一、REVERSIBLE BINGING OF NEW SYNTHESIZED OPIOID RECEPTOR LIGANDS TO CLONED OPIOID RECEPTORS STABLY EXPRESSED IN CHO CELL AND IDENTIFICAITON OF STIMULATING OPIOID RECEPTOR SUBTYPE（论文文献综述）
叶荣荣[1]（2021）在《蒂巴因衍生物的镇痛作用研究》文中认为
左君[2]（2021）在《局麻药过敏的回顾性分析及MRGPRX2参与类过敏反应肥大细胞脱颗粒的机制研究》文中认为目的:局麻药（Local Anesthetics,LAs）在临床上的应用范围极广,特别是在局部麻醉、区域神经阻滞和疼痛治疗中。局麻药过敏反应的发生率目前没有明确报道。在日常的临床实践中,使用局麻药引起过敏反应的风险是一个值得临床医生关注的问题。本文的主要目的是调查一家麻醉过敏门诊10年期间就诊患者局麻药过敏的发生率。方法:回顾性分析患者的医疗记录,这些患者被转诊到中国的一家麻醉过敏门诊,并在2009年至2019年的10年间接受了局麻药过敏检测。从患者的病历中收集以下信息:人口学特征、转诊原因、药物超敏反应（drug hypersensitivity reaction,DHR）的临床特征以及对潜在致敏药物的测试结果。通过皮肤点刺试验（skin prick test,SPT）、皮内试验（intradermal test,IDT）、嗜碱性粒细胞活化试验（basophil activation test,BAT）对疑似局麻药进行过敏检测。结果:本研究一共纳入了 109名患者,主要转诊原因是手术后存在可疑的局麻药DHR（n=68,62%）,第二常见转诊原因是患者有使用其他药物的DHR病史,并需要在即将进行的手术中使用局麻药（n=41,38%）。这些患者中只有6人（6%）对局麻药表现出真正的过敏,在皮肤试验或BAT中呈阳性结果。对于有其他药物DHR病史的41例患者,皮肤试验和BAT均为阴性。结论:局麻药过敏的风险可能是非常低的。然而,对怀疑有局麻药DHR病史的患者应当考虑进行过敏检测,完整的过敏检测对于正确的诊断和治疗是必要的。在临床实践中,皮肤试验和BAT有助于局麻药过敏的调查和诊断,识别罕见的局麻药过敏病例。目的:近年来,围术期麻醉药物引起类过敏反应（pseudo-allergy）的报道逐渐增多。最近的一项研究表明,肥大细胞表面受体MRGPRX2参与了多种药物引起的类过敏反应。因此,可利用MRGPRX2作为药物类过敏反应的作用靶点,建立一种有效的临床前药物安全评价方法,对麻醉药物潜在的类过敏作用进行评价。方法:将慢病毒载体系统转染到HEK293T细胞,构建稳定过表达MRGPRX2受体的细胞模型MRGPRX2-HEK293T;用RT-PCR方法检测MRGPRX2的表达;通过钙流检测证明表达的MRGPRX2是否具有完整的受体功能活性;利用构建成功的MRGPRX2-HEK293T细胞系评估麻醉药物（吗啡,芬太尼,利多卡因,顺阿曲库铵）潜在的类过敏作用。结果:本实验成功构建了基于过表达细胞系HEK293T-MRGPRX2的体外评价药物靶点激活的细胞模型。该重组细胞转染了包含MrgprX2全长基因的慢病毒载体,其细胞膜上能够稳定表达MRGPRX2受体分子,且具有完整的受体功能活性。吗啡、顺阿曲库铵可以激活MRGPRX2-HEK293T细胞产生钙流信号,利多卡因、芬太尼作用于MRGPRX2-HEK293T细胞上没有产生钙流信号。结论:本实验构建的稳定过表达MRGPRX2的细胞模型MRGPRX2-HEK293T,可以用于麻醉药物潜在的类过敏作用评价。钙流检测初步证实吗啡和顺阿曲库铵是MRGPRX2靶点的激动剂,可能是潜在的引发类过敏反应的麻醉药物。利多卡因和芬太尼对MRGPRX2靶点无激活作用,可能无潜在的类过敏作用。该细胞模型同时为进一步研究类过敏反应的机制提供了一种重要的途径。目的:吗啡不仅可以通过IgE依赖途径诱导肥大细胞脱颗粒,还可以通过非IgE依赖途径活化肥大细胞,引起类过敏反应（pseudo-allergy）。最新的研究已经证实,肥大细胞表面受体MRGPRX2是参与多种药物的类过敏反应极其重要的靶点。但吗啡诱导的肥大细胞脱颗粒作用是否有MRGPRX2受体的参与目前尚不明确,另外其与阿片受体（opioidreceptors,OR）之间的相互作用关系尚无研究。本部分的研究主要探讨吗啡对肥大细胞的非IgE依赖活化途径,并通过细胞实验阐明细胞活化后脱颗粒作用的相关信号通路。方法:本研究选取人LAD2肥大细胞,通过测定β-氨基己糖苷酶释放率,明确吗啡是否可以引起肥大细胞脱颗粒;通过RT-PCR检测,比较LAD2肥大细胞上MRGPRX2受体和阿片受体的表达量是否存在明显差异;同时基于稳定过表达MRGPRX2的转染细胞系MRGPRX2-RBL-2H3肥大细胞,加入阿片受体抑制剂（纳洛酮）、MRGPRX2抑制剂（QWF）、Gαi抑制剂（PTx）、Gαq抑制剂（YM）干预、钙通道抑制剂（La3+）,通过β-氨基己糖苷酶释放率的测定和钙流检测两项指标来研究肥大细胞的激活机制。结果:吗啡可以诱导明显的LAD2肥大细胞脱颗粒,释放β-氨基己糖苷酶,且吗啡诱导肥大细胞脱颗粒的百分率随吗啡终浓度的增大而增大,呈明显的剂量依赖性;LAD2肥大细胞上MRGPRX2表达明显高于阿片受体的表达量;吗啡可以诱导MRGPRX2-RBL-2H3转染细胞系脱颗粒,释放β-氨基己糖苷酶,同时可以引起细胞内钙流释放;QWF可以明显抑制吗啡诱导的肥大细胞脱颗粒水平,纳洛酮不能抑制肥大细胞的脱颗粒作用;La3+、YM、PTx均可明显抑制吗啡诱导的肥大细胞脱颗粒水平,同时,La3+、YM可以明显抑制细胞内钙流信号。但是,PTx不能抑制吗啡引起的肥大细胞内钙流信号。结论:吗啡诱导的肥大细胞脱颗粒是通过MRGPRX2受体的激活介导,与阿片受体的活化无直接相关性。吗啡诱导的肥大细胞活化后下游信号通路可能涉及Gαq,Ca2+信号通路,此外还可能涉及Gαi通路的活化。
蒋爽[3]（2021）在《4’-氨基取代苯蒂巴因类似物生物活性研究》文中研究指明阿片类镇痛药是目前最常用的镇痛处方药,阿片类药物通过与阿片受体结合发挥其镇痛效果。阿片受体主要分布在中枢神经系统、外周神经系统以及胃肠道。阿片受体为G蛋白偶联受体（GPCR）家族成员之一,主要有μ、δ和κ阿片受体三个亚型,各亚型间具有大约60%的同源性,分别介导不同的生理作用。传统的阿片类镇痛药,如芬太尼、吗啡、可待因、海洛因等,它们大都是μ阿片受体的完全激动剂或者μ/δ阿片受体混合激动剂。传统的μ阿片类镇痛药物具有诸多副作用,如依赖性、成瘾、耐受性、呼吸抑制、便秘等,这些日益严重的公共卫生危害使目前的镇痛药物在临床上面临了很大的挑战。而在阿片类受体中,κ阿片受体与μ阿片受体具有高度同源性,但与μ阿片受体的区别是,κ阿片受体不但具有很好的镇痛效应,并且不产生典型的μ阿片受体的副作用。因此,设计并合成μ受体及δ受体亲和力低、κ阿片受体亲和力高、镇痛效果好、副作用小的κ阿片受体激动剂,是一个开发高效、安全的潜在镇痛类新药的方向。基于此研究目的,本课题以药物化学家设计并合成的17个4’-氨基取代苯蒂巴因类化合物为主要研究对象,以κ阿片受体特异性结合为切入点,使用[3H]放射性配体-受体竞争结合实验,对该系列化合物进行筛选。筛选出的μ受体及δ受体亲和力低,κ阿片受体亲和力高的化合物,通过[35S]GTPγS功能试验评价该系列化合物对不同阿片受体亚型G蛋白的激动能力。通过动物疼痛模型进行体内镇痛效果研究,以期得到高效、安全的新型κ阿片受体激动剂镇痛类潜在新药。本研究从体外筛选和整体动物水平评价4’-氨基取代苯蒂巴因类化合物的药学活性。我们在放射性受体配体结合实验中发现化合物4j与κ阿片受体的亲和力较高,而对μ受体和δ受体的亲和力很低,说明化合物4j是对于κ阿片受体具有选择性高亲和力的配体化合物。我们选取代表性化合物4a、4b、4g、4i、4j、4m、μ阿片受体完全激动剂DAMGO、δ阿片受体完全激动剂DPDPE以及κ阿片受体完全激动剂U50,488进行[35S]GTPγS结合实验,验证化合物与μ,δ和k三种阿片受体结合对受体G蛋白的激动能力。体外功能活性[35S]GTPγS实验结果表明,潜力化合物4j对κ阿片受体具有完全激动的作用,但激动能力较弱。为了进一步研究化合物4j的药理学特性,我们选用了热板模型和醋酸扭体模型这两个镇痛动物模型来评价化合物4j的镇痛效果。化合物4j在热板实验和醋酸扭体试验中显示出相对较弱的镇痛作用,最大镇痛效果为50%,这些结果与化合物4j的功能活性评价结果一致。从药效学实验结果来看,化合物4j距离可应用于临床上的、高效的、安全的镇痛新药还有一定差距。其副作用评价尚未进行,化合物4j是否具有传统阿片类镇痛药不良反应以及中枢副作用还有待进一步验证。我们利用计算机分子对接技术,发现化合物4j芳基乙酰胺酰胺N上的氢原子可以与κ阿片受体中第二胞外区的C210形成氢键,且连接链更具柔性。我们推测这有可能是化合物4j具有较高的κ阿片受体亲和力和选择性的原因,这也为进一步优化化合物的结构提供了有益的参考。我们建立了一套药物筛选体系,在体内体外水平评价了潜在的阿片类镇痛药。为新型镇痛类κ阿片受体激动剂的开发提供了新思路。
邵帅[4]（2020）在《A20增强吗啡镇痛机制研究》文中研究说明阿片类镇痛药物是目前临床常用的镇痛药,具有强效镇痛作用。然而阿片类镇痛药在其发挥强大的镇痛作用同时,也会产生药物成瘾、耐受、呼吸抑制、便秘等副作用,这大大限制了其在临床上的使用。因此,如何使阿片类镇痛药在发挥镇痛作用的同时,尽可能减少其伴随的不良反应就成为人们重点研究的问题。阿片受体主要分为μ、δ、κ三种受体亚型,其中μ阿片受体（mu opioid receptor,MOR）是镇痛药物的主要作用靶点。其激活的主要过程是当阿片类药物激活MOR后,下游的G蛋白发生解离,使得环磷酸腺苷（Cyclic adenosine monophosphate,c AMP）被抑制,偶联的离子通道开放。激活后的受体会被激酶磷酸化,进而引起β-arrestin2的招募,受体内吞和下游信号通路的激活。目前已经发现许多蛋白参与MOR的调控,他们通过调节MOR的修饰或影响MOR的激活过程,或者影响MOR本身受体数量,来调控MOR的功能。实验室前期发现A20 binding inhibitor of NF-κB activation 1（ABIN-1）蛋白可以调控MOR的功能。在进一步的文献调研中,我们发现TNF alpha induced protein 3（A20）蛋白通常和ABIN-1蛋白共同在多个信号通路中发挥作用。目前研究表明A20主要在炎症相关信号通路中起到抑制炎症发生的作用,同时也与多种免疫疾病的发生密切相关。但是关于A20在中枢神经系统中发挥作用的研究目前还很少。最近有文献报道以A20为靶标的micro RNA可以影响MOR激动剂吗啡的镇痛和耐受,但其机制尚不明确。因此我们推测A20和ABIN-1蛋白一样也可以影响MOR的功能。