值。第二部分:卡介苗ure C基因缺失株的构建及筛选目的在MTB中ure C产生的氮被认为是碱化MTB生存微环境的重要来源,不仅可以预防吞噬体的酸化,还可阻止吞噬体和溶酶体的融合,进一步逃脱免疫监视和免疫反应。运用Cre/Lox P同源重组方法对卡介苗进行遗传操作,缺失卡介苗中氮源基因ure C,打破MTB在体内原有适宜生存的微环境,促进吞噬-溶酶体成熟,筛选并获得卡介苗ure C基因缺失株,为后续在此缺失株添加有效的MTB免疫抗原提供基础。方法采用Cre/Lox P同源重组的方法,将含有重组酶的p SL002质粒电转至卡介苗中,涂板,长出单菌落后以此菌落做感受态。利用speⅠ和NsiⅠ双酶切本实验室前期构建的含有ure C基因左右同源臂及gfp荧光蛋白的重组质粒p SL001,获得目的片段,并将其电转至上述含有p SL002质粒的卡介苗,涂板后挑取单克隆,通过菌液PCR进行鉴定、筛选出卡介苗中双交换目的片段并缺失ure C基因的菌株,从而获得卡介苗ure C基因缺失株。结果电转至含有p SL002质粒卡介苗的目的片段,因为存在gfp蛋白,在蓝光手电筒下发绿色荧光,包括单交换与双交换两种,对发绿色荧光单菌落进行菌液PCR,琼脂糖凝胶鉴定,单交换菌落在1734bp处出现条带,双交换菌落因片段过大在3498bp处隐约有条带或不出现条带。挑取双交换菌落涂板传代,成功筛选出了卡介苗ure C基因缺失株,形态正确,并能够稳定传代。结论利用Cre/Lox P同源重组方法在卡介苗中进行遗传操作,能够对卡介苗的基因进行无缝敲除,并且获得的突变株能够稳定传代。研究表明,在此过程中采用Cre/Lox P同源重组系统可大大提高了MTB的重组效率并缩短了重组时间,为重组卡介苗的研究提供了便利。
包艳红[3]（2019）在《牛分枝杆菌cfp10-esat6-cfp7融合基因重组乳酸菌的构建及免疫原性研究》文中研究说明牛结核病是由牛分枝杆菌引起的广泛存在于人类与牲畜间的疾病。该病的宿主范围比较广,可感染大多数温血脊椎动物,人可通过接触患病动物及食用污染的牛奶制品等多种途径感染结核病,所以,牛结核病的传播严重影响人和动物的健康,每年都造成巨大的经济损失。目前,结核病主要以预防为主,卡介苗是唯一可用的预防性疫苗,但对成人其免疫效果不确定,对牛又影响常规检疫,所以,研发出有效的疫苗势在必行。细菌分泌的抗原由于具有激活免疫反应的能力而被重视,CFP-10、ESAT-6和CFP-7是牛结核分枝杆菌早期分泌蛋白,免疫蛋白ESAT-6和CFP-10的编码区仅存在于结核分枝杆菌基因组的RD-1区,而在BCG菌株中不存在。因此,将CFP-10、ESAT-6和CFP-7蛋白基因融合,以期能够产生更为有效的免疫效果,这对于研发牛结核病新型疫苗有着重要意义。乳酸乳球菌NZ3900作为天然的递呈外源抗原的载体,是食品级的安全微生物,且筛选时无添加抗生素,已广泛用于生物制药、疫苗研发等领域。因此,本试验以pNZ8149为载体,在NZ3900乳酸菌中表达牛分枝杆菌融合基因cfp10-esat6-cfp7,并对构建的重组乳酸菌在小鼠模型中进行免疫原性分析,为研制牛结核病新型疫苗奠定基础。本研究以pUC-cfp10-esat6-cfp7质粒作为模板,对目的融合基因cfp10-esat6-cfp7进行PCR扩增,然后与pMD18-T Simple Vector进行连接,构建重组克隆质粒pMD18-T（S）-cfp10-esat6-cfp7。利用Kpn I和Nco I限制性内切酶对pMD18-T（S）-cfp10-esat6-cfp7和pNZ8149进行双酶切,并切胶回收纯化。将纯化融合基因cfp10-esat-6-cfp7和表达载体pNZ8149进行连接,构建pNZ8149-cfp10-esat6-cfp7重组表达质粒。将重组菌电转入宿主菌NZ3900中,构建pNZ8149-cfp10-esat6-cfp7/NZ3900,从而获得携带目的基因cfp10-esat6-cfp7的重组乳酸菌。经过Nisin诱导,SDS-PAGE及间接免疫荧光鉴定实验,成功表达鉴定融合基因cfp10-esat6-cfp7的表达。之后,利用pNZ8149-cfp10-esat6-cfp7/NZ3900重组乳酸菌免疫小鼠,利用流式细胞技术检测免疫小鼠脾细胞中T细胞亚群和产生IL-2、IFN-γ和TNF-α等细胞因子的淋巴细胞比例,以及利用间接酶联免疫吸附实验（ELISA）检测免疫小鼠血清中IgG水平。本研究成功地扩增了牛分枝杆菌融合基因cfp10-esat6-cfp7,与pMD18-T Simple Vector连接,成功地构建了克隆质粒pMD18-T-cfp10-esat6-cfp7。纯化的融合基因cfp10-esat-6-cfp7和表达载体pNZ8149连接,成功地构建了重组乳酸菌pNZ8149-cfp10-esat6-cfp7/NZ3900。重组乳酸菌pNZ8149-cfp10-esat6-cfp7/NZ3900经过Nisin诱导,并利用SDS-PAGE及间接免疫荧光试验,证明融合基因cfp10-esat6-cfp7在NZ3900中表达了33 kDa的外源蛋白。免疫小鼠后,流式检测结果显示,重组乳酸菌pNZ8149-cfp10-esat6-cfp7/NZ3900免疫组脾细胞中CD4+T细胞的比例较pNZ8149/NZ3900组、PBS组和BCG组均略高,但无统计学差异（P>0.05）;CD8+T细胞的比例较pNZ8149/NZ3900组略高,较PBS组和BCG组明显增高,但未能达到差异显着性水平（P>0.05）;产生IL-2的细胞比例较pNZ8149/NZ3900组略高,较PBS组和BCG组明显增高,但差异仍不显着（P>0.05）;产生IFN-γ的细胞比例较PBS组和pNZ8149/NZ3900组略高,但远不及BCG组,差异显着（P<0.05）;产生TNF-α的细胞比例与BCG组、pNZ8149/NZ3900组基本一致,没有差异（P>0.05）。利用酶联免疫吸附实验检测得到重组乳酸菌pNZ8149-cfp10-esat6-cfp7/NZ3900组小鼠血清中的IgG抗体水平略高于PBS组和pNZ8149组,低于BCG组,且差异均不显着（p>0.05）。可见,重组乳酸菌pNZ8149-cfp10-esat6-cfp7/NZ3900仅能诱导小鼠体内产生一定水平的细胞免疫,为牛结核病新型疫苗的研制提供了依据。
李晓倩[4]（2017）在《抗耐药结核多效基因工程疫苗的构建及免疫效果分析》文中认为目的:构建抗耐药结核重组质粒DNA疫苗p IEMKMAGP,并初步评价其免疫效果,为临床耐药结核病的治疗提供新的选择。方法:（1）利用DNA重组技术,将结核分枝杆菌表面抗原MPT64、Ag85B基因编码区和野生型kat G基因编码区,以及穿孔素PRF1、颗粒溶素GNLY基因编码区插入到真核表达载体p IRES2-EGFP中,构建抗结核多基因真核串联表达载体p IEMKMAGP（MPT64-Ag85B/kat G/GNLY-PRF1）;（2）利用电转化的方法,将质粒p IEMKMAGP转化耻垢分枝杆菌制备重组耻垢分枝杆菌菌苗;（3）利用脂质体转染技术,将质粒p IEMKMAGP转染293T细胞,应用荧光定量PCR技术检测目的基因表达水平,应用Western blot技术检测目的蛋白表达情况;（4）质粒p IEMKMAGP免疫接种C57BL/6小鼠和SD大鼠,ELISA试剂盒检测IL-12和IFN-γ细胞因子表达水平。结果:（1）成功构建了抗耐药结核多效基因工程DNA疫苗p IEMKMAGP（MPT64-Ag85B/kat G/GNLY-PRF1）;（2）成功制备重组耻垢分枝杆菌菌苗;（3）目的基因MPT64/Ag85B、kat G、GNLY/PRF1在293T细胞中成功表达,融合蛋白MPT64/Ag85B、融合蛋白GNLY/PRF1成功表达,且融合蛋白MPT64/Ag85B可分泌表达;（4）目的基因MPT64/Ag85B、kat G、GNLY/PRF1在C57BL/6小鼠组织器官m RNA水平上有一定表达,但蛋白水平上未检测到目的蛋白的表达;（5）质粒p IEMKMAGP免疫接种SD大鼠中外周血血清中的IL-12和IFN-γ细胞因子表达水平明显升高。结论:（1）抗耐药结核真核表达质粒p IEMKMAGP（MPT64-Ag85B/kat G/GNLY-PRF1）作为DNA疫苗能够在细胞水平上有效表达,有望为进一步开发新型的抗结核疫苗提供了实验依据。（2）本研究构建的抗耐药结核DNA疫苗p IEMKMAGP（MPT64-Ag85B/kat G/GNLY-PRF1）可以引起IL-12和IFN-γ细胞因子水平的升高。
李晓倩,曹广如,王英全,王苗,敖骏,蔡玉强,岳昌武[5]（2016）在《抗结核MPT64-Ag85B/katG/GNLY-PRF1重组质粒DNA疫苗的构建与表达》文中研究说明目的构建抗结核MPT64-Ag85B/katG/GNLY-PRF1重组质粒DNA疫苗。方法利用DNA重组技术,将激活细胞免疫和体液免疫的MPT64/Ag85B优势抗原基因和野生型katG基因编码区以及穿孔素/颗粒溶素整合进串联真核表达载体pIRES2-EGFP中,构建抗结核重组质粒MPT64-Ag85B/katG/GNLY-PRF1;电转化方法将质粒重组耻垢分枝杆菌制备菌苗;通过脂质体Lipofectamine 2000介导将重组质粒转染293T细胞。应用qRT-PCR技术在mRNA水平检测靶基因体外表达效果并用Western blot方法检测转染细胞是否表达目的蛋白。结果 PCR证实重组质粒MPT64-Ag85B/katG/GNLYPRF1构建成功并制备重组耻垢分枝杆菌菌苗;qRT-PCR分析表明重组质粒的靶基因MPT64/Ag85B、katG、GNLY/PRFl基因转染293T细胞后均有表达,免疫印迹分析重组质粒的融合蛋白MPT64/Ag85B在相对分子质量72 kDa处有明显蛋白表达条带,且融合蛋白MPT64/Ag85B可分泌表达;融合蛋白GNLY/PRF在相对分子质量75 kDa处有明显蛋白表达条带。结论成功构建抗结核MPT64-Ag85B/katG/GNLY-PRF1重组质粒DNA疫苗,为进一步研究该疫苗的免疫作用提供依据。
牛红霞[6]（2015）在《结核分枝杆菌亚单位疫苗LT69的研究和抗持留菌药物的筛选》文中研究说明研究背景结核病（tuberculosis）是一种严重危害全球的重大传染性疾病,主要由结核分枝杆菌（Mycobacteria tuberculosis）感染引起。结核病的病死率在传染性疾病中居于第二位,仅次于人免疫缺陷病毒感染（human immunodeficiency virus,HIV）的致死率。我国是结核病高发国家之一,其发病率和死亡率长期据我国甲、乙类传染病前列,占全球总结核病病例数的11%。结核病难于控制的主要原因是缺乏有效的结核病疫苗。另外,结核分枝杆菌可以在人体巨噬细胞内以潜伏状态存在,借此逃避机体免疫系统和药物对其的杀伤作用。卡介苗（Bacille Calmette-Guerin,BCG）是目前临床应用广泛的预防结核病的疫苗,但是接种BCG预防结核病的保护效应不确定。BCG接种可以预防儿童患严重的粟粒性结核及脑膜炎结核,但是BCG的保护性免疫反应随着年龄的增加逐渐减弱,对成人肺结核缺乏有效的免疫保护。目前,处于研究阶段的新型结核分枝杆菌疫苗包括活菌疫苗和亚单位疫苗。人们普遍的观点认为,亚单位疫苗可以用于加强BCG免疫所引起的免疫应答,进而延长并维持BCG的保护效果。我们前期共构建并评价了 6个融合蛋白亚单位疫苗ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4（EAMM）,Mtb10.4-HspX（MH）,ESAT6-Mtb8.4,Mtb10.4-Ag85B,ESAT6-Ag85B和ESAT6-RpfE,发现EAMM保护效果最好。此外,EAMM（仅由结核分枝杆菌复制期抗原组成）和MH（由结核分枝杆菌复制期和潜伏期抗原组成）联合应用时,其保护效果比单独应用时更好。研究目的为了建立对不同生长状态结核分枝杆菌的免疫力,本研究选择具有免疫优势的结核分枝杆菌复制期抗原和休眠期抗原,构建融合了结核分枝杆菌多阶段抗原的亚单位疫苗。此外,探索抗原剂量和免疫调节剂雷帕霉素对亚单位疫苗所诱导的免疫记忆的作用,以研究影响亚单位疫苗长期保护效率的因素。研究方法在本研究中,我们结合结核分枝杆菌复制期抗原ESAT6,Ag85B,MPT64,Mtb8.4 和潜伏期抗原 HspX,构建融合蛋白 ESAT6-Ag85B-MPT64（190-198）-Mtb8.4-HspX（EAMMH）,因分子量为69kD,简称为LT69。融合蛋白构建成功之后,我们用大肠埃希菌BL21对其进行表达,并利用盐析和层析技术相结合的方法将其分离纯化。融合蛋白LT69和佐剂阳离子脂质体二甲基三十六烷基钱（dimo-thylidioctyl ammonium bromide,DDA）和聚肌胞苷酸（polyinosinic-polycytidyli cacid,PolyI:C）混合,构建结核亚单位疫苗。然后,我们将LT69疫苗免疫小鼠,检测该疫苗在小鼠体内诱导的抗原特异性的细胞免疫和体液免疫应答;疫苗末次免疫30周后,将疫苗免疫的小鼠用结核分枝杆菌H37Rv株经呼吸道感染,评价该疫苗在小鼠体内抗结核的保护效果。此外,将不同剂量（50μg、10 μg和2μg）的LT69疫苗免疫小鼠,检测不同剂量的疫苗所诱导的免疫记忆的差异,并评价不同剂量疫苗免疫所产生的长期保护效果。同时,我们将LT69疫苗和雷帕霉素联合免疫小鼠,评价雷帕霉素对LT69疫苗所诱导的记忆性T细胞的影响,及其对疫苗长期保护效果的影响。研究结果成功构建了融合蛋白LT69。LT69在大肠埃希菌BL21中高效表达,应用硫酸铵盐析和层析相结合的方法成功将其分离纯化。LT69疫苗在小鼠体内诱导产生高水平的抗原特异性IFN-,γ、IL-2和抗体IgG1、IgG2c。结核分枝杆菌H37Rv（50-100 CFU）经呼吸道气雾攻击小鼠后,LT69疫苗（10μg）免疫组小鼠肺脏的结核菌载量（5.85±0.39 Log10 CFU）和BCG免疫组（6.01 ±0.33 Log10 CFU）相当,低剂量LT69免疫组小鼠肺脏的结核菌载量（5.38±0.35 Log10 CFU）低于BCG组。抗原剂量研究表明,低剂量LT69（2μg）疫苗接种小鼠产生的IFN-y的分泌水平在疫苗末次免疫6周和高剂量组没有明显差异,但在疫苗末次免疫24周要明显高于高剂量（10μg和50μg）组,说明低剂量疫苗诱导了较长期的细胞免疫记忆。在疫苗末次免疫30周后进行的攻毒试验表明,低剂量LT69免疫组小鼠肺脏的结核菌载量低于高剂量组和BCG组,和免疫检测结果一致。雷帕霉素和疫苗LT69联合免疫,24周后进行体外脾脏淋巴细胞功能检测。特异性抗原刺激后,雷帕霉素联合免疫小鼠脾细胞所产生的IFN-γ分泌水平明显高于疫苗单独免疫组。经尾静脉用5 106CFU的BCG攻击小鼠,雷帕霉素联合免疫小鼠体内的细菌载量低于疫苗单独免疫组0.8-log10 CFU。结论结核分枝杆菌亚单位疫苗LT69同时融合了结核分枝杆菌复制期抗原和休眠期抗原,免疫机体后可以清除不同代谢状态的结核分枝杆菌。LT69在小鼠体内具有较强的免疫原性,其保护效果达到和BCG相当的水平。低剂量的疫苗比高剂量的疫苗诱导产生更长久的免疫记忆,长期保护效果也更强。雷帕霉素处理可以促进LT69疫苗诱导产生更多长期记忆性T细胞,从而提高疫苗的长期保护效果。研究背景持留菌（persister）是在效果非常强的抗生素（lethal antibiotics）或者压力（stresses）的作用下能够继续存活的一小群静止期的细菌,这群细菌在适当的条件下可以继续增殖。持留菌的存在造成感染患者体内细菌的潜伏和治疗后的反复发作,使细菌感染性疾病的治愈面临挑战。目前所使用的抗生素中,除了治疗结核病的药物吡嗪酰胺（PZA）具有一定的抗持留菌的作用外,其他大部分的药物只针对复制期代谢比较活跃的细菌起作用。探索针对持留菌有效的药物,是治疗细菌感染性疾病的有效措施和手段。目前所使用的抗生素对持留菌没有治疗效果的主要原因是,在筛选抗菌的药物时人们通常使用的是代谢活跃的复制期的细菌,而没有考虑用持留菌模型进行药物筛选。研究目的本研究试图建立包括金黄色葡萄球菌（Staphylococcusawrews,S.awreius）、大肠埃希菌（Escherichia co/i,E.coli）和结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,M/wberculosis）在内的持留菌体外模型,从一些临床应用的化合物中筛选抗细菌持留菌的有效药物,为临床细菌持续感染性疾病的治疗提供一些新的指导。研究方法在持留菌的研究领域,人们常用抗生素处理稳定期细菌6-8小时来建立持留菌模型。在本研究中,我们用抗生素ofloxacin或者酸性和饥饿的压力条件处理细菌,在抗生素或者压力条件下生存下来的细菌即为持留菌。我们建立了金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和结核分枝杆菌持留菌模型,然后从FDA批准的化合物库中筛选针对这些持留菌的药物。最后,将筛选出来的有一定效果的药物在体外进行效果验证,并进一步在动物体内进行药物效果的评价。研究结果我们发现tosufloxacin对金黄色葡萄球菌持留菌具有很好的杀菌作用;tosufloxacin和colistin对大肠埃希菌持留菌具有很好的作用效果;蓖麻油酸钾（potassium ricinoleate）、喹哪啶（quinaldine）、四环素（tetracycline）、硝苯地平（nifedipin）、苏合香脂（storax）和阿西美辛（acemetacin）在和PZA联合应用时,可以明显提高PZA对结核分枝杆菌持留菌的杀菌作用。结论在本研究中我们成功建立了持留菌体外模型,并初步筛选到一些用于治疗持留菌的药物。所筛选的药物有望用于临床细菌感染性疾病的治疗,从而提高该类疾病的治疗效果、缩短治疗疗程和避免疾病的复发。