综上,本课题旨在研究A20蛋白是否能影响MOR的功能,并对其可能的影响机制进行进一步的探索,从而为设计合成高效低毒的阿片类镇痛药提供理论基础和设计思路。研究目的:研究A20对于MOR功能的影响及其机制探究,为研究新型镇痛药奠定基础。研究方法:1.利用小鼠热板法甩尾法研究A20对吗啡镇痛、耐受的影响1.1小鼠热板法镇痛模型在小鼠脊髓过表达或敲减A20,通过热板法镇痛模型比较小鼠痛反应时间反映吗啡镇痛程度的变化,评价A20对吗啡镇痛的影响。1.2小鼠热板法慢性耐受模型在小鼠脊髓过表达或敲减A20,通过热板法慢性耐受模型比较小鼠吗啡镇痛作用的下降程度,评价A20对吗啡耐受的影响。1.3小鼠热甩尾法镇痛模型在小鼠脊髓过表达或敲减A20,通过热甩尾法镇痛模型比较小鼠甩尾反应时间反映吗啡镇痛程度的变化,评价A20对吗啡镇痛的影响。1.4小鼠热甩尾法慢性耐受模型在小鼠脊髓过表达或敲减A20,通过热甩尾法慢性耐受模型比较小鼠吗啡镇痛作用的下降程度,评价A20对吗啡耐受的影响。1.5小鼠热板法急性耐受模型在小鼠脊髓过表达A20,通过热板法急性耐受模型比较小鼠吗啡镇痛作用的下降程度,评价A20对吗啡急性耐受的影响。2.A20对于MOR下游AC-c AMP-PKA通路和MOR S375磷酸化的影响2.1 A20对于MOR下游c AMP的影响在MOR-293T细胞中分别过表达、敲减、回转A20蛋白,通过LANCE c AMP Assay和Glo Sensor c AMP Assay检测MOR下游c AMP含量的变化,观察A20对MOR下游c AMP的影响。2.2 A20对于MOR下游Protein kinase A（PKA）重分布的影响在MOR-PKA-GFP-CHO细胞中过表达A20和A20 C103A突变体通过高内涵分析仪器分析荧光PKA在细胞中的重分布现象,观察A20对MOR下游PKA的影响。2.3 A20对MOR S375磷酸化的影响在MOR-CHO细胞中过表达或敲减A20,通过Western blot分析A20对于MOR激动剂引起的S375磷酸化程度的影响。3.A20通过抑制β-arrestin2招募上膜进而影响MOR的内吞机制增强MOR的功能3.1 A20与β-arrestin2相互作用3.1.1免疫共沉淀在293T细胞中过表达β-arrestin2和A20,通过免疫共沉淀检测A20和β-arrestin2的相互作用。3.1.2 His-Pull down在293T细胞中过表达A20蛋白,免疫共沉淀检测A20和His纯化的β-arrestin2相互作用。3.1.3 Nano Bit Assay在293T细胞中过表达带有荧光素酶片段的A20和β-arrestin2蛋白,通过检测体系化学发光的变化研究A20和β-arrestin2相互作用。3.1.4免疫荧光在293T细胞中转染连接不同颜色荧光蛋白的A20和β-arrestin2,通过观察荧光在细胞中的分布,研究A20和β-arrestin2相互作用。3.2 A20对β-arrestin2招募上膜的影响3.2.1高内涵分析在MOR-β-arrestin2-e GFP-CHO细胞中过表达A20,通过高内涵分析带有荧光的β-arrestin2上膜程度观察A20对β-arrestin2招募上膜的影响。3.2.2 Nano Bit Assay在293T细胞中过表达A20和带荧光素酶片段的MOR和β-arrestin2蛋白。通过检测体系化学发光的变化观察A20对β-arrestin2招募上膜的影响。3.3 A20对MOR受体内吞的影响3.3.1荧光抗体标记膜上MOR在SNAP-MOR-CHO细胞中过表达A20,用荧光抗体标记细胞膜上MOR,通过检测细胞荧光值的变化研究A20对MOR内吞的影响。3.3.2分离细胞膜蛋白在小鼠脊髓和SNAP-MOR-CHO细胞中分别过表达A20,分离细胞膜蛋白,通过检测膜上MOR含量的变化,观察A20对MOR内吞的影响。3.4敲减β-arrestin2对于A20功能的影响3.4.1β-arrestin2敲除小鼠在β-arrestin2敲除小鼠脊髓过表达A20蛋白,通过热板法测量吗啡镇痛效果,观察敲除β-arrestin2对A20功能的影响。3.4.2 Glo Sensor c AMP Assay在MOR-293T细胞中敲减β-arrestin2后再过表达A20,或过表达A20后再敲减β-arrestin2,通过Glo Sensor c AMP Assay观察敲减β-arrestin2对A20功能的影响。研究结果:1.A20增强吗啡镇痛,抑制急性耐受但不影响慢性耐受。1.1 A20增强吗啡镇痛作用热板法吗啡镇痛结果显示,过表达A20组小鼠镇痛率均显着高于对照组,A20可以增强吗啡的镇痛作用;敲减A20组小鼠镇痛百分率较对照组出现了一定程度的下降,表明敲减A20可以减弱吗啡的镇痛作用。1.2 A20不影响吗啡慢性耐受的形成热板法和热甩尾法结果显示,过表达或敲减A20后小鼠均形成了吗啡慢性耐受,表明A20对慢性耐受的形成没有影响。1.3 A20抑制吗啡急性耐受的形成热板法实验结果显示,给予大剂量吗啡后,小鼠形成了吗啡急性耐受,过表达A20组小鼠急性耐受程度小于对照组,表明A20可以抑制吗啡急性耐受的形成。2.A20增强MOR下游AC-c AMP-PKA信号通路,抑制S375磷酸化2.1 A20增强MOR对下游c AMP-PKA通路的抑制作用LANCE c AMP Assay和Glo Sensor c AMP Assay实验结果表明,过表达A20可增强MOR对下游c AMP的抑制,敲减A20减弱该抑制作用。PKA重分布实验结果表明,过表达A20可以增强MOR对下游PKA重分布的抑制作用,过表达A20 C103A突变体则无此作用。2.2 A20抑制MOR S375磷酸化实验结果显示,过表达A20后MOR S375磷酸化水平降低,敲减A20后MOR S375磷酸化水平上升。表明A20可以抑制MOR S375磷酸化。3.A20通过抑制β-arrestin2招募上膜进而影响MOR内吞的机制增强MOR的功能。3.1 A20与β-arrestin2存在相互作用免疫共沉淀和Nano Bit Assay实验结果表明,A20和β-arrestin2存在相互作用,并且在激动剂刺激的条件下相互作用进一步增强,免疫荧光实验结果表明在A20和β-arrestin2细胞中具有明显的共定位现象。3.2 A20抑制β-arrestin2招募上膜高内涵分析和Nano Bit Assay实验结果显示,过表达A20组β-arrestin2招募上膜程度明显小于对照组,说明A20可以抑制β-arrestin2招募上膜。3.3 A20抑制MOR内吞荧光抗体标记膜蛋白实验结果显示,过表达A20后,细胞膜表面的MOR数量相比对照组明显增加,说明A20抑制了MOR的内吞作用。3.4敲减β-arrestin2后A20不能影响MOR功能实验结果显示,在动物和细胞中敲减β-arrestin2后,A20都不能再增强MOR的功能。表明A20增强MOR功能需要β-arrestin2参与。研究结论:1.A20增强吗啡的镇痛作用,抑制吗啡急性耐受的形成,但不影响吗啡慢性耐受的形成。2.A20增强MOR由激动剂引起的对下游AC-c AMP-PKA信号通路的抑制作用。3.A20通过与β-arrestin2相互作用,抑制β-arrestin2招募上膜,进而抑制MOR的内吞,提高MOR膜上数量。4.A20需要通过β-arrestin2蛋白影响MOR的功能。
杨二兰[5]（2020）在《马齿苋中儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱的合成及其抗哮喘和抗炎活性研究》文中提出马齿苋（Portulaca oleracea L.）为马齿苋科一年生肉质草本植物,可药食两用,具有清热解毒、凉血止血、止痢的功效。现代药理研究表明马齿苋具有抗菌、抗炎、镇痛、镇静、抗哮喘、舒张骨骼肌、降血脂、降血糖、抗氧化、抗衰老、神经保护等多方面活性。《本草经疏》言马齿苋“能散肺家之热”,以马齿苋为主药,佐以清热化痰之品,可治疗肺脓肿（肺痈）、肺炎、急慢性支气管炎、化脓性支气管炎、小儿百日咳、肺结核咳嗽、慢性咳嗽等肺系病证属痰热壅肺咳喘者,伊朗传统医药记载马齿苋可治疗哮喘等呼吸系统疾病。此外,临床试验及动物实验表明马齿苋具有抗哮喘作用。上述结果提示马齿苋具有抗哮喘应用基础,并具备发现抗哮喘创新药物的潜力,目前马齿苋平喘作用研究仅局限于水煮液,其激动β2-AR抗哮喘活性成分尚不明确,有待深入研究。一、马齿苋中儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱及其衍生物的合成及纯化本课题组前期发现马齿苋中一系列结构新颖的水溶性儿茶酚型异喹啉类生物碱,包括四氢异喹啉类生物碱（Tetrahydroisoquinolines,THIQs）,具有不同程度的体外激动β2-AR和抗炎双功能,推测其可能是马齿苋抗哮喘的潜在药效物质基础。然而,由于这些化合物从天然产物中提取分离所得含量通常很低,造成后续体内药理活性研究无法深入展开,化学合成方法成为制备儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱的关键手段。本文以盐酸多巴胺和醛为反应底物,采用条件温和的磷酸盐介导的Pictet-Spengler反应合成了马齿苋中儿茶酚型四氢异喹啉生物碱1、2、12及其系列衍生物,共14个化合物（1-14）,其中14为新化合物,除产物1、3、4、5、8、12、13外,其余7个生物碱均为首次通过磷酸盐介导的Pictet-Spengler反应仿生合成。由于现存分离纯化方法的局限性,从水溶性反应体系（含磷酸盐、维生素C以及未反应完全的盐酸多巴胺）中大量分离纯化水溶性儿茶酚型THIQs产物成为本实验面临的一个严峻挑战。本实验首次发现利用AB-8大孔吸附树脂柱色谱,首先采用水洗脱可除去磷酸盐和维生素C等水溶性成分,然后采用乙醇洗脱可实现目标THIQs与未反应完全的底物多巴胺的分离,从而制备得到纯化的THIQs。大孔吸附树脂柱色谱法为实现磷酸盐介导的水溶性儿茶酚型THIQs的高效分离纯化提供了一种简便、绿色、环保、通用的新方法。二、马齿苋中儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱抗哮喘活性研究本文利用稳定表达α1B-AR、β1-AR和β2-AR的CHO-K1/Gα15中国仓鼠卵巢细胞模型,分别以肾上腺素和异丙肾上腺素作为阳性激动药物,通过钙流检测,考察了马齿苋中儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱及本实验合成的衍生物在100 μM时对β2-AR的激动作用及其对α1B-AR、β1-AR和β2-AR的选择性,并探讨了构效关系。首次发现12具有很强的β2-AR激活作用,但其对β1-AR亚型亦具有较好的激动活性;化合物2及本课题组前期制备的马齿苋酰胺E（oleracein E,OE）为选择性β2-AR激动剂,其对α1B-AR、β1-AR的作用弱。