王平[7]（2014）在《表达Ag85B-ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌对结核分枝杆菌感染小鼠免疫治疗效果评价》文中研究表明结核病（tuberculosis，TB）是由分枝杆菌属中的结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）感染引起的慢性传染性疾病，主要通过气溶胶形式在人群中传播。自上世纪九十年代以来，MTB耐药菌株的出现和增加、TB合并人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染患者的增多、人口流动性增加，特别是目前唯一可用于预防TB的疫苗——卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin vaccine，BCG）对成人的保护效果欠佳等原因，使得TB疫情不能得到有效控制。因此，研制新的预防性或兼具治疗性的TB疫苗，是TB防治研究中的重要内容。目前TB的传播难以得到有效控制的主要原因有：1)MTB感染机体后，MTB特殊的脂质表面结构导致其可在巨噬细胞内长期存活，以持留菌的形式或潜伏状态存在，而感染者并不出现临床症状或症状轻微，这些潜伏感染者的发病是新增TB病例的主要来源；2)耐药菌株增加，尤其是多重耐药性MTB的出现和流行，使得原用于TB治疗的化学药物对耐药菌的作用甚微。因此，针对MTB耐药性以及持续性感染状态，研发新的TB预防和治疗制剂及药物、探索新的治疗措施和途径具有重要意义。分枝杆菌属中的耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis，MS）是一种能够快速生长的、非致病性的分枝杆菌，能够高效表达外源性基因，是TB新型疫苗研究的理想候选载体。抗原85B（Ag85B）和6kDa早期分泌靶抗原（6kDa early secretedantigen target，ESAT-6）均为MTB感染早期分泌表达的免疫优势抗原，以其为靶抗原单独或融合后构建的基因疫苗、亚单位疫苗和重组BCG等均能有效刺激机体产生特异性的抗MTB免疫应答。此外，国内外研究表明，MTB热休克蛋白65（heat shockprotein65，Hsp65）及辅助性T细胞1型（Th1）细胞因子——白细胞介素2（Interleukin-2，IL-2）也均能有效刺激机体产生对MTB的免疫应答。【研究目的】以MS为表达载体，构建能够分泌表达Ag85B-ESAT-6融合蛋白的重组MS（rMS），观察rMS诱导小鼠特异性免疫应答尤其是细胞免疫应答的能力；评价其作为治疗性疫苗单独或与抗TB化学药物联合应用对MTB耐药株感染小鼠及MTB标准株低剂量感染小鼠的免疫治疗效果。【实验方法和研究结果】1.重组耻垢分枝杆菌（Ag85B-ESAT-6-rMS）的构建及鉴定以MTB H37Rv株（标准株）基因组DNA为模版，多聚酶链式反应（PolymeraseChain Reaction，PCR）扩增ag85B基因片段和携带疏水性氨基酸残基基因连接片段（linker）的esat-6基因片段。经T4连接酶连接后，PCR扩增获得融合基因ag85B-linker-esat-6。将融合基因克隆入pMD18-T载体后，再将其亚克隆至大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭分泌表达载体pDE22中，进行酶切鉴定和序列测定。结果显示，可切出预期大小片段，测序分析表明ag85B和esat-6基因与GenBank公布的序列完全一致，将其命名为pDE22-ag85B-esat-6。将pDE22-ag85b-esat-6电穿孔转化MS感受态细菌，提取质粒后采用酶切法进行基因型鉴定，结果证明切出的目的基因片段大小与预期一致。将基因型鉴定正确的rMS菌株经42℃热诱导表达后，SDS-PAGE分析并采用抗Ag85B的多克隆抗体和抗ESAT-6的单克隆抗体对表达产物进行Western blot鉴定。结果表明rMS菌可分泌表达Ag85B-ESAT-6融合蛋白，证明rMS构建成功，将其命名为Ag85B-ESAT-6-rMS。2. Ag85B-ESAT-6-rMS诱导小鼠的免疫应答方法：取68周龄雌性BALB/c小鼠75只，随机分成5组（每组15只），即Ag85B-ESAT-6-rMS组、BCG组、MS组、纯化的Ag85B-ESAT-6融合蛋白（AE）组及生理盐水对照组。rMS组和MS组分别经背部皮下注射相应细菌1×107CFU/只，间隔2周，共免疫3次；BCG组经背部皮下注射BCG1×107CFU/只，仅免疫1次；AE组经腹股沟皮下包埋含20μg AE的硝酸纤维素膜，间隔3周，共免疫2次。初次免疫后第1周起，每周采集各组小鼠尾静脉血（共采集6周），无菌分离外周血单核细胞（PBMC），分析CD4+T细胞和CD8+T细胞的百分比；初次免疫后第6周，乙醚麻醉后处死小鼠，无菌法取各组小鼠脾脏，分离脾淋巴细胞，分别检测其特异性增殖指数（SI）、CTL杀伤活性，以及分泌IFN-γ、IL-2和IL-4的淋巴细胞频数。结果：①Ag85B-ESAT-6-rMS免疫组小鼠的PBMC中CD4+T细胞与CD8+T细胞所占百分比之和均高于其他各组（P<0.05）；②Ag85B-ESAT-6-rMS免疫组小鼠的脾淋巴细胞SI高于生理盐水组、AE免疫组和MS免疫组（P<0.05），而与BCG免疫组相比无显着差异（P>0.05）；③Ag85B-ESAT-6-rMS免疫组小鼠的脾淋巴细胞CTL杀伤效率高于生理盐水组和MS组（P<0.05），与AE免疫组和BCG免疫组比无显着差异（P>0.05）；④Ag85B-ESAT-6-rMS免疫组小鼠的脾淋巴细胞分泌IFN-γ和IL-2的细胞频数分别高于其他各组（P<0.05），分泌IL-4的细胞频数与BCG免疫组和MS免疫组相比无显着差异（P>0.05）。以上结果表明，Ag85B-ESAT-6-rMS可诱导小鼠强烈的免疫应答，并以Th1型细胞免疫应答为主。3. Ag85B-ESAT-6-rMS对MTB耐利福平株感染小鼠模型的免疫治疗方法：①取MTB耐利福平（Rifampin，RFP）株经尾静脉注射感染68周龄的雌性BALB/c小鼠（1×106CFU/只），感染后第4周，无菌分离小鼠脾脏和肺脏，制作组织切片，进行HE染色观察和抗酸染色检查，平板计数法分别检测两脏器的荷菌数（CFU）。②与上述同样方法用MTB耐RFP株感染小鼠，并将感染小鼠随机分为8组（15只/组），即异烟肼（Isoniazid，INH）治疗组、RFP治疗组、Ag85B-ESAT-6-rMS治疗组、 Hsp65-IL-2-rMS治疗组、 INH+Ag85B-ESAT-6-rMS联合治疗组、INH+Hsp65-IL-2-rMS联合治疗组、 MS治疗组、生理盐水对照组。其中Ag85B-ESAT-6-rMS组、Hsp65-IL-2-rMS组和MS组分别在感染后6周和10周经小鼠背部皮下注射1×107CFU的rMS或MS；联合治疗组在感染后第6周开始用INH给小鼠灌胃治疗，持续4周，第10周时再经小鼠背部皮下分别注射1×107CFU的两种rMS；RFP组和INH组自感染后第6周开始灌胃治疗，持续8周。③观察并记录各组小鼠活动及体重变化情况；在治疗后第4周和第8周，分别无菌分离小鼠脾脏和肺脏，同上进行抗酸染色检查、HE染色观察，并进行荷菌数检测。④治疗后统计各组小鼠存活率。结果：①感染小鼠模型肺和脾中均可见抗酸杆菌（+++），HE染色可见慢性肉芽肿性炎的表现，肺和脾荷菌数分别达105和104CFU，表明MTB耐RFP株感染小鼠模型建立成功；②生理盐水组、RFP组和MS组的小鼠体重均呈下降趋势，INH+Ag85B-ESAT-6-rMS组、INH+Hsp65-IL-2-rMS组、Ag85B-ESAT-6-rMS组和Hsp65-IL-2-rMS组的小鼠体重均呈显着增长趋势（P<0.05）；③治疗后第4周和第8周各组小鼠肺组织中抗酸染色镜检的结果显示，生理盐水组和RFP组均呈强阳性（++++或+++），其次为MS组（+++），而Ag85B-ESAT-6-rMS组和Hsp65-IL-2-rMS组为（++），INH+Ag85B-ESAT-6-rMS组、INH+Hsp65-IL-2-rMS组和INH组均为（+）；④治疗后第4周和第8周各组小鼠肺组织HE染色观察结果显示，各组小鼠肺组织均呈慢性炎症反应，除INH组外其他各组均呈慢性肉芽肿性炎的表现，肺间质增生并纤维化，表明MS和rMS可引起小鼠肺组织一定程度的病理损伤；⑤治疗后第4周和第8周，Ag85B-ESAT-6-rMS组、Hsp65-IL-2-rMS组、INH+Ag85B-ESAT-6-rMS组、INH+Hsp65-IL-2-rMS组和INH组小鼠脾和肺的荷菌数（log10CFU）均低于生理盐水对照组（P<0.05），表明两种rMS均能有效抑制MTB耐RFP株在小鼠组织中的增殖，具有免疫治疗作用，与INH联合应用时的治疗效果较单独用rMS的治疗效果更好；⑥rMS与INH联合治疗组小鼠存活率均高于rMS单独治疗组和MS组，但是与生理盐水对照组无差别，结果提示各组存活率排序除与小鼠MTB脏器荷菌数的多少有关之外，还与小鼠肺组织显示的病理损伤（间质增生并纤维化）程度一致。4. Ag85B-ESAT-6-rMS对MTB H37Rv株低剂量感染小鼠的免疫治疗方法：①取MTB H37Rv株经尾静脉注射感染68周龄的雌性C57BL/6小鼠（1×104CFU/只），分别于感染第6周和第10周时，无菌分离小鼠脾和肺脏，制作组织切片进行抗酸染色检查和HE染色观察，平板计数法计脏器荷菌数（CFU）。②与上述同样方法用MTB H37Rv株感染小鼠，并将其随机分为4组（30只/组），即Ag85B-ESAT-6-rMS治疗组、RFP/INH+Ag85B-ESAT-6-rMS联合治疗组、RFP/INH治疗组和感染模型对照组；各组治疗均在感染后第10周开始，其中Ag85B-ESAT-6-rMS治疗组经背部皮下注射1×107CFU/只，间隔4周后同样方法免疫第2次；RFP/INH+Ag85B-ESAT-6-rMS联合治疗组先用RFP/INH通过饮水治疗4周后，再用Ag85B-ESAT-6-rMS通过皮下注射治疗，剂量同上，间隔4周后同样方法免疫第2次；RFP/INH药物治疗组通过饮水治疗，持续12周；各组小鼠在治疗结束4周后，通过肌肉注射地塞米松诱导小鼠MTB感染的复发。③观察并记录各组小鼠活动及体重变化情况；分别在实验开始后第8周、13周、17周、22周和26周无菌分离小鼠脾脏，分离脾淋巴细胞，采用ELISpot检测分泌IFN-γ的脾淋巴细胞频数；④分别在第10周、14周、18周、22周和第26周无菌分离小鼠肺、脾组织，进行抗酸染色检查、HE染色观察及荷菌数（CFU）检测。结果：①感染小鼠肺和脾中均可见抗酸杆菌（++），HE染色可见慢性炎症反应（无典型慢性肉芽肿性炎的病理表现），肺和脾荷菌数分别为104CFU和103CFU，表明MTB低剂量感染小鼠模型建立成功；②各组小鼠体重均呈缓慢增长趋势，各组间无显着差异（P>0.05）；③在各自的免疫治疗后的4周和第8周，Ag85B-ESAT-6-rMS组和RFP/INH+Ag85B-ESAT-6-rMS组小鼠分泌IFN-γ的脾淋巴细胞频数均高于感染模型对照组（P<0.05）；④治疗后各组小鼠肺组织的HE染色观察均可见轻至中度慢性炎症反应，未见明显的病理性损伤表现。⑤治疗后，Ag85B-ESAT-6-rMS治疗组小鼠和RFP/INH+Ag85B-ESAT-6-rMS治疗组小鼠的肺、脾荷菌数均低于感染模型对照组（P<0.05），其中联合治疗组的效果更为显着；地塞米松诱导后，该两组小鼠肺、脾荷菌数虽然上升，但仍低于感染模型对照组（P<0.05）。【结论】本研究成功构建了能分泌表达MTB Ag85B-ESAT-6融合蛋白的Ag85B-ESAT-6-rMS，该菌能够诱导免疫小鼠以Th1型为主的细胞免疫应答。Ag85B-ESAT-6-rMS能够抑制MTB耐RFP株在小鼠肺和脾组织中的增殖，对该菌株感染小鼠具有明显的免疫治疗作用，但同时也可引起感染小鼠肺组织一定的病理损伤；将Ag85B-ESAT-6-rMS与INH联合应用时的治疗效果显着优于单独用rMS治疗。Ag85B-ESAT-6-rMS对MTB H37Rv株低剂量感染小鼠也有明显的免疫治疗作用；与RFP和INH联合治疗的效果要优于单独使用rMS；Ag85B-ESAT-6-rMS对MTB H37Rv株低剂量感染小鼠的免疫治疗后，小鼠肺组织未见明显病理损伤。Ag85B-ESAT-6-rMS作为治疗性疫苗有一定的优势，主要针对一些耐药菌或是残留于组织和细胞中低载量的休眠菌引发免疫清除，利用其可调节机体免疫系统功能，增强机体特异性免疫应答的特性，与化疗药物联用，发挥协同治疗作用。
邬强[8]（2013）在《结核分枝杆菌抗原及其融合蛋白在大肠杆菌、烟草中表达和免疫效应研究》文中进行了进一步梳理结核病是世界性的社会经济问题,尤其是在发展中国家,严重威胁人类的生命健康。据世界卫生组织（World Health Organization, WHO）报道,目前全世界超过三分之一的人口已感染结核菌,每年有近900万新发病例,300万人死于结核病。疫苗是预防和控制结核病的最佳途径,但目前国内外临床应用的只有卡介苗一种,且其预防效果存在较大争议,急需研制新型有效的结核疫苗。早期、快速、准确诊断对于结核病的防治至关重要,临床上尚缺乏特异、敏感的诊断方法,血清免疫学检查比其他实验室方法具有固有优势。基于结核分枝杆菌特异性抗原的融合蛋白是目前研究与开发结核疫苗、诊断方法及制剂的主要方向之一。国内外最新研究表明,Ag85B、ESAT-6抗原蛋白可作为研发结核疫苗、诊断制剂的理想靶抗原。WbbL为结核分枝杆菌特有的胞外功能蛋白,序列结构保守,种属特异性高,存在潜在抗原表位,很可能作为分枝杆菌感染的特异性分子标志。转基因植物作为生物反应器生产口服疫苗、诊断制剂为医用结核疫苗、诊断新方法的研发提供了新途径。本研究首先克隆结核分枝杆菌rfbpB、esxA和rwbbLJ基因,获得rfbpB-esxA、 rfbpB-esxA-rwbbL1融合抗原编码基因；通过原核表达载体pET-30a,马铃薯X病毒载体pgR107、植物二元载体pBI121介导其在大肠杆菌及烟草叶片中进行表达,获得特异的抗原蛋白；体内、体外观察评价所得到的纯化蛋白的免疫原性及保护效果,阐明各种抗原物质的临床诊断价值、疫苗应用前景及免疫应答机制。主要研究结果如下：1)对结核分枝杆菌wbbLl基因及rfbpB-esxA融合基因的生物信息学分析结果表明,wbbLl基因编码鼠李糖基转移酶（Rhamnosyl Transferase, WbbL）;该蛋白位于细胞外,二级结构以α螺旋为主,含有一个糖基转移酶的结构域,存在6个潜在抗原表位且有很好的抗原物质潜力；蛋白序列、结构保守,为结核分枝杆菌所特有。WbbL蛋白很可能是理想的结核免疫诊断方法、疫苗及抗结核药物的靶分子。疏水性接头（Gly4Ser）3的引入不会改变Ag85B、ESAT-6蛋白的抗原性。2)应用PCR、SOE-PCR技术克隆获得了rfbpB、esxA、rwbbL1基因及rfbpB-esxA及rfbpB-esxA-rwbbLl融合基因,通过基因工程技术,构建了携带各单基因及融合基因的原核表达载体,PCR、酶切鉴定及测序表明构建成功。IPTG作为诱导剂诱导蛋白表达,SDS-PAGE分析表明在大肠杆菌中表达出了Ag85B、ESAT-6、WbbL Ag85B-ESAT-6及Ag85B-ESAT-6-WbbL蛋白,但大部分以包涵体的形式存在。通过诱导条件的优化,获得了可溶蛋白组分,其中ESAT-6、WbbL及Ag85B-ESAT-6-WbbL蛋白的优化效果较好。采用亲和层析方法获得了纯化蛋白,Western blotting鉴定表明各种表达蛋白与His-tag形成了融合蛋白,表达正确。3)应用PCR技术对基因结构进行改造,获得了适合植物表达的各单基因及融合基因,然后将其构建于PVX载体pgR107及植物二元载体pBI121上, PCR、酶切鉴定及测序表明构建成功。通过植物转基因技术,叶片注射法侵染烟草,在侵染液OD600介于0.8-1.0之间时,侵染效果最佳。通过pgR107-GFP所携带的绿色荧光蛋白及pBL121所携带的GUS检测确定了外源蛋白的最高表达时间阶段,其中PVX载体在第7天时表达量最高,pBI121系列载体为侵染后的第2天。提取叶片总蛋白SDS-PAGE分析表明Ag85B、ESAT-6、WbbL及Ag85B-ESAT-6蛋白在烟草中获得了表达,获得了纯化蛋白。Western blotting鉴定表明蛋白表达正确。4)以大肠杆菌、烟草中表达的各种纯化蛋白为抗原,建立以结核患者血清为一抗的ELISA检测方法,评价观察表明各种蛋白诊断特异性较好（均超过90%）,敏感性差别较大,融合蛋白好于单一抗原蛋白,从高到低依次为Ag85B-ESAT-6-WbbL、Ag85B-ESAT-6、ESAT-6、Ag85B及WbbL。由于WbbL蛋白在结核感染全程表达,可能更适合应用于其中、后期的诊断。初次免疫-加强免疫策略免疫小鼠动物实验结果表明,各蛋白均有良好的免疫原性,可激发产生以Thl型为主的细胞免疫应答,原核表达及植物表达的蛋白免疫效果几乎一致。与NS对照组相比,激发小鼠产生的血清特异IgG、IFN-γ及IL-2水平显着升高,差异均有统计学意义（P<0.05）。本研究将为研制和开发新型的人畜共用结核疫苗、临床诊断试剂提供了新思路、新材料并奠定了一定的理论基础,对防治结核病具有较大的临床意义。
李青[9]（2013）在《结核病多期抗原亚单位疫苗的构建评价及IL-17的结核免疫作用》文中指出结核病（Tuberculosis,TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）引起的人、畜、禽共患的慢性传染病，是目前全球重大传染病之一，较难控制且持久。据世界卫生组织统计，其病死率仅次于人类免疫缺陷病毒（HIV）／获得性免疫缺陷综合症（艾滋病，AIDS），位居第二的传染性疾病。结核的控制由于耐药菌株尤其是耐多药结核菌（MD-RTB）的出现及HIV/AIDS的传播与流行更加困难，其发病率在世界各地呈现回升趋势，并居高不下。据世界卫生组织报道，全球约1/3人口被结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）潜伏感染，在人体免疫力低下时可发展成为活动性结核。潜伏感染的结核分枝杆菌所处的低代谢休眠状态，能逃避机体特异性免疫反应对其的清除，而且活动性结核时不但存在可增殖的细菌，同时也存在休眠菌，这是结核病难于控制和消除的重要原因之一。卡介苗（Bacilli Calmette-Guerin,BCG）对预防儿童脑膜炎结核、栗粒性结核等严重的结核病有预防作用，但对成人肺结核保护效率据文献报道18%到80%不等，对潜伏感染结核几乎无保护作用，因此，研究针对成人结核病和潜伏感染结核病的新型疫苗及其免疫策略迫在眉睫。另外，结核感染过程中，免疫细胞通过产生释放细胞因子调节免疫反应，所以疫苗的设计、评价离不开细胞因子尤其是具有保护作用的细胞因子。γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）是主要的Th1细胞因子，传统认为的唯一的保护性细胞因子；白细胞介素4（interleukin-4，IL-4）是Th2细胞因子可抑制Th1型免疫反应，从而利于结核分枝杆菌的存活。有研究表明白细胞介素17（interleukin-17，IL-17）在结核感染中发挥了一定的作用，且有文献对结核病人细胞因子包括IL-17、IFN-γ及IL-4的产生分泌进行了检测。据此，本研究选择结核分枝杆菌对数生长期抗原Ag85B及Mpt64的190-198位的氨基酸多肽（CD8+T细胞表位），以及休眠期的保护性抗原Hsp16.3，构建融合蛋白亚单位疫苗，检测其免疫特性；应用BCG初免-蛋白亚单位疫苗加强免疫策略，比较融合蛋白亚单位疫苗对BCG的强化免疫效应及保护效力；应用实验室构建的新型结核亚单位疫苗检测免疫鼠分泌的IL-17, IFN-γ，并系统评价临床研究中BCG接种婴儿、儿童及结核感染成人IL-17, IFN-γ及IL-4三种细胞因子分泌水平。1.