在此基础上,本文利用磷酸组胺诱导的豚鼠离体气管螺旋条收缩模型,发现马齿苋中β2-AR激动剂12、2和OE能够剂量依赖性地舒张气管,其解痉百分率的EC50值分别为0.8、2.8和7.0 μM,12、2和OE在低浓度时的气管舒张作用可被β受体阻断剂盐酸普萘洛尔阻断。上述三个化合物按照摩尔比1:1:1混合时在低浓度范围内（0.01 μM～1 μM）可协同止痉,作用强于单个化合物,但在高浓度（大于1 μM）时可能产生竞争性抑制,提示马齿苋抗哮喘作用可能是儿茶酚型异喹啉类生物碱协同作用的结果。本文进一步利用超声雾化组胺诱导的豚鼠化学刺激性急性哮喘气道痉挛模型,发现12在10、20、40 mg/Kg时能剂量依赖性地显着延长豚鼠的引喘潜伏期（p<0.05,p<0.01,p<0.01）,而且抽搐跌倒的豚鼠只数呈剂量依赖性下降趋势。2仅在高浓度（40、80 mg/Kg）时能剂量依赖性地显着延长豚鼠的引喘潜伏期（p<0.01）,OE仅在高浓度（80、160mg/Kg）时能剂量依赖性地显着降低豚鼠的引喘潜伏期（p<0.05,p<0.01）,2和OE对豚鼠抽搐跌倒的只数影响很小或无作用。上述结果表明马齿苋中的儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱对组胺喷雾致豚鼠哮喘模型具有抗气道痉挛作用,其作用强弱依次为12>2>OE,与12、2、OE在组胺诱导的豚鼠离体气管螺旋条平滑肌收缩模型中的支气管舒张作用强弱一致。进一步地,本文利用卵白蛋白（OVA）诱导的过敏性哮喘小鼠气道炎症模型,发现12虽然有剂量依赖性降低血液中嗜酸性粒细胞的趋势,但各剂量组与OVA模型组相比均无显着性差异（p>0.05）。12仅在高剂量80 mg/Kg具有抗气道炎症作用,其显着降低了过敏性哮喘小鼠BALF上清液中IL-1β、IL-5、IL-13含量（p<0.05 或p<0.01）,分别降低了 34.64%、23.40%、37.63%,但对 BALF 中 TNF-α的含量无显着性影响（p>0.05）;中低剂量（5、20mg/Kg）的12无抗炎作用（p>0.05）。三、马齿苋中儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱12和2对脂多糖诱导脓毒症小鼠模型的抗炎活性研究本文通过测定血浆中NO、IL-6以及TNF-α以及BALF中IL-6、TNF-α等炎性因子指标,进一步评价了马齿苋中具有平喘作用的儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱12、2是否对LPS诱导脓毒症小鼠模型具有抗炎作用。结果表明,单剂量腹腔注射LPS会造成昆明小鼠眼睑分泌物增多、精神萎靡、活动减少,与空白对照组相比,两次造模的脓毒症小鼠模型血浆NO（p<0.05或p<0.0001）、TNF-α（p<0.0001）和 IL-6（p<0.0001）以及 BALF 上清液中 TNF-α（p<0.01）和 IL-6（p<0.01或p<0.05）炎性因子水平均显着升高。各剂量12组对脓毒症小鼠血浆NO的过量释放均无显着影响（p>0.05）。12仅在高剂量80 mg/Kg时显着降低了脓毒症小鼠血浆和 BALF 中 TNF-α（p<0.01,p<0.05）以及 IL-6（p<0.01,p<0.05）的含量,分别降低了 65.16%、56.54%、73.53%和54.75%;但中低剂量的12均无显着影响（p>0.05）。中低剂量的2对脓毒症小鼠血浆和BALF上清液中TNF-α和IL-6的含量均无显着影响（p>0.05）,2仅在高剂量（80 mg/Kg）显着降低了血浆和BALF中 TNF-α（p<0.01,p<0.05）以及 IL-6（p<0.05,p<0.05）的含量,分别降低了48.57%、54.62%、46.65%、62.09%。上述结果表明 12 和 2 在 80 mg/Kg 时对 LPS诱导的脓毒症小鼠具有一定抗炎作用。
张艺馨[6]（2020）在《ABIN-1及Hsp90对吗啡药理学作用的影响及机制研究》文中研究说明吗啡是目前常用于治疗疼痛的阿片类药物,具有镇痛、镇静的作用,但长期使用会使人产生药物耐受、药物依赖等副作用,造成阿片类药物成瘾及滥用的现象,不仅制约了其在临床上的应用,更对社会公共安全造成严重的危害。因此,如何趋利避害地使用吗啡成为亟待解决的问题。研究发现阿片类药物发挥作用的主要靶点为μ阿片受体（μopioid receptor,MOR）。经典的理论认为,阿片类药物作用于MOR主要激活下游两条信号通路,包括:G蛋白依赖信号通路和β-arrestin依赖信号通路。当阿片类药物作用于MOR时,使得受体构象发生变化,G蛋白被招募上膜进而激活G蛋白依赖的信号通路,继而抑制下游AC-c AMP信号通路发挥镇痛作用;与此同时,β-arrestin信号通路亦被激活,受体被激酶磷酸化,招募β-arrestins上膜触发受体内吞,该信号通路被认为与阿片类药物耐受及呼吸抑制等副反应相关。随着研究的深入,人们发现许多MOR相互作用蛋白可通过调节MOR信号通路进而影响阿片类药物的耐受与依赖,这提示我们可通过寻找MOR相互作用蛋白的方式,研究MOR的功能调节蛋白,为寻求调节阿片类药物镇痛耐受的药物靶标提供理论依据。基于此,实验室前期建立了吗啡依赖的大鼠脑c DNA文库,通过细菌双杂交技术筛选到19个可能与MOR相互作用的蛋白,这些蛋白与MOR的相互作用可能会影响MOR功能,具有成为有效药物靶标的潜能。其中ABIN-1（A20 binding inhibitors of NF-κB activation）和Hsp90β（Heat shock protein 90β）引起我们的密切关注。ABIN-1是炎症反应的调控分子,而炎症与疼痛关系密切。实验室前期发现ABIN-1可与MOR相互作用,并在吗啡依赖的相关脑区中表达增加,这说明ABIN-1可能调节吗啡耐受及依赖;而Hsp90β是Hsp90亚型之一,参与和调控许多生理学功能,有文献报道Hsp90抑制剂17-AAG对吗啡镇痛具有调节作用,这提示Hsp90β可能参与17-AAG对吗啡功能的调节作用。因此,本论文选取ABIN-1和Hsp90β作为目标蛋白,研究ABIN-1和Hsp90β对吗啡耐受及依赖功能的影响及机制,旨在寻找具有调节阿片类药物耐受及依赖作用的药物新靶点。研究目的 明确ABIN-1和Hsp90β对吗啡耐受及依赖功能的影响及相关机制,为寻找具有调节阿片类药物耐受及依赖功能的药物新靶点提供理论基础。研究思路与方法 1.ABIN-1对吗啡耐受依赖功能的影响及其机制研究1.1.ABIN-1对吗啡耐受及依赖功能的影响:小鼠脑室或相关脑区注射AAV-ABIN-1/AAV-ABIN-1-sh RNA过表达或敲减ABIN-1。采用热板（55℃）模型研究ABIN-1对吗啡耐受的影响;纳洛酮催促戒断模型研究ABIN-1对吗啡躯体依赖戒断的影响;条件位置偏爱模型研究ABIN-1对吗啡精神依赖的影响。1.2.ABIN-1调节吗啡耐受的机制研究1.2.1.ABIN-1对MOR的β-arrestin信号通路的影响:在MOR-CHO及MOR-ABIN-1-CHO细胞中,观察阿片受体激动剂对MOR磷酸化及内吞、ERK磷酸化的影响;在MOR-β-arrestin2-GFP-CHO细胞中瞬转ABIN-1,共聚焦高内涵实验观察ABIN-1对β-arrestin2招募的影响;1.2.2.ABIN-1对β-arrestin2蛋白表达的影响:HEK293细胞中过表达ABIN-1和β-arrestin2,采用免疫荧光及免疫共沉淀确证两者相互作用及ABIN-1对β-arrestin2泛素化的影响;小鼠脑组织或Neuro-2a（N2A）细胞中过表达ABIN-1,通过免疫组化或免疫印迹法观察其对β-arrestin2蛋白表达的影响;1.2.3.ABIN-1在β-arrestin2敲除小鼠中对吗啡耐受的影响:在β-arrestin2敲除小鼠脑内注射AAV-ABIN-1/AAV-ABIN-1-sh RNA,采用热板（55℃）模型研究ABIN-1对吗啡耐受的影响。1.3.ABIN-1与MOR相互作用结构功能域的研究1.3.1.ABIN-1突变体的构建:构建ABIN-1突变体ABIN-1-AHD1-DEL、ABIN-1-AHD2-DEL、ABIN-1-AHD3-DEL、ABIN-1-AHD4-DEL、AHD2-EGFP,并将质粒瞬转至HEK293细胞检测其蛋白表达;1.3.2.ABIN-1与MOR相互作用的结构功能域:采用免疫共沉淀方法研究ABIN-1与MOR相互作用的结构功能域;采用同源模建和分子动力学模拟,进一步验证及模拟ABIN-1关键区域与MOR相互作用的氨基酸位点;MOR-CHO细胞中过表达ABIN-1突变体,观察在阿片受体激动剂作用下其对MOR磷酸化的影响;1.3.3.ABIN-1关键结构功能域对吗啡耐受功能的影响:将关键结构功能域合成透膜小肽,采用脑室给药在热板（55℃）模型观察其对吗啡耐受的影响。2.Hsp90对吗啡耐受依赖功能的影响及其机制的研究2.1.Hsp90抑制剂17-AAG对吗啡耐受及依赖功能的影响:小鼠侧脑室注射Hsp90抑制剂17-AAG、geldanamycin（格尔德霉素）,采用热板法（55℃）检测其对吗啡耐受的影响;首次吗啡给药30 min后取半脑组织检测MOR下游信号分子的变化;纳洛酮催促戒断模型研究其对吗啡躯体依赖戒断的影响;条件位置偏爱模型中研究其对吗啡精神依赖的影响。2.2.Hsp90β对MOR功能的调节2.2.1.Hsp90β与MOR相互作用的验证:在SH-SY5Y细胞及瞬时转染Hsp90与MOR的HEK293细胞中,采用免疫荧光及免疫共沉淀确证两者相互作用;2.2.2.Hsp90β对MOR信号通路的影响:HEK293细胞中过表达Hsp90β和MOR,观察其对激动剂作用后胞内c AMP含量的影响;PKAcat-EGFP-MOR-CHO细胞中过表达Hsp90β,采用共聚焦高内涵成像检测激动剂作用后其对PKA活性的影响;MOR-CHO细胞中过表达Hsp90β,观察DAMGO作用后对MOR磷酸化及内吞、PKA磷酸化、ERK磷酸化、JNK磷酸化、CREB磷酸化的影响;研究结果:1.ABIN-1对吗啡耐受依赖功能的影响及其机制的研究1.1 ABIN-1对吗啡耐受及依赖功能的影响吗啡（10 mg/kg,s.c.）耐受的热板结果显示,脑内过表达ABIN-1对小鼠基础痛阈无影响,但与对照组相比,ABIN-1过表达在第一、三、五天显着增加吗啡镇痛百分率,降低吗啡耐受（Day 1:P=0.0194,Day 3:P=0.0051,Day 5:P=0.0325,F（1,7）=71.75,P<0.0001）;吗啡耐受小鼠皮下注射纳洛酮（10 mg/kg,i.p.）催促戒断结果显示,与对照组相比,ABIN-1过表达使小鼠跳跃次数显着降低,即缓解吗啡躯体依赖症状（P=0.0081）;条件位置偏爱实验结果显示ABIN-1过表达显着减少小鼠在伴药箱中停留时间,抑制吗啡诱导的条件偏爱行为（P=0.0092）;吗啡耐受的热板结果显示,脑内下调ABIN-1降低吗啡镇痛百分率（Day 1:P=0.0032,Day 3:P=0.0004,Day 5:P=0.0156,F（1,8）=15.39,P<0.0044）,增加小鼠戒断反应跳跃次数（P=0.0022）,并延长小鼠在伴药箱停留时间（P=0.0323）,与过表达ABIN-1影响一致。