结核病多期抗原亚单位疫苗的构建及免疫特性评价目的：为了构建同时对休眠期细菌和生长期细菌具有保护性免疫应答的结核疫苗，本研究选择结核分枝杆菌休眠期、对数生长期的重要保护性抗原Hsp16.3、Ag85B及Mpt64的190-198位的氨基酸多肽（CD8+T细胞表位），构建融合蛋白Ag85B-Mpt64190-198-Hsp16.3（AMH），并对其免疫特性进行研究。方法：应用PCR扩增Ag85B、Mpt64190-198-Hsp16.3基因，并依次插入pET28a质粒中，在大肠杆菌BL21中诱导表达AMH蛋白，并应用亲和层析法纯化该融合蛋白。将该融合蛋白和复合佐剂二甲基三十六烷基铵及卡介苗多糖核酸（DDA+BCG-PSN）混合构建亚单位疫苗，于0、3、6周分别皮下免疫C57BL/6小鼠三次，第11周检测细胞免疫与体液免疫反应。结果：该融合蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式稳定表达，通过Ni-NTA亲和层析柱纯化得到蛋白纯度较高；利用该融合蛋白构建的亚单位疫苗免疫动物后，能诱导脾淋巴细胞产生针对结核分枝杆菌抗原（PPD、Ag85B、Mpt64190-198及Hsp16.3）分泌较高水平的IFN-γ，及较高水平的IgG1、IgG2a，IgG2a/IgG1。结论：结核分枝杆菌AMH亚单位疫苗能诱导较强的特异性细胞免疫和体液免疫应答，该融合蛋白有望成为结核亚单位疫苗候选抗原，有进一步研究的必要。2.结核病多期抗原亚单位疫苗对卡介苗免疫及保护效率的加强目的：为了研究结核分枝杆菌多期抗原串联构建的亚单位疫苗加强BCG初始免疫效应及保护效率，以及如何有效的使用此类疫苗，本研究采用包含或不包含休眠期抗原的疫苗，即Ag85B-Mpt64190-198-Hsp16.3（AMH）, Ag85B-Mpt64190-198-Mtb8.4（AMM），并将此两种蛋白混合构建疫苗加强卡介苗，观察免疫效应及保护效率。方法：将Ag85B、AMH、AMM以及AMH+AMM蛋白分别与复合佐剂二甲基三十六烷基铵及卡介苗多糖核酸（DDA+BCG-PSN）混合制备亚单位疫苗。第0周用卡介苗皮下免疫C57BL/6小鼠，分别于第8、10周用各亚单位疫苗皮下加强免疫两次，部分小鼠于第14周眼睛采血检测抗体水平，并分离脾淋巴细胞检测分泌IFN-γ的细胞数；其余小鼠末次免疫后12周用H37Rv株经尾静脉攻击，6周后取肺组织进行菌落计数、抗酸杆菌检测，并HE染色进行组织学观察。结果：与BCG组比较，各亚单位疫苗加强小鼠血清Ag85B特异性IgG1、IgG2a抗体滴度明显增高；所有融合蛋白疫苗加强免疫小鼠脾细胞均产生分泌高水平的Ag85B、PPD特异性IFN-γ；所有融合蛋白加强组免疫小鼠肺组织结核结节面积与BCG组差异无统计学意义；只有AMM+AMH加强组免疫小鼠肺组织菌落计数明显低于BCG组，并且其抗酸染色阳性细菌数也显着减少。结论：AMM+AMH疫苗加强BCG，显着清除小鼠肺组织结核分枝杆菌，能诱导特异性的细胞免疫和体液免疫应答，可抑制攻毒后6周小鼠肺组织中结核杆菌的生长，而且病理反应较轻，增强BCG保护效力。3.白细胞介素17的结核免疫作用目的：接种结核疫苗或结核感染时，免疫细胞有赖于细胞因子调节抗结核，新近研究提示Th17细胞产生释放的IL-17在结核进展中的作用不容忽视，为探讨其作用及可能机制，从而寻求疫苗评价指标，本研究应用实验室构建的具有较好保护效应的新型结核亚单位疫苗检测了免疫鼠分泌的IL-17, IFN-γ，并系统评价临床研究中BCG接种婴儿、儿童及结核感染成人IL-17, IFN-γ及IL-4三种细胞因子水平。方法：新型疫苗MH、EAMM在BCG初免后12、14周连续加强免疫C57BL/6小鼠两次，BCG和PBS免疫组为对照，第20周（末次免疫后6周）ELISPOT检测分泌IL-17, IFN-γ的脾细胞数。并应用检索词“白介素17或Th17细胞”和“结核”计算机检索数据库PubMed, EMBASE, Cochrane图书馆、BIOSIS Previews、中国生物医学文献数据库等，检索时间均为建库至2011年12月。全面检索有关人类结核的IL-17及IFN-γ产生量的文献，按照纳入标准筛选文献,由前两位研究者分别提取纳入文献的特征信息（外周血中抗原特异性IL-17及IFN-γ的水平），并分析。结果：BCG初免亚单位疫苗加强组小鼠产生的IFN-γ、IL-17均明显高于BCG单独免疫组。系统评价研究共检出相关文献226篇,按照文献纳入标准,最终纳入9篇文献。3篇文献（116名被研究者）报道了BCG接种后细胞因子水平,表明BCG接种后诱导了极高量的IL-17和IFN-γ。6篇文献（380名被研究者）报道了结核感染后细胞因子水平，表明活动性结核病人IL-17和IFN-γ低而IL-4高；潜伏结核比较活动性结核，IL-17和IFN-γ具有增高的趋势，但IL-4是降低的。结论：动物模型研究表明IL-17和IFN-γ在结核免疫反应中趋势相同。系统评价研究表明在BCG接种后及结核感染时，IL-17和IFN-γ具有一定的保护作用；数据不支持IL-17具有诱导组织损伤的作用。
刘磊[10]（2011）在《牛分枝杆菌mpb51-63-83-85b基因的原核表达及产物的应用研究》文中研究指明牛结核病（Bovine tuberculosis）主要是由牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis）引起的一种人和动物共患的慢性消耗性传染病,被我国列为二类动物疫病。近年来,该病不仅没有得到有效控制,而且流行情况呈上升趋势,严重地威胁和危害着畜牧业的发展以及人类的健康。MPB51、MPB63、MPB83和Ag85B都是结核分枝杆菌的主要保护性抗原。都在牛结核病血清学诊断中具有很大的潜力,是作为牛结核病亚单位疫苗及核酸疫苗很好的候选抗原。1.牛分枝杆菌mpb51-63-83-85b融合基因的获得以重组质粒pMD-18-T-51-63和pGEM-T-83、pGEM-T-85b为模板采用PCR技术扩增mpb51-63、mpb83和ag85b目的基因片段。以mpb83和ag85b基因片段为模板,采用重叠延伸剪接技术（splicing by overlapping extension polymerase chain reaction,SOE PCR）扩增mpb83-85b融合基因。再以mpb51-63和mpb83-85b为模板,通过SOE PCR（?）mpb51-63和mpb83-85b基因融合,获得了融合基因mpb51-63-83-85b。2.牛分枝杆菌mpb51-63-83-85b融合基因的表达将mpb51-63-83-85b基因片段和表达载体pET30a（+）进行NcoⅠ和EcoRⅠ双酶切,回收纯化酶切产物,并用T4 DNA连接酶连接,成功地构建了原核表达重组质粒pET30a-51-63-83-85b。将该重组表达质粒转化到感受态细胞E.coli BL21（DE3）中,经过IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约100 kDa的外源蛋白表达,Western blotting分析发现,融合蛋白MPB51-MPB63-MPB83-Ag85B具有牛分枝杆菌抗原反应性。该融合蛋白通过离子交换层析得到了纯化。为进一步研究融合基因mpb51-63-83-85b及其表达产物作为核酸疫苗、亚单位疫苗和新型的诊断抗原,以及建立牛结核病特异、敏感的诊断方法奠定了基础。3.融合蛋白MPB51-MPB63-MPB83-Ag85B在牛结核病ELISA检测中的初步应用以纯化的融合蛋白MPB51-MPB63-MPB83-Ag85B为诊断抗原,以94份健康牛血清的检测结果确定阴、阳性临界值,从而建立了牛结核病间接ELISA检测方法。通过对牛结核阴性、阳性血清及副结核阳性血清的检测结果表明,该方法具有良好的敏感性和特异性。通过283份待检血清检测结果显示,融合蛋白MPB51-MPB63-MPB83-Ag85B的阳性检出率为5.30%（15/283）,PPD的阳性检出率为6.36%（18/283）,两者的阳性符合率为83.33%。初步研究结果表明,融合蛋白MPB51-MPB63-MPB83-Ag85B作为牛结核病ELISA诊断抗原具有较好的敏感性和特异性。
二、结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因疫苗的免疫效果观察（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因疫苗的免疫效果观察（论文提纲范文）
（1）结核分枝杆菌融合蛋白LT33的制备及免疫原性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 材料与方法 |
| 1.1 实验材料及仪器 |
| 1.1.1 主要实验耗材和试剂 |
| 1.1.2 主要实验设备 |
| 1.1.3 实验所用细胞和动物 |
| 1.1.4 主要实验试剂配置 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 融合蛋白LT33 的构建 |
| 1.2.2 融合蛋白LT33 的小量表达 |
| 1.2.3 融合蛋白LT33 的发酵表达 |
| 1.2.4 融合蛋白LT33 的纯化 |
| 1.2.5 蛋白浓度测定 |
| 1.2.6 融合蛋白LT33 的鉴定 |
| 1.2.7 C57BL/6 小鼠的分组及免疫程序 |
| 1.2.8 小鼠血清特异性抗体检测 |
| 1.2.9 分离小鼠脾脏淋巴细胞 |
| 1.2.10 亚单位疫苗LT33/DP的免疫原性检测 |
| 1.2.11 BALB/c小鼠的免疫程序 |
| 1.2.12 细胞融合 |
| 1.2.13 杂交瘤细胞间接ELISA筛选 |
| 1.2.14 杂交瘤细胞单克隆化 |
| 1.2.15 杂交瘤细胞核型分析 |
| 1.2.16 单克隆抗体纯化 |
| 1.2.17 统计学分析 |
| 第二章 实验结果 |
| 2.1 融合蛋白LT33 的制备 |
| 2.1.1 融合蛋白LT33 的构建 |
| 2.1.2 融合蛋白LT33 的理化特性分析 |
| 2.1.3 融合蛋白LT33 的小量表达 |
| 2.1.4 融合蛋白LT33 的发酵表达 |
| 2.1.5 融合蛋白LT33 的纯化 |
| 2.1.6 融合蛋白LT33 的鉴定 |
| 2.1.7 蛋白浓度测定 |
| 2.1.8 蛋白纯度分析 |
| 2.2 融合蛋白LT33/DP的免疫原性 |
| 2.2.1 免疫小鼠脾脏淋巴细胞的IFN-γ和 IL-2 表达水平 |
| 2.2.2 间接ELISA法测小鼠血清抗体滴度 |
| 2.3 融合蛋白LT33 单克隆抗体的制备 |
| 2.3.1 免疫小鼠血清抗体效价测定 |
| 2.3.2 细胞融合过程形态观察 |
| 2.3.3 分泌单克隆抗体的细胞株筛选 |
| 2.3.4 杂交瘤细胞核型分析 |
| 2.3.5 单克隆抗体纯化 |
| 2.3.6 单克隆抗体的免疫印迹验证分析 |
| 2.3.7 杂交瘤细胞株ELISA筛选 |
| 第三章 分析与讨论 |
| 3.1 融合蛋白LT33 的构建与表达 |
| 3.2 融合蛋白LT33 的纯化 |
| 3.3 融合蛋白LT33/DP的免疫原性分析 |
| 3.4 单克隆抗体的制备 |
| 第四章 结论 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（2）结核分枝杆菌新型疫苗的制备及其免疫效果研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 第一部分 结核分枝杆菌 Ag85B-Hsp65、ESAT6-Hsp65 融合基因DNA 疫苗株的构建及免疫效果评价 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 第二部分 卡介苗 ure C 基因缺失株的构建及筛选 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 结核病与结核疫苗 |
| 参考文献 |
| 缩略语表 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（3）牛分枝杆菌cfp10-esat6-cfp7融合基因重组乳酸菌的构建及免疫原性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 牛结核病概述 |
| 1.1 牛结核病简介及现状 |
| 1.2 牛结核病疫苗研究进展 |
| 1.3 牛结核病诊断技术 |
| 第二章 乳酸菌载体研究进展 |
| 2.1 乳酸菌 |
| 2.2 乳酸乳球菌表达系统 |
| 2.3 乳酸菌疫苗的应用 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 牛分枝杆菌cfp10-esat6-cfp7 融合蛋白基因的克隆 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 试验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 牛分枝杆菌cfp10-esat6-cfp7 融合基因重组乳酸菌的构建及表达 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 牛分枝杆菌cfp10-esat6-cfp7 融合基因重组乳酸菌的免疫原性研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 仪器试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（4）抗耐药结核多效基因工程疫苗的构建及免疫效果分析（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 综述：结核新疫苗研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（5）抗结核MPT64-Ag85B/katG/GNLY-PRF1重组质粒DNA疫苗的构建与表达（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞株、菌株和载体 |
| 1.1.2 试剂与主要仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 质粒构建 |
| 1.2.2 重组耻垢分枝杆菌菌苗的构建 |
| 1.2.2. 1 电转化 |
| 1.2.2. 2 菌液PCR进行基因型鉴定 |
| 1.2.2. 3 制备菌苗 |
| 1.2.3 293T细胞转染 |
| 1.2.4 Real-Time RT-PCR |
| 1.2.5 Western blot检测转染后蛋白表达 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 质粒构建 |
| 2.2 重组耻垢分枝杆菌菌苗的构建 |
| 2.3 质粒转染293T细胞结果效果分析 |
| 2.4 质粒转染人源胚肾293T细胞中靶基因在mRNA水平上表达 |
| 2.5 Western blot检测转染后蛋白表达情况 |
| 3 讨论 |
（6）结核分枝杆菌亚单位疫苗LT69的研究和抗持留菌药物的筛选（论文提纲范文）
| 第一部分 结核分枝杆菌亚单位疫苗LT69的构建及其保护效应和免疫记忆特性的研究 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第二部分 抗持留菌药物筛选与评价 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一部分 结核分枝杆菌亚单位疫苗LT69的构建及其保护效应和免疫记忆特性的研究 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 结核病的疾病负担 |
| 1.2 结核病疫苗的研究现状 |
| 1.3 结核病疫苗免疫记忆保护机制的研究进展 |
| 1.4 本研究课题设计 |
| 第二章 结核分枝杆菌亚单位疫苗LT69的构建和保护效果评价 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 试验材料与方法 |
| 2.2.1 菌株 |
| 2.2.2 质粒 |
| 2.2.3 实验动物 |
| 2.2.4 主要试验试剂 |
| 2.2.4.1 酶类 |
| 2.2.4.2 试剂盒类 |
| 2.2.4.3 培养基及化学试剂 |
| 2.2.4.4 其他(PCR引物、抗体、抗生素和蛋白抗原等) |
| 2.2.5 主要仪器设备 |
| 2.2.6 试验方法 |
| 2.2.6.1 pET30a(+)-ESAT6-Ag85B-Mtb8.4-MPT64(190-198)-HspX(pET30a-EAMMH)重组载体的构建 |
| 2.2.6.2 融合蛋白LT69的表达 |
| 2.2.6.3 融合蛋白LT69的纯化 |
| 2.2.6.4 结核亚单位疫苗LT69-DDA-PolyI:C (LT69)的制备 |
| 2.2.6.5 结核亚单位疫苗LT69的免疫原性及保护效果检测 |
| 2.2.6.6 结核亚单位疫苗LT69加强BCG效应的研究 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 重组载体pET30a-EAMMH的构建及鉴定 |
| 2.3.1.1 构建重组基因载体pET30a(+)-MPT64_(190-198)-Mtb8.4-HspX (MMH) |
| 2.3.1.2 PCR扩增ESAT6-Ag85B(EA)融合基因片段 |
| 2.3.1.3 构建重组基因载体pET30a-EAMMH(图2.6) |
| 2.3.2 LT69融合蛋白的表达 |
| 2.3.3 LT69融合蛋白的纯化 |
| 2.3.4 LT69疫苗的免疫原性及保护效果 |
| 2.3.5 LT69疫苗加强BCG的效应 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 结核分枝杆菌亚单位疫苗抗原的筛选 |
| 2.4.2 结核分枝杆菌亚单位蛋白疫苗LT69的特性 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 结核病亚单位疫苗的免疫记忆特性研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 主要仪器设备 |
| 3.2.4 主要方法 |
| 3.2.4.1 疫苗LT69的配制 |
| 3.2.4.2 雷帕霉素的配制 |
| 3.2.4.3 不同剂量LT69疫苗免疫小鼠策略 |
| 3.2.4.4 结核亚单位疫苗LT69和雷帕霉素的联合免疫策略 |