海马脑区过表达ABIN-1对小鼠基础痛阈无影响,但与对照相比显着增加吗啡镇痛百分率,降低吗啡耐受（Day 1:P=0.0253,Day 3:P=0.0050,F（1,7）=75.95,P=0.0142）,并减少纳洛酮诱导的跳跃反应,缓解躯体依赖症状（P=0.0437）;海马脑区中敲减ABIN-1显着降低吗啡镇痛百分率（Day1:P=0.0057,Day 3:P=0.0010,F（1,6）=12.27,P=0.0128）,增加纳洛酮诱导的跳跃反应（P=0.0056）。伏隔核脑区过表达ABIN-1显着增加小鼠基础痛阈（Day 3:P=0.0350,Day 7:P=0.0145,F（1,7）=10.98,P=0.0129）,增加吗啡镇痛百分率从而降低吗啡耐受（Day 3:P=0.0170,Day 5:P=0.0195,Day 7:P=0.0443）并减少纳洛酮诱导的跳跃反应,减弱躯体依赖症状（P=0.0415）;伏隔核脑区中敲减ABIN-1显着降低小鼠基础痛阈（Day 1:P=0.0002,Day 3:P=0.0076,Day 5:P=0.0008,Day 7:P=0.0053,F（1,6）=201.7,P<0.0001）,降低吗啡镇痛百分率（Day 3:P=0.0262,Day 5:P=0.0099,Day 7:P=0.0041）,增加纳洛酮诱导的跳跃反应（P=0.0454）,使躯体依赖症状加重。前扣带回皮层脑区敲减ABIN-1,对小鼠基础痛阈及吗啡镇痛百分率、纳洛酮诱导的跳跃反应无明显影响（P>0.05）。1.2 ABIN-1调节吗啡耐受的机制研究1.2.1 ABIN-1对MOR的β-arrestin信号通路的影响:MOR-CHO细胞中过表达ABIN-1显着降低DAMGO（10μM）或吗啡（10μM）诱导的MOR磷酸化及ERK磷酸化水平;共聚焦高内涵结果显示在MOR-β-arrestin2-GFP-CHO过表达ABIN-1,无论在有无DAMGO或吗啡处理后,均显着促进β-arrestin2由细胞质向细胞膜转位（P<0.05）;MOR膜蛋白提取结果显示,MOR-CHO细胞或吗啡依赖的小鼠海马脑组织中过表达ABIN-1显着增加膜上MOR蛋白表达量（P<0.05）;1.2.2 ABIN-1对β-arrestin2蛋白表达的影响:免疫荧光及免疫共沉淀结果提示,ABIN-1与β-arresin2存在相互作用,DAMGO（10μM）作用30 min加强两者相互作用,且过表达ABIN-1增加β-arresin2泛素化水平（P<0.05）;免疫印迹及免疫组化结果表明,N2A细胞或吗啡依赖的小鼠海马脑组织中过表达ABIN-1显着降低β-arresin2蛋白表达量（P<0.05）;1.2.3 ABIN-1在β-arrestin2敲除小鼠中对吗啡耐受功能的影响:β-arrestin2敲除小鼠脑内过表达或敲减ABIN-1对小鼠基础痛阈、吗啡镇痛百分率无影响。1.3 ABIN-1与MOR结构功能域的探究1.3.1 ABIN-1突变体的构建:测序比对及免疫印迹结果表明,ABIN-1-AHD1-DEL、ABIN-1-AHD2-DEL、ABIN-1-AHD3-DEL、ABIN-1-AHD4-DEL突变体构建成功,可用于实验;1.3.2 ABIN-1与MOR相互作用的结构功能域:免疫共沉淀实验结果显示,ABIN-1-AHD2-DEL与MOR无相互作用,而ABIN-1-AHD1-DEL、ABIN-1-AHD3-DEL、ABIN-1-AHD4-DEL与MOR仍存在相互作用;MOR蛋白与AHD2多肽复合物分子动力学模拟结果提示,AHD2的Leu462-Asp472段残基结合在MOR蛋白口袋中,Phe473-Arg482段则贴在口袋外侧的蛋白表面,AHD2多肽通过氢键、盐桥、π-阳离子和疏水作用等相互作用与MOR蛋白紧密结合;免疫共沉淀结果表明AHD2与MOR存在相互作用,且AHD2可与β-arrestin2相互作用;AHD2抑制激动剂作用后MOR磷酸化（P<0.05）,但强度弱于ABIN-1全长;1.3.3 ABIN-1关键区域对吗啡耐受功能的影响:合成TAT-AHD2-FITC穿模肽,以TAT-AHD3-FITC做阴性对照。在吗啡热板模型中发现,与TAT-AHD3-FITC（5 nmol）相比,TAT-AHD2-FITC（5 nmol）对小鼠基础痛阈无影响,但明显增加吗啡镇痛百分率,抑制吗啡耐受（Day 1:P=0.0058,Day 5:P=0.0039,Day 7:P=0.1747,F（1,9）=46.58,P<0.0001）,该作用与侧脑室AAV-ABIN-1过表达结果一致。2.Hsp90对吗啡耐受依赖功能的影响及机制研究2.1 Hsp90抑制剂17-AAG对吗啡耐受及依赖功能的影响侧脑室注射17-AAG、geldanamycin各10 nmol/5μl,吗啡（10 mg/kg,s.c.）给药30 min后热板结果显示17-AAG、geldanamycin明显抑制吗啡急性镇痛作用（P<0.05）;小鼠半脑组织取材后发现,17-AAG降低ERK、CREB磷酸化水平,增加PKA、JNK磷酸化水平;吗啡（100 mg/kg,s.c.）连续给药7天后热板结果显示,与溶媒组相比,17-AAG在第一天显着降低吗啡的镇痛百分率（P<0.05）,在第三、五、七天吗啡镇痛百分率下降减缓,减弱吗啡耐受;纳洛酮（10 mg/kg,i.p.）催促戒断结果显示17-AAG显着降低戒断症状,减弱吗啡诱导的躯体依赖程度（P<0.05）;条件位置偏爱结果显示17-AAG（10 nmol/5μl）显着减弱小鼠在伴药箱中停留的时间,减弱吗啡诱导的精神依赖程度（P<0.05）。2.2 Hsp90β对MOR功能的调节2.2.1 Hsp90β与MOR相互作用的验证:免疫荧光及免疫共沉淀实验表明,Hsp90β与MOR存在相互作用,吗啡（10μM）作用30 min后两者相互作用增强17-AAG（1μM）预处理6 h,阻断Hsp90β与MOR相互作用,而Hsp90α与MOR无相互作用;2.2.2 Hsp90β对MOR信号通路的影响:HEK293细胞中过表达Hsp90β,增强DAMGO（10μM）或吗啡（10μM）对AC-c AMP通路的抑制作用,使Forskolin（FSK,10μM）增加的c AMP含量明显下降（P<0.05）;17AAG（1μM）预处理6 h后,c AMP含量明显回升（P<0.05）;共聚焦高内涵成像结果显示,Hsp90β抑制PKA活性,表现为PKAcat-EGFP聚集颗粒面积较对照明显增强（P<0.01）;MOR-CHO细胞中过表达Hsp90β显着增加DAMGO（10μM）诱导的MOR磷酸化,在5、15 min有显着的统计差异（P<0.05）,17-AAG（1μM）预处理6 h能逆转这种现象,抑制phos Ser375水平;免疫荧光及细胞膜蛋白提取结果提示,过表达Hsp90β显着增加DAMGO（10μM）诱导的受体内吞,减少膜上受体含量（P<0.05）;MOR-CHO细胞中过表达Hsp90β显着增加DAMGO（10μM）诱导的ERK磷酸化、CREB磷酸化水平而降低JNK磷酸化、PKA磷酸化水平（P<0.05）。结论:1.中枢过表达ABIN-1缓解吗啡耐受及依赖,其机制可能是ABIN-1与β-arrestin2形成复合物通过促进β-arrestin2泛素化降低其蛋白表达量,同时也增加其招募上膜,从而影响MOR的β-arrestin信号通路,降低受体磷酸化及内吞,减弱吗啡耐受。此外,ABIN-1通过AHD2发挥对吗啡耐受功能的调节作用。2.Hsp90具有增加吗啡急性镇痛的作用,且可加重吗啡耐受及依赖,其机制可能不同。Hsp90影响镇痛的机制可能是通过Hsp90β与MOR相互作用,调节MOR的G蛋白信号通路,抑制胞内c AMP的产生而增强吗啡镇痛作用;Hsp90影响吗啡耐受及依赖的机制可能是通过Hsp90β与MOR相互作用,调节MOR的β-arrestin依赖的信号通路,促进受体磷酸化及内吞,加重吗啡耐受和依赖。
林小龙[7]（2020）在《2-（2-苯并呋喃基）-2-咪唑啉在急性脊髓损伤大鼠模型中的神经保护作用及其机制研究》文中进行了进一步梳理第一部分2-（2-苯并呋喃基）-2-咪唑啉在脊髓损伤大鼠模型中的作用目的:既往研究表明2-（2-苯并呋喃基）-2-咪唑啉（2-（-2-benzofuranyl）-2-imidazoline,2-BFI）在多种病理生理过程中参与抗氧化、抗炎症、抗凋亡。但是2-BFI在脊髓损伤模型中的作用尚不清楚。因此本实验采用钳夹法建立脊髓损伤（spinalcord injury,SCI）大鼠模型并利用该模型探讨2-BFI在脊髓损伤大鼠模型中潜在作用。方法:实验用成年雄性SD大鼠随机分为3组:（1）假手术组（Sham组）;（2）对照组（SCI+vehicle组）;（3）实验组（SCI+2-BFI组）。参照既往文献,建立了脊髓损伤大鼠实验模型。将大鼠麻醉后俯卧位固定置于专用手术台上。取后正中切口,从T10椎板到T12椎板行椎板切除术,充分暴露脊髓。假手术组仅仅行T10-T12椎板切除术,暴露脊髓而不引起脊髓损伤为标准。对照组及实验组大鼠利用70g闭合力Yasargil动脉瘤夹钳夹脊髓60秒,损伤成功的指标包括局部脊髓出现红肿、压迫后双后肢立即抽动、大鼠清醒时双侧后肢麻痹。药物注射（2-BFI腹腔注射3 mg/kg或0.9%生理盐水,每日2次,共3日）由一名对实验分组不熟悉的研究人员进行。所有大鼠在造模后第1、2、3、7、14、21天进行神经功能评估。神经功能评估采用BBB（Basso、Beattie and Bresnahan）神经功能评分量表,评分范围从0分到21分。结果:SCI大鼠运动神经功能采用BBB运动能力评定量表进行评定。假手术组术后即刻、术后1-3天、7天、14天、21天得分均为21分。在SCI发生后第1天,对照组和实验组的BBB运动能力评分均迅速下降,分别为0.17±0.41及0.17±0.41,相对于假手术组,两组的BBB评分呈显着性下降（p<0.05）,但两组之间并无统计学差异（P>0.05）。虽然在SCI发生后第3天,实验组的BBB评分高于对照组,分别为2.00±1.09及1.33±0.82,但两组之间仍无统计学差异（P>0.05）。但在SCI发生后第7天,实验组的BBB评分则高于对照组,且两者差异存在统计学意义（分别为4.33±0.52及3.33±0.52,p<0.05）。同样的结果也出现在SCI发生后第14天,实验组的BBB评分明显高于对照组（6.17±0.98及4.67±0.822,p<0.05）。将观察期延迟到SCI发生后的第21天,实验组的BBB评分明显大于对照组,且两组之间的差距更加明显（8.00±1.10及 6.17±0.98,p<0.01）。