| 3.2.4.5 疫苗激活的免疫记忆性T细胞的检测方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 低剂量LT69疫苗比高剂量诱导产生更持久的免疫记忆 |
| 3.3.2 低剂量LT69疫苗的长期保护效果强于高剂量疫苗 |
| 3.3.3 雷帕霉素增强LT69疫苗诱导的免疫记忆性T细胞的分泌 |
| 3.3.4 雷帕霉素免疫增强LT69疫苗的长期保护效果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 疫苗诱导的免疫记忆 |
| 3.4.2 影响记忆性T细胞形成的因素 |
| 3.4.3 疫苗LT69所诱导的免疫记忆的调控 |
| 3.5 结论和展望 |
| 参考文献(一) |
| 第二部分 抗持留菌药物筛选与评价 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 本研究课题设计 |
| 第二章 抗金黄色葡萄球菌持留菌药物的筛选与评价 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 试验材料与方法 |
| 2.2.1 菌株 |
| 2.2.2 实验动物 |
| 2.2.3 FDA-批准的药库和抗生素 |
| 2.2.4 从FDA批准的药库筛选针对金黄色葡萄球菌持留菌的药物 |
| 2.2.5 通过菌落计数比较所筛选药物抗持留菌的活性 |
| 2.2.6 在小鼠体内评价tosufloxacin对金黄色葡萄球菌持留菌的杀伤效果 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 从FDA批准的药物库中筛选出的抗金黄色葡萄球菌持留菌的药物 |
| 2.3.2 通过CFU计数比较所筛选出的6种药物的杀菌效果 |
| 2.3.3 比较Tosufloxacin和其他喹诺酮类药物在体内外抗金黄色葡萄球菌持留菌的效果及化学结构的比较 |
| 2.3.4 利福平(rifampin)对tosufloxacin的杀菌作用具有一定的协同作用 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 金黄色葡萄球菌持留菌模型 |
| 2.4.2 抗生素tosufloxacin是抗金黄色葡萄球菌持留菌的有效药物 |
| 2.4.3 利福平对tosufloxacin的协同作用 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 抗大肠埃希菌持留菌药物的筛选与评价 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 试验材料与方法 |
| 3.2.1 菌株 |
| 3.2.2 FDA批准的药库和抗生素 |
| 3.2.3 从FDA批准的药库筛选针对大肠埃希菌持留菌的药物 |
| 3.2.4 通过菌落计数,比较所筛选药物抗持留菌的活性 |
| 3.2.5 所筛选药物最小抑菌浓度(MIC)的检测 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 从FDA药库筛选出14种具有抗大肠埃希菌持留菌的药物 |
| 3.3.2 Tosufloxacin和colistin具有很强的抗大肠埃希菌持留菌的活性 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 大肠埃希菌持留菌是尿路感染(Urinary track infection,UTIs)反复发作的主要原因 |
| 3.4.2 Tosufloxacin和colistin是抗大肠埃希菌持留菌的有效药物 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 协同吡嗪酰胺抗结核分枝杆菌持留菌药物的筛选 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 试验材料与方法 |
| 4.2.1 菌株 |
| 4.2.2 FDA批准的药库和抗生素 |
| 4.2.3 筛选抗结核分枝杆菌H37Ra持留菌的药物 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 在FDA批准的药物库中筛选出130种药物具有抗H37Ra持留菌的作用 |
| 4.3.2 在130种初筛的药物中,有6中具有协同PZA抗H37Ra持留菌的作用 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 结核分枝杆菌持留菌是结核病难于治愈的原因之一 |
| 4.4.2 抗结核分枝杆菌持留菌药物的筛选 |
| 4.5 结论 |
| 参考文献(二) |
| 在学期间科研成果 |
| 致谢 |
（7）表达Ag85B-ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌对结核分枝杆菌感染小鼠免疫治疗效果评价（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 一、MTB 感染的流行及防治简况 |
| 二、MTB 的感染免疫学研究进展 |
| 三、TB 新型疫苗的候选抗原 |
| 四、TB 新型疫苗的研究进展 |
| 五、TB 的免疫治疗 |
| 第一部分 分泌表达 Ag85B-ESAT-6 融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌的构建及免疫学特性研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 Ag85B-ESAT-6-rMS 对 MTB 耐 RFP 株感染小鼠的免疫治疗效果评价 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 Ag85B-ESAT-6-rMS 对 MTB H37Rv 株低剂量感染小鼠的免疫治疗效果评价 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 研究成果 |
（8）结核分枝杆菌抗原及其融合蛋白在大肠杆菌、烟草中表达和免疫效应研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 前言 |
| 1.1 结核病疫情及我国防治现状 |
| 1.2 结核疫苗的研究 |
| 1.3 结核诊断方法的研究 |
| 1.4 转基因植物生物反应器的研究 |
| 1.5 转基因植物结核疫苗及诊断制剂的研究 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 1.7 研究技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料、试剂与仪器 |
| 2.1.1 基因组、菌株与质粒 |
| 2.1.2 植物材料 |
| 2.1.3 实验动物及血清 |
| 2.1.4 工具酶 |
| 2.1.5 主要试剂 |
| 2.1.6 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 结核分枝杆菌wbbL1基因及rfbpB-esxA融合基因的生物信息学分析 |
| 2.2.2 结核分枝杆菌rfbpB、esxA、rwbbL1基因及rfbpB-esxA、rfbpB-esxA-rwbbL1融合基因原核表达载体的构建 |
| 2.2.3 结核分枝杆菌rfbpB、esxA、rwbbL1基因及rfbpB-esxA、rfbpB-esxA-rwbbL1融合基因植物表达载体的构建 |
| 2.2.4 结核分枝杆菌rfbpB、esxA、rwbbL1基因及rfbpB-esxA、rfbpB-esxA-rwbbL1融合基因在E.coli中的表达、纯化和鉴定 |
| 2.2.5 结核分枝杆菌rfbpB、esxA、rwbbL1基因及rfbpB-esxA、rfbpB-esxA-rwbbL1融合基因在烟草中的表达、纯化和鉴定 |
| 2.2.6 E.coli、烟草中表达蛋白的免疫原性分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 生物信息学分析结果 |
| 3.1.1 wbbL1基因及其编码蛋白质的生物信息学分析、预测结果 |
| 3.1.2 rfbpB-esxA融合基因及其编码蛋白质的生物信息学分析、预测结果 |
| 3.2 原核表达载体的构建结果 |
| 3.2.1 结核分枝杆菌rfbpB、esxA及rwbbL1基因的扩增 |
| 3.2.2 结核分枝杆菌rfbpB-esxA、rfbpB-esxA-rwbbL1融合基因的扩增 |
| 3.2.3 结结核分枝杆菌rfbpB、esxA、rwbbL1基因及rfbpB-esxA、rfbpB-esxA-rwbbL1融合基因与原核表达载体pET-30a的连接 |
| 3.3 植物表达载体的构建结果 |
| 3.3.1 结核分枝杆菌rfbpB、esxA、rwbbL1基因及rfbpB-esxA、rfbpB-esxA-rwbbL1融合基因的扩增 |
| 3.3.2 结结核分枝杆菌rfbpB、esxA、rwbbL1基因及rfbpB-esxA、rfbpB-esxA-rwbbL1融合基因与植物表达载体的连接 |
| 3.4 E.coli中表达的结果 |
| 3.4.1 优化诱导前外源蛋白的表达情况及分析 |
| 3.4.2 优化诱导后外源蛋白的表达情况及分析 |
| 3.4.3 外源蛋白的纯化与Western blotting分析 |
| 3.5 烟草中表达的结果 |
| 3.5.1 报告基因GFP、GUS的检测结果与分析 |
| 3.5.2 植物表达蛋白的分析与鉴定 |
| 3.6 E.coli、烟草中表达蛋白免疫原性的分析 |
| 3.6.1 血清诊断学评价结果 |
| 3.6.2 动物免疫效果评价分析 |
| 4 讨论与结论 |
| 4.1 讨论 |
| 4.1.1 生物信息学 |
| 4.1.2 原核表达载体的构建及在E.coli中表达 |
| 4.1.3 植物表达载体的构建及在烟草中表达 |
| 4.1.4 表达蛋白免疫原性 |
| 4.2 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（9）结核病多期抗原亚单位疫苗的构建评价及IL-17的结核免疫作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 外文缩略语表 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 结核病疫苗的研究进展 |
| 1 卡介苗应用中发现的问题 |
| 2 保护性抗原的筛选 |
| 3 新型结核疫苗种类 |
| 3.1 重组卡介苗 |
| 3.2 结核病蛋白质多肽疫苗 |
| 3.3 脱氧核糖核酸疫苗 |
| 3.4 减毒结核疫苗 |
| 4 国内外结核病疫苗研究现状 |
| 4.1 国际研究现状 |
| 4.2 国内研究现状 |
| 5 结核病疫苗佐剂研发现状 |
| 6 展望 |
| 参考文献 |
| 第二章 结核分枝杆菌免疫机制研究进展 |
| 1 结核病疫苗免疫机制研究 |
| 2 卡介苗的启示与疫苗免疫策略 |
| 3 结核病亚单位疫苗佐剂 |
| 4 结核病疫苗评价 |
| 参考文献 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第三章 结核病多期抗原亚单位疫苗的构建及免疫特性评价 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 试验技术路线 |
| 1.5 重组质粒Ag85B-Mpt64190-198-Hsp16.3（AMH）的构建 |
| 1.6 AMH 蛋白表达、纯化及浓度测定 |
| 1.7 AMH 亚单位疫苗的配制 |
| 1.8 动物分组、免疫、检测流程 |
| 1.9 免疫指标检测 |
| 1.10 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 模板 H37Rv-DNA 的提取 |
| 2.2 目的基因的体外扩增 |
| 2.3 提取的质粒 pET28a 载体 |
| 2.4 基因Mpt64190-198-Hsp16.3 与质粒pET28a-Ag85B酶切并纯化 |
| 2.5 PCR验证重组质粒pET28a-Ag85B-Mpt64190-198-Hsp16.3 |
| 2.6 基因测序结果 |
| 2.7 AMH 蛋白表达与纯化 |
| 2.8 免疫小鼠体液免疫检测 |
| 2.9 免疫小鼠细胞免疫检测 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 第四章 结核病多期抗原亚单位疫苗对卡介苗免疫及保护效率的加强 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要设备仪器 |
| 1.4 试验技术路线 |
| 1.5 亚单位疫苗的配制 |
| 1.6 动物分组、免疫及保护力试验 |
| 1.7 免疫反应检测 |
| 1.8 组织病理损伤及保护效果评价 |
| 1.9 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 疫苗加强卡介苗免疫反应检测 |
| 2.2 保护效果评价及组织病理损伤检测 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 第五章 白细胞介素 17 的结核免疫作用 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 动物研究 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要设备仪器 |
| 1.1.4 亚单位疫苗的配制 |
| 1.1.5 动物分组及免疫方法 |
| 1.1.6 免疫指标检测 |
| 1.1.7 统计学方法 |
| 1.2 系统评价研究 |
| 1.2.1 检索方法 |
| 1.2.2 纳入标准 |
| 1.2.3 信息提取及分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 免疫小鼠脾淋巴细胞分泌的 IL-17 和 IFN-Γ |
| 2.2 系统评价研究 |
| 2.2.1 纳入文献 |
| 2.2.2 卡介苗诱导的 IL-17 及 IFN-γ分泌水平 |
| 2.2.3 结核感染者外周血细胞分泌 IL-17 与 IFN-γ |
| 2.2.4 活动性与潜伏结核组 IL-17 与 IFN-γ的分泌 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（10）牛分枝杆菌mpb51-63-83-85b基因的原核表达及产物的应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 综述 |
| 1 结核病的危害 |
| 2 病原 |
| 3 流行病学 |
| 4 致病机理 |
| 5 免疫机理 |
| 6 牛结核病诊断技术研究进展 |
| 7 牛分枝杆菌主要保护性抗原研究进展 |
| 8 牛结核DNA疫苗的研究现状 |
| 9 本研究的目的和意义 |
| 第二部分 实验内容 |
| 实验一 牛分枝杆菌MPB51-MPB63-MPB83-Ag85b融合蛋白的表达及纯化 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 目的基因的PCR扩增产物 |
| 3.2 原核表达质粒的构建 |
| 3.3 重组表达质粒的鉴定 |
| 3.4 目的基因的序列测定与分析 |
| 3.5 SDS-PAGE分析 |
| 3.6 Western blot分析 |
| 3.7 重组蛋白的纯化结果分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 目的基因的选择 |
| 4.2 关于融合基因的构建 |
| 4.3 原核表的系统的选择 |
| 4.4 融合蛋白的反应性 |
| 4.5 关于融合蛋白的纯化 |
| 5 小结 |
| 实验二 MPB51-MPB63-MPB83-Ag85B在牛结核病ELISA检测中的初步应用 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 MPB51-MPB63-MPB83-Ag85B融合蛋白最适包被浓度和血清最适稀释浓度的确定 |
| 3.2 酶标抗体的工作浓度的确定 |
| 3.3 ELISA判定标准的确定 |
| 3.4 特异性检测结果 |
| 3.5 敏感性检测结果 |
| 3.6 待测血清检测结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三部分 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略语表 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因疫苗的免疫效果观察（论文参考文献）
- [1]结核分枝杆菌融合蛋白LT33的制备及免疫原性研究[D]. 谭大权. 兰州大学, 2021(09)
- [2]结核分枝杆菌新型疫苗的制备及其免疫效果研究[D]. 张真. 内蒙古医科大学, 2020(03)
- [3]牛分枝杆菌cfp10-esat6-cfp7融合基因重组乳酸菌的构建及免疫原性研究[D]. 包艳红. 吉林农业大学, 2019(03)
- [4]抗耐药结核多效基因工程疫苗的构建及免疫效果分析[D]. 李晓倩. 遵义医学院, 2017(10)
- [5]抗结核MPT64-Ag85B/katG/GNLY-PRF1重组质粒DNA疫苗的构建与表达[J]. 李晓倩,曹广如,王英全,王苗,敖骏,蔡玉强,岳昌武. 遵义医学院学报, 2016(06)
- [6]结核分枝杆菌亚单位疫苗LT69的研究和抗持留菌药物的筛选[D]. 牛红霞. 兰州大学, 2015(07)
- [7]表达Ag85B-ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌对结核分枝杆菌感染小鼠免疫治疗效果评价[D]. 王平. 第四军医大学, 2014(01)
- [8]结核分枝杆菌抗原及其融合蛋白在大肠杆菌、烟草中表达和免疫效应研究[D]. 邬强. 海南大学, 2013(02)
- [9]结核病多期抗原亚单位疫苗的构建评价及IL-17的结核免疫作用[D]. 李青. 甘肃农业大学, 2013(07)
- [10]牛分枝杆菌mpb51-63-83-85b基因的原核表达及产物的应用研究[D]. 刘磊. 吉林农业大学, 2011(11)