结论:通过2-BFI处理后SCI大鼠的BBB评分明显高于对照组,说明腹腔注射2-BFI（3mg/kg）后可显着改善SCI后BBB神经功能评分,在脊髓损伤大鼠模型中具有神经保护作用。第二部分 2-（2-苯并呋喃基）-2-咪唑啉在脊髓损伤大鼠模型中的神经保护作用机制目的:本部分实验采用钳夹法建立脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）大鼠模型并利用该模型证实 2-（2-苯并呋喃基）-2-咪唑啉（2-（-2-benzofuranyl）-2-imidazoline,2-BFI）对脊髓损伤大鼠的神经保护作用,并探讨2-BFI神经保护作用机制。方法:根据第一部分实验结论的进一步延续,采用动脉瘤夹钳夹脊髓的方法造模。实验用成年雄性SD大鼠随机分为3组:（1）假手术组（Sham组）;（2）对照组（SCI+vehicle组）;（3）实验组（SCI+2-BFI组）。SCI+vehicle组大鼠腹腔注射0.9%生理盐水,每日2次,共3日;SCI+2-BFI组大鼠腹腔注射2-BFI溶液,剂量为3 mg/kg,每日2次,共3日。药物注射由一名对实验分组不熟悉的研究人员进行。假手术组仅仅行T10-T12椎板切除术,暴露脊髓而不引起脊髓损伤为标准。在脊髓损伤后第3天,所有大鼠均行腹腔注射戊巴比妥钠（100mg/kg）深度麻醉并处死。损伤部位周围脊髓组织立即取出并置于冰面上用200m14℃0.9%生理盐水灌洗。Western blot检测Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白。使用ELISA试剂盒,对脊髓组织样本中超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性进行检测。FJB染色和TUNEL染色检测损伤部位周围脊髓组织的细胞坏死和凋亡。结果:与假手术组相比,对照组SOD和GPx活性均明显降低（P<0.01）。同时,SOD和GPx活性在使用2-BFI后明显升高（P<0.05）。脊髓损伤大鼠脊髓组织中Bax蛋白及cleaved caspase-3蛋白水平（p 19和p 17）明显升高,Bcl-2蛋白水平明显降低（P<0.01和P<0.05）。而2-BFI的应用显着提高了 SCI后Bcl-2蛋白水平（P<0.01）,Bax蛋白和cleaved caspase-3蛋白水平（p19和p17）都被下调。与此同时,对照组与假手术组相比,Bcl-2/Bax比值在SCI后明显降低,而在使用2-BFI后,实验组较对照组Bcl-2/Bax比值明显升高（P<0.01）。假手术组脊髓切片未见FJB阳性或TUNEL阳性细胞,然而在对照组中可见大量FJB阳性细胞和TUNEL阳性细胞,使用2-BFI治疗后FJB阳性细胞和TUNEL 阳性细胞数量显着降低（P<0.05和P<0.01）。结论:2-BFI的应用上调SOD和GPx的活性,上调Bcl-2蛋白的表达,下调Bax蛋白和cleaved caspase3（p17和p19）蛋白的表达,进一步证实其神经保护作用。此外,FJB染色和TUNEL染色显示细胞坏死和凋亡水平降低也佐证了 2-BFI的神经保护作用。综上所述,这些结果提示2-BFI可能通过抑制氧化应激反应和细胞凋亡坏死来减轻脊髓损伤,从而提高脊髓损伤后的功能恢复。第三部分 2-（2-苯并呋喃基）-2-咪唑啉在脊髓损伤大鼠模型中神经保护作用的调节机制目的:本部分实验采用钳夹法建立脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）大鼠模型并利用该模型证实 2-（2-苯并呋喃基）-2-咪唑啉（2-（-2-benzofuranyl）-2-imidazoline,2-BFI）是否通过激活核转录因子-E2相关因子/血红素加氧酶（Nrf2/HO-1）信号通路,引起下游抗氧化、抗凋亡相应蛋白变化从而保护神经细胞。方法:根据第二部分实验结果的进一步延续,采用动脉瘤夹钳夹脊髓的方法造模。实验用成年雄性SD大鼠随机分为3组:（1）假手术组（Sham组）;（2）对照组（SCI+vehicle组）;（3）实验组（SCI+2-BFI组）。对照组大鼠腹腔注射0.9%生理盐水,每日2次,共3日;实验组大鼠腹腔注射2-BFI溶液,剂量为3mg/kg,每日2次,共3日。药物注射由一名对实验分组不熟悉的研究人员进行。假手术组仅仅行T10-T12椎板切除术,暴露脊髓而不引起脊髓损伤为标准。在脊髓损伤后第3天,所有大鼠均行腹腔注射戊巴比妥钠（100mg/kg）深度麻醉并处死。损伤部位周围脊髓组织立即取出并置于冰面上用200ml4℃0.9%生理盐水灌洗。Westernblot检测Nrf2、HO-1和NQO1蛋白。利用免疫荧光染色技术定位Nrf2蛋白,观察损伤部位周围脊髓组织神经元细胞和星形胶质细胞中的Nrf2表达量变化。结果:与假手术组相比,对照组和实验组脊髓组织中无论Nrf2蛋白还是HO-1蛋白都有明显升高（P<0.01）,而与假手术组相比,对照组NQO1蛋白表达降低（P<0.01）。此外,与对照组相比,实验组Nrf2和HO-1进一步显着升高（P<0.01）。但对照组与实验组NQO1表达差异无统计学意义（P>0.05）。免疫荧光染色显示,Nrf2蛋白无论在神经元细胞还是星形胶质细胞中的表达,对照组及实验组均显着高于假手术组（P<0.01）。此外,实验组神经元细胞内、星形胶质细胞内Nrf2水平明显高于对照组（P<0.01）。结论:脊髓损伤后2-BFI处理增加了 Nrf2蛋白和HO-1蛋白的表达,表明2-BFI可激活Nrf2/HO-1信号保护脊髓损伤后的神经细胞。总之,这些结果为2-BFI通过激活Nrf2/HO-1信号通路减轻脊髓损伤,提高脊髓损伤后的功能恢复提供了有力证据。
曹铮[8]（2020）在《G蛋白偶联受体介导的蛋白激酶C激活及其下游信号通路机制研究》文中研究说明20世纪80年代,蛋白激酶C（PKC）因其作为一种二酰甘油敏感的酶,同时也是强效促肿瘤因子佛波酯的“受体”而引起人们的广泛关注。PKC的发现解决了科学界长达25年的疑问,即促进脂质水解的激动剂是怎样去改变细胞生理活动的。PKC属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族,其活性的控制是通过自抑制假底物的可逆释放来实现的。G蛋白偶联受体（GPCRs）在激动剂的作用下,可以将胞外信号传递至胞内,引发一系列生理活动,其中尤为重要的一个方面就是可以通过PKC激活胞外信号调节激酶（ERK1/2）,从而调节细胞分化、有丝分裂、增殖等,甚至是一些异常的生理过程,如肿瘤的发生等。因此,进行GPCRs介导的蛋白激酶C激活机制及其下游信号通路机制的探究尤为重要。首先,本文的研究用生物信息学的方法在刺参（Apostichopus japonicus）基因组数据信息中挖掘得到Kisspeptin及其受体的相关基因,并进行功能性鉴定和研究分析。编码AjKiss前体的基因可以翻译得到一条长为180个氨基酸的前体肽,可以进一步水解产生两条成熟的C末端酰胺化多肽,即AjKiss1a（32个氨基酸）和AjKiss1b（18个氨基酸）。另外,两个AjKiss受体（AjKissR1和AjKissR2）的cDNA序列信息在A.japonicus的基因组中被找到并在卵巢组织中被克隆得到。功能性实验分析结果表明,AjKissR1和AjKissR2均能很好地表达和定位在HEK293T细胞的细胞膜上,并在AjKiss1a和AjKiss1b的作用下可以快速动员胞内钙离子,但呈现一定的配体选择性（AjKiss1a倾向作用于AjKissR2,AjKiss1b倾向作用于AjKissR1）。此外,AjKissR1/2在AjKiss1a/b的作用下,都能发生明显内吞,以及介导Gαq-PLC依赖的信号通路途径。进一步的研究发现,AjKiss1b的C末端核心10肽片段,即AjKiss1b-10,均能激活AjKissR1/2,引起受体内吞发生,以及Gαq-PLC依赖的Ca2+信号通路和ERK1/2信号通路的激活。在AjKiss1b-10的作用下,AjKissR1和AjKissR2均能通过Gαq-PLC-Ca2+/PKC信号通路激活ERK1/2,另外,AjKissR1还能够偶联Gαi/o并通过Gβγ依赖的方式激活PKCε,进而对ERK1/2的激活做出贡献。其次,本文的研究在先前工作（家蚕CAPAPVK受体相关研究）的基础上首次发现了可变剪接产生的天然剪接变体BomCAPAPVK-R1△341是CAPA-PK的特异性受体。BomCAPAPVK-R1基因由七个外显子组成,其中第七个外显子的丢失致使C末端截短的剪接变体△341的产生。C末端的截短不仅影响了△341的膜定位,同时也影响了GRKs依赖的受体内吞发生。之前我们关于R1的研究表明,和常见的GPCRs剪接变体类似,△341可以作为负调节蛋白对野生型受体R1的膜定位和功能等方面产生影响,但其本身并不能被CAPA-PVKs激活。而在本研究中,我们惊喜地发现△341能被另一相近家族神经肽CAPA-PK特异性激活。进一步的功能性实验分析结果表明,不同于Gαq偶联的野生型受体R1,△341是通过偶联Gαi/o来介导腺苷酸环化酶的抑制和胞内cAMP的下调,以及通过Gβγ-PI3K-PKCζ信号通路来介导ERK1/2的磷酸化。综上所述,本文的研究发现首次揭示了Kisspeptin神经肽信号系统在非脊索动物物种中的存在和功能,并探究了其可能介导信号通路机制,为下丘脑神经分泌系统的古老起源提供了有力证据,也为无脊椎动物神经肽相关的研究提供了重要的参考。而对天然剪接变体△341的研究则为在家蚕中区分CAPA-PK和CAPA-PVK神经肽信号系统的作用提供了有力的证据,进一步说明了单个GPCR基因能够产生多种结构和功能上更为独特的蛋白亚型,明确了之前未被承认的GPCRs剪接变体的重要地位,为更好地理解GPCRs剪接变体在生理和病理研究中的重要意义提供了有力证据。
王进[9]（2020）在《以多巴胺受体D1为靶点筛选中药中的抗帕金森病的活性成分》文中认为帕金森病（Parkinson’s Disease,PD）是常见的神经退行性疾病。发病率随着年龄的增长而显着增加,大部分PD患者为散发病例（与遗传没有明显的联系称为“散发性”帕金森病）,仅有不到10%的PD患者有家族史。PD的临床特征主要为表现为运动性障碍,病理特征主要表现为中脑黑质致密部（SNC）中的多巴胺（dopamine,DA）能神经元的缺失和路易小体的形成。导致这些病理症状的原因仍不清楚,据研究表明,DA神经元死亡与线粒体功能障碍、氧化应激和蛋白聚集异常有关,可能是遗传基因突变和环境刺激共同作用的结果。目前临床常用于治疗PD的药物为DA的前体物质左旋多巴。然而,其副作用并不可控,包括:不自主运动、失语症、肌张力障碍和半昏迷等,同时,PD的常见症状并不能完全消除。因此,改进药物治疗效果和降低非目标效应是目前PD治疗中亟待解决的问题。特异性提高DA系统的功能是目前PD治疗的主要方法。临床上通常单独使用或与其他药物联合使用多巴胺受体（dopamine receptor,DAR）激动剂,以改善PD患者的生活质量。DAR分为D1-like（D1和D5）和D2-like（D2、D3和D4）两类,都为G蛋白偶联受体（G Protein-Coupled Receptors,GPCRs）家族成员,由七次跨膜结构构成3个胞外环和3个胞内环构成。其中D1在纹状体的分布最广、密度最高,可能对PD的调控作用最为显着。研究表明,激活D1可上调细胞外调节蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases,ERK1/2）磷酸化水平,而激活DA能神经元中ERK通路可减弱神经退行性疾病中神经毒素对DA能神经元的损伤,提示D1激动剂可能是有前景的PD治疗药物。我国拥有丰富的中药资源,但中药作用靶点不明确问题限制了其开发和利用。本研究成功构建了以D1为靶点的药物筛选系统,并在前期对传统益智安神中药中有效成分分离提取和初步鉴定的基础上,筛选了22种源于大黄、天麻等植物药成分及中科院昆明植物研究所提供的化合物单体,发现大黄酚对D1具有强激活作用。且大黄酚通过激活D1通路可以发挥抵抗神经细胞凋亡的功能。本研究为开发以D1为靶点的抗PD药物提供了数据支持,也为中药中有效成分通过D1发挥神经保护作用的机制提供了新的思路和研究平台。
张胜婷[10]（2019）在《基于荧光标记G蛋白偶联受体细胞模型的环境雌激素检测及新药筛选研究》文中研究说明G蛋白偶联受体（G protein coupled receptors,GPCRs）是细胞表面最重要的受体之一,它涉及到一系列细胞的代谢和信号传导过程,与许多重大疾病相关,同时也是许多环境激素的靶点,也是药物开发的重要靶点。目前利用GPCRs也开发了一些的检测和药物筛选技术和方法,但它们都存在敏感性不高、自动化程度低等缺点,因此如何利用不同受体的特点开发特异性强、灵敏性高和稳定性好的检测和筛选技术是我们亟待解决的问题。本论文为更好地避免N末端标记可能会对受体配件结合的影响,通过基因工程技术构建以绿色荧光蛋白（Green fluorescence protein,GFP）标记受体C末端的重组细胞系的策略,以期最大限度地降低融合蛋白对受体与配体结合的影响;又利用高内涵筛选（High Content Screening,HCS）技术,建立起可对样品进行可视化和自动化的检测和筛选系统。首先,论文选择将绿色荧光蛋白（tGFP）直接标记在雌激素受体α（Estrogen Receptorα,ERα）受体的C末端的重组细胞系构建策略。首先构建了ERα/pCMV6穿梭质粒,其中含CMV真核启动,而SV40 ori是真核复制起始子。成功构建的质粒经转染导入人骨肉瘤细胞U2OS中获得了稳定的转染细胞株ERα/U2OS,其个体大、形态完整,非常有利于后期开展高内涵检测体系的建立。研究证明新构建的细胞系能与雌二醇（Estrogen 2,E2）产生特异性的反应产生荧光聚集现象,通过与高内涵技术相结合还定量分析了细胞模型对E2反应的参数,研究表明其EC50为0.1 nM,也能被抑制剂他莫西酚（TAM）所抑制,IC50为1.5 nM,该方法对E2检测的下限接近1x10-33 nM,初步满足了环境中部分污染物中E2类样品的生物学效应检测要求;同时对人工混合样品的检测表明其只能专一性地检测E2或其类似物,表明该系统可以用于将来对环境样品中E2或其类似的检测。其次,为了筛选天然产物中的活性成分,避免受体N端修饰后对活性的潜在干扰,我们构建了C末端用tGFP标记的hGLP-1R-tGFP/U2OS重组细胞系,经Exendin 4激活GLP-1受体后,观察到荧光斑点出现在细胞膜上,并随后内化形成细胞内的荧光聚集体（囊泡）,结合高含量筛选（HCS）技术定量分析重组细胞中在激动剂刺激下标记的荧光受体从聚集、内化、脱敏和复敏的过程。证实了hGLP-1R-tGFP/U2OS对GLP-1及其类似物的高活性、敏感性和特异性,这一活性可被GLP-1R的特异性拮抗剂Exendin9-39所阻断。同时研究也表明,在重组细胞系中GLP-1通路的下游,腺苷酸环化酶的激活和细胞cAMP水平的升高并没有受到C末端修饰的影响,表明该方法也可以进一步用于其它GPCR信号通路的研究。结合HCS技术的自动图像采集和数据处理系统,我们建立一种全新的GLP-1活性成分筛选检测的方法,利用该方法对云南省药物研究所提供的约100份中药粗提物进行了筛选,结果表明,黄芪、三七提取物均具有GLP-1R激动剂活性,部分粗提物中具有调节剂和抑制剂的成分,为从中药中寻找新糖尿病药物提供了重要参考。最后,为解析P2Y1R的信号传导通路,我们构建了直接受体标记和间接标记b-arrestin的两个细胞系hP2Y1R-tGFP/U2OS和hP2Y1R-?-AR2-tGFP/U2OS。研究表明:虽然两个细胞系都可被100?M的ADP激活形成荧光囊泡,并可通过高内涵技术进行自动的记录和分析,但二者表现又有所不同,其形成最大荧光值的时间分别为15和20 min,EC50值分别为35.72和71.8 nM。所有的反应都可以被特异性拮抗剂MRS2179所阻断。证明了P2Y1R途径是通过耦合Gq蛋白质而激活PKC途径进而激活磷脂酰胆碱具体的PLC,最后由磷脂酶D启动?-arrestin2介导的信号通路。这两个细胞系实现受体的再敏化时间显然不同,分别为30和45 min。这些研究首次证明了P2Y1R不仅可通过异源三聚体Gq途径,也可以通过β-arrestin2途径激活和引发下游的信号传导。本论文通过构建荧光标记不同受体的细胞模型并结合高内涵技术建立了一个对天然样品进行检测或筛选的平台。这个平台能够与靶标高亲和力特异性的结合,与传统检测/筛选方法相比,具有靶标范围广、可视化、特异强、自动化、稳定性高等特点,因而可望在将来广泛被用于环境雌激素的检测以及糖尿病和心血管疾病的天然药物筛选及受体信号通路的研究等领域。
二、REVERSIBLE BINGING OF NEW SYNTHESIZED OPIOID RECEPTOR LIGANDS TO CLONED OPIOID RECEPTORS STABLY EXPRESSED IN CHO CELL AND IDENTIFICAITON OF STIMULATING OPIOID RECEPTOR SUBTYPE（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、REVERSIBLE BINGING OF NEW SYNTHESIZED OPIOID RECEPTOR LIGANDS TO CLONED OPIOID RECEPTORS STABLY EXPRESSED IN CHO CELL AND IDENTIFICAITON OF STIMULATING OPIOID RECEPTOR SUBTYPE（论文提纲范文）
（2）局麻药过敏的回顾性分析及MRGPRX2参与类过敏反应肥大细胞脱颗粒的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 临床研究 局麻药过敏的回顾性分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 基础研究 |
| 第一部分 稳定过表达MRGPRX2细胞模型用于评价麻醉药物潜在的类过敏作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 MRGPRX2参与吗啡诱导肥大细胞脱颗粒的机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 MRGPRX2在类过敏反应中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）4’-氨基取代苯蒂巴因类似物生物活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 疼痛 |
| 1.2 阿片类镇痛药 |
| 1.2.1 阿片类镇痛药概述 |
| 1.2.2 阿片类镇痛药分类 |
| 1.2.3 阿片类镇痛药副作用 |
| 1.3 阿片受体的分类 |
| 1.3.1 阿片受体概述 |
| 1.3.2 μ阿片受体 |
| 1.3.3 δ阿片受体 |
| 1.3.4 κ阿片受体 |
| 1.4 α,14α-内亚乙基氨苯基蒂巴因κ配基设计、合成 |
| 1.4.1 “信使”与“位码” |
| 1.4.2 6α,14α-内亚乙基氨苯基蒂巴因系列化合物设计、合成 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 材料与试剂 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 阿片受体细胞株的构建 |
| 2.2.2 细胞传代培养 |
| 2.2.3 细胞计数 |
| 2.2.4 细胞复苏 |
| 2.2.5 细胞冻存 |
| 2.2.6 细胞膜蛋白的制备 |
| 2.2.7 BCA蛋白浓度测定试剂盒测蛋白浓度 |
| 2.2.8 放射性配体-受体竞争结合实验 |
| 2.2.9 [35S]GTPγS结合实验 |
| 2.2.10 热板实验 |
| 2.2.11 醋酸扭体实验 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 稳定表达μ、κ、δ阿片受体的CHO细胞大规模培养 |
| 3.2 化合物对阿片受体的亲和力和选择性 |
| 3.2.1 选择性配基与阿片受体的亲和力 |
| 3.2.2 4'-氨基取代苯蒂巴因类似物对μ、δ、κ阿片受体的亲和力 |
| 3.3 [~(35)S]GTPγS实验测定候选化合物对偶联G蛋白的激活作用 |
| 3.3.1 选择性配基对μ、δ、κ阿片受体G蛋白的激动能力 |
| 3.3.2 4'-氨基取代苯蒂巴因类似物对μ、δ、κ阿片受体偶联G蛋白的激动能力 |
| 3.4 候选化合物在不同镇痛模型中的镇痛作用 |
| 3.4.1 候选化合物4j在热板实验中是否有镇痛作用 |
| 3.4.2 候选化合物4j在醋酸扭体实验中是否有镇痛作用 |
| 3.5 计算机分子对接模拟 |
| 3.5.1 候选化合物与μ阿片受体的分子对接 |
| 3.5.2 候选化合物与κ阿片受体的分子对接 |
| 3.5.3 选择性配体U50,488与κ阿片受体的分子对接 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 候选化合物4j对κ阿片受体的亲和力和选择性 |
| 4.2 候选化合物4j在镇痛模型上的的镇痛效果 |
| 4.3 新型κ阿片受体激动剂的开发前景 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 选择性κ阿片受体激动剂 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
（4）A20增强吗啡镇痛机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 A20对于吗啡镇痛、耐受的影响 |
| 一、引言 |
| 二、实验材料 |
| 三、实验方法 |
| 1.过表达A20腺相关病毒构建(西贝宏程公司完成) |
| 2.敲减A20腺相关病毒构建 |
| 3.腺相关病毒鞘内注射 |
| 4.小鼠镇痛、耐受模型 |
| 5.脊髓组织全蛋白提取 |
| 6.BCA蛋白定量 |
| 7.小鼠灌流固定取材 |
| 8.免疫荧光 |
| 9.脊髓组织炎性因子RT-PCR检测 |
| 10.数据分析 |
| 四、实验结果 |
| 1.过表达A20腺相关病毒的构建 |
| 2.敲减A20腺相关病毒的构建 |
| 3.过表达A20腺相关病毒在小鼠脊髓表达结果 |
| 4.敲减A20 蛋白结果Western blot验证 |
| 5.小鼠热板法镇痛模型上过表达A20增强吗啡镇痛 |
| 6.小鼠热板法镇痛模型上过表达A20不影响吗啡慢性耐受 |
| 7.小鼠热甩尾法镇痛模型上过表达A20增强吗啡镇痛 |
| 8.小鼠热甩尾法耐受模型上过表达A20不影响吗啡慢性耐受 |
| 9.小鼠热板法镇痛模型上敲减A20减弱吗啡镇痛 |
| 10.小鼠热板法耐受模型上敲减A20不影响吗啡慢性耐受 |
| 11.小鼠热甩尾法镇痛模型上敲减A20减弱吗啡镇痛 |
| 12.小鼠热甩尾法耐受模型上敲减A20不影响吗啡慢性耐受 |
| 13.小鼠热板法急性耐受模型过表达A20减弱吗啡急性耐受 |
| 14.过表达A20不影响小鼠脊髓炎性蛋白的表达 |
| 五、本章小结 |
| 第二章 A20对MOR磷酸化以及下游信号通路的影响 |
| 一、引言 |
| 二、实验材料 |
| 三、实验方法 |
| 1.siRNA序列筛选 |
| 2.LANCE cAMP Assay |
| 3.Glo Sensor cAMP Assay |
| 4.PKA重分布实验 |
| 5.A20 对于MOR的 S375 位点和ERK1/2 磷酸化的影响 |
| 6.数据分析 |
| 四、实验结果 |
| 1.过表达A20 增强MOR的功能(LANCE,Glo Sensor) |
| 2.过表达A20对DOR,KOR功能无影响(LANCE) |
| 3.siRNA序列筛选 |
| 4.敲减A20 减弱MOR的功能(Glo Sensor) |
| 5.检测敲减A20 后再回转A20对MOR功能的影响(Glo Sensor) |
| 6.过表达A20 C103A突变体不影响MOR的功能(Glo Sensor) |
| 7.过表达A20 增强MOR的功能(PKA) |
| 8.过表达A20 C103A突变体不影响MOR的功能(PKA) |
| 9.过表达A20降低MORS375磷酸化水平 |
| 10.敲减A20增强MORS375磷酸化水平 |
| 五、本章小结 |
| 第三章 A20 通过β-arrestin2 影响MOR受体内吞 |
| 一、引言 |
| 二、实验材料 |
| 三、实验方法 |
| 1.质粒构建 |
| 2.免疫共沉淀 |
| 3.His-Pull down |
| 4.Nano Bit assay |
| 5.免疫荧光检测A20和β-arrestin2 相互作用 |
| 6.高内涵检测β-arrestin2 招募 |
| 7.Nano Bit assay检测β-arrestin2 招募 |
| 8.荧光抗体标记膜上MOR检测内吞 |
| 9.膜分离检测MOR内吞 |
| 10.膜分离检测吗啡耐受小鼠脊髓MOR变化 |
| 11.A20 对于β-arrestin2 基因敲除小鼠MOR功能的影响 |
| 12.敲减β-arrestin2后A20对MOR功能的影响(Glo Sensor) |
| 13.数据分析 |
| 四、实验结果 |
| 1.pcDNA-3.0-Flag-β-arrestin2 质粒构建 |
| 2.A20和β-arrestin2 存在相互作用(免疫共沉淀) |
| 3.His-β-arrestin2 蛋白表达纯化 |
| 4.A20和β-arrestin2 相互作用(His-Pull down) |
| 5.Nano BiT Assay相关质粒构建 |
| 6.A20和β-arrestin2 相互作用(Nano BiT) |
| 7.A20和β-arrestin2 共定位(免疫荧光实验) |
| 8.A20 抑制β-arrestin2 招募(高内涵分析) |
| 9.A20 抑制β-arrestin2 招募(Nano Bit) |
| 10.A20抑制MOR内吞(荧光抗体标记膜蛋白) |
| 11.A20抑制MOR内吞(细胞膜分离) |
| 12.A20提高小鼠耐受后脊髓细胞膜MOR含量 |
| 13.A20 不影响β-arrestin2 敲除小鼠的吗啡镇痛 |
| 14.在β-arrestin2 敲减后A20 不能影响MOR的功能 |
| 五、本章小结 |
| 讨论与展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 主要简历 |
| 致谢 |
（5）马齿苋中儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱的合成及其抗哮喘和抗炎活性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 四氢异喹啉类生物碱的生物活性研究进展 |
| 1.1.1 抗肿瘤活性 |
| 1.1.2 抗病原微生物活性 |
| 1.1.3 抗炎作用 |
| 1.1.4 激动β_2肾上腺素受体和扩张支气管作用 |
| 1.1.5 中枢神经系统作用 |
| 1.1.6 治疗糖尿病 |
| 1.2 本课题立题依据与研究内容 |
| 1.2.1 哮喘等气道慢性炎症性疾病是危害人类健康的常见病和多发病 |
| 1.2.2 扩张支气管和抗炎是治疗哮喘等气道慢性炎症性疾病的两大策略 |
| 1.2.3 肾上腺素受体概况及β_2-AR激动剂扩张支气管的作用机制 |
| 1.2.4 马齿苋具有治疗哮喘等呼吸系统炎症疾病的应用基础,其激动β2-AR抗哮喘活性成分有待深入研究 |
| 参考文献 |
| 第二章 马齿苋中儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱及其衍生物的合成及纯化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验试剂 |
| 2.4 实验步骤 |
| 2.4.1 儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱(1-14)的合成 |
| 2.4.2 儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱(1-14)的分离纯化 |
| 2.5 实验结果 |
| 2.5.1 儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱(1-14)的合成 |
| 2.5.2 化合物结构鉴定 |
| 2.5.3 AB-8大孔吸附树脂柱色谱法制备儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱的洗脱工艺研究 |
| 2.6 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 马齿苋中儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱抗哮喘活性研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 马齿苋中儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱及其衍生物对肾上腺素受体的活性筛选及其构效关系研究 |
| 3.2.1 实验原理 |
| 3.2.2 实验步骤 |
| 3.2.3 实验结果 |
| 3.3 马齿苋中儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱12、2以及OE对组胺诱导豚鼠离体气管平滑肌收缩模型的影响 |
| 3.3.1 实验动物 |
| 3.3.2 仪器 |
| 3.3.3 试剂 |
| 3.3.4 主要试剂的配制 |
| 3.3.5 实验步骤 |
| 3.3.6 实验结果 |
| 3.4 马齿苋提取液(WEAPS)以及儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱12、2、OE对组胺致豚鼠哮喘模型气道痉挛的影响 |
| 3.4.1 实验步骤 |
| 3.4.2 数据处理 |
| 3.4.3 实验结果 |
| 3.5 儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱12对卵白蛋白诱导过敏性哮喘小鼠模型气道炎症的影响 |
| 3.5.1 实验动物 |
| 3.5.2 仪器 |
| 3.5.3 试剂 |
| 3.5.4 实验溶液配制 |
| 3.5.5 动物分组及给药 |
| 3.5.6 小鼠血液、支气管肺泡灌洗液的制备 |
| 3.5.7 小鼠BALF上清液TNF-α含量测定 |
| 3.5.8 小鼠BALF上清液IL-1β含量测定 |
| 3.5.9 小鼠BALF上清液IL-5含量测定 |
| 3.5.10 小鼠BALF上清液IL-13含量测定 |
| 3.5.11 数据处理 |
| 3.5.12 实验结果 |
| 3.6 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 马齿苋中儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱12和2对脂多糖诱导脓毒症小鼠模型的抗炎活性研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 仪器 |
| 4.2.3 试剂 |
| 4.3 实验内容 |
| 4.3.1 试剂配制 |
| 4.3.2 动物分组及给药 |
| 4.3.3 小鼠血浆、支气管肺泡灌洗液的制备 |
| 4.3.4 小鼠血浆一氧化氮含量测定 |
| 4.3.5 小鼠血浆TNF-α含量测定 |
| 4.3.6 小鼠血浆IL-6含量测定 |
| 4.3.7 小鼠BALF上清液TNF-α含量测定 |
| 4.3.8 小鼠BALF上清液IL-6含量测定 |
| 4.4 数据处理 |
| 4.5 实验结果 |
| 4.5.1 儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱12对LPS诱导脓毒症小鼠的影响 |
| 4.5.2 儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱2对LPS诱导脓毒症小鼠的影响 |
| 4.6 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士研究生期间发表的论文 |
| 附录 |
| 附录1: 第二章附表 |
| 附录2: 第三章附表 |
| 附录3: 第四章附表 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（6）ABIN-1及Hsp90对吗啡药理学作用的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 ABIN-1对吗啡耐受依赖功能的影响及其机制研究 |
| 第一节 ABIN-1对吗啡耐受及依赖功能的影响 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 .实验动物 |
| 1.2 .腺相关病毒 |
| 1.3 .实验药品与试剂 |
| 1.4 .实验仪器 |
| 1.5 .溶液配制 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 .ABIN-1腺相关病毒的构建及筛选验证 |
| 2.2 .ABIN-1腺相关病毒注射 |
| 2.3 .热板实验 |
| 2.4 .纳洛酮催促戒断实验 |
| 2.5 .条件位置偏爱实验 |
| 2.6 .自发活动 |
| 2.7 .脑片切片验证 |
| 2.8 .RNA的提取及实时定量PCR |
| 3.数据处理 |
| 4.实验结果 |
| 4.1 .ABIN-1重组腺相关病毒筛选 |
| 4.2 .ABIN-1重组腺相关病毒注射位置及干扰效率的验证 |
| 4.3 .ABIN-1过表达对吗啡耐受及依赖的影响 |
| 4.4 .ABIN-1敲减对吗啡耐受及依赖的影响 |
| 4.5 .ABIN-1在不同脑区上调或下调对吗啡耐受的影响 |
| 5.小结 |
| 第二节 ABIN-1调节吗啡耐受的机制研究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 .实验动物 |
| 1.2 .实验细胞株 |
| 1.3 .细菌菌株和质粒 |
| 1.4 .实验试剂 |
| 1.4.1. 细胞培养试剂 |
| 1.4.2. 细胞转染试剂 |
| 1.4.3. 分子生物学试剂 |
| 1.4.4. 蛋白检测所需试剂 |
| 1.4.5. 实验药品 |
| 1.4.6 .主要抗体 |
| 1.5 .实验仪器 |
| 1.6 .溶液配制 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 .细胞培养相关实验 |
| 2.2 .免疫印迹 |
| 2.3 .免疫共沉淀 |
| 2.4 .磷酸化实验 |
| 2.5 . β-arrestin2 招募实验 |
| 2.6 .泛素化实验 |
| 2.7 .免疫荧光 |
| 2.8 .热板实验 |
| 2.9 .组织/细胞膜蛋白及全蛋白提取 |
| 2.10 .免疫组化 |
| 3.数据处理 |
| 4.实验结果 |
| 4.1 .ABIN-1对MOR磷酸化的影响 |
| 4.2 .ABIN-1对β-arrestin2 招募的影响 |
| 4.3 .ABIN-1对MOR内吞的影响 |
| 4.4 .ABIN-1对ERK磷酸化的影响 |
| 4.5 .ABIN-1与β-arrestin2 相互作用 |
| 4.6 .ABIN-1对β-arrestin2 泛素化的影响 |
| 4.7 .ABIN-1对β-arrestin2 蛋白表达的影响 |
| 4.8 .ABIN-1在β-arrestin2 敲除鼠上对吗啡耐受的影响 |
| 5.小结 |
| 第三节 ABIN-1与MOR相互作用的结构功能域 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 .细胞株 |
| 1.2 .细菌菌株和质粒 |
| 1.3 .实验试剂 |
| 1.4 .实验仪器 |
| 1.5 .溶液配制 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 .ABIN-1突变体真核过表达质粒的构建 |
| 2.2 .细胞培养相关实验 |
| 2.3 .免疫印迹 |
| 2.4 .免疫共沉淀 |
| 2.5 .磷酸化实验 |
| 2.6 .分子模建 |
| 3.数据处理 |
| 4.实验结果 |
| 4.1 .ABIN-1及MOR瞬转细胞后蛋白表达验证 |
| 4.2 .ABIN-1突变体真核过表达质粒构建及验证 |
| 4.3 .ABIN-1 突变体与MOR相互作用的验证 |
| 4.4 .AHD2对MOR磷酸化的影响 |
| 4.5 .AHD2对吗啡耐受的影响 |
| 5.小结 |
| 讨论与展望 |
| 第二章 Hsp90对吗啡耐受依赖功能的影响及其机制研究 |
| 第一节 Hsp90抑制剂对吗啡耐受及依赖的影响 |
| 第二节 Hsp90调节吗啡镇痛耐受的机制研究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 .细胞株 |
| 1.2 .细菌菌株和质粒 |
| 1.3 .实验试剂 |
| 1.4 .实验仪器 |
| 1.5 .溶液配制 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 .细胞培养相关实验 |
| 2.2 .免疫印迹 |
| 2.3 .免疫共沉淀 |
| 2.4 .磷酸化实验 |
| 2.5 .免疫荧光 |
| 2.6 .受体内吞实验 |
| 2.7 .PKA重分布实验 |
| 2.8 .cAMP含量测定 |
| 3.数据处理 |
| 4.实验结果 |
| 4.1 .Hsp90β与 MOR相互作用 |
| 4.2 .Hsp90β对激动剂作用MOR后 G蛋白依赖信号通路的影响 |
| 4.3 .Hsp90β对激动剂作用MOR后 β-arrestin依赖的信号通路的影响 |
| 4.4 .Hsp90β对 MOR激活受体后信号分子的影响 |
| 5.小结 |
| 讨论与展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 主要简历 |
| 致谢 |
| 附件 |
（7）2-（2-苯并呋喃基）-2-咪唑啉在急性脊髓损伤大鼠模型中的神经保护作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 咪唑啉受体(IR)的研究进展 |
| 1.2.1 咪唑啉受体(IR)的简介 |
| 1.2.2 咪唑啉受体(I_2R)的简介 |
| 1.2.3 咪唑啉I_2受体与神经保护功能的关系 |
| 1.3 Nrf2参与中枢神经系统保护作用 |
| 1.4 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 第二章 2-(2-苯并呋喃基)-2-咪唑啉在脊髓损伤大鼠模型中的作用 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 钳夹法脊髓损伤大鼠模型成功建立 |
| 2.3.2 2-BFI的应用有助于脊髓损伤大鼠神经功能恢复 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 2-(2-苯并呋喃基)-2-咪唑啉在脊髓损伤大鼠模型中的作用机制 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 实验所使用的试剂及生产厂家 |
| 3.2.3 实验所使用的主要仪器和生产厂家 |
| 3.2.4 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 2-BFI增加脊髓损伤局部组织抗氧化酶活性 |
| 3.3.2 2-BFI增加脊髓损伤组织抗凋亡水平,抑制细胞坏死 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 2-(2-苯并呋喃基)-2-咪唑啉在脊髓损伤大鼠模型中神经保护作用的调节机制 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 实验所使用的试剂及生产厂家 |
| 4.2.3 实验所使用的主要仪器和生产厂家 |
| 4.2.4 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 2-BFI通过激活核转录因子-E2相关因子/血红素加氧酶(Nr2/HO-1)信号通路保护神经 |
| 4.3.2 2-BFI在神经元细胞及星形胶质细胞内激活核转录因子-E2相关因子/血红素加氧酶(Nrf2/HO-1)信号通路保护神经 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 研究的不足之处 |
| 5.3 展望 |
| 综述（一） 脊髄损伤动物模型 |
| 参考文献 |
| 综述（二） 咪唑啉受体（IR）的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述（三） Nrf2通路研究概况 |
| 参考文献 |
| 英汉主要缩略词表 |
| 在读期间撰写论文及科研情况 |
| 致谢 |
（8）G蛋白偶联受体介导的蛋白激酶C激活及其下游信号通路机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 GPCRs的激活和调节 |
| 1.3 GPCRs介导的Ca~(2+)和PKC信号通路 |
| 1.4 PKC的发现 |
| 1.4.1 蛋白激酶C的结构域组成 |
| 1.4.2 PKC的成熟 |
| 1.4.3 PKC的可逆活化 |
| 1.4.4 PKC的下调 |
| 1.4.5 PKC的下游底物 |
| 1.5 GPCRs诱导的ERK激活:依赖PKC和不依赖PKC的通路 |
| 参考文献 |
| 第二章 PKC-EGFP转位系统的构建与测试 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 PKC-GFP质粒改造 |
| 2.3.2 更多PKC亚型的克隆与载体的构建 |
| 2.3.3 PKC-EGFP活细胞成像检测 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 刺参Kisspeptins受体通过PKC介导的ERK1/2 信号通路活化机制研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 刺参(A.japonicus)Kisspeptin系统 |
| 3.3.2 Apoja KpRs及其配体的功能性鉴定 |
| 3.3.3 Apoja KpRs配体结合力差异鉴定 |
| 3.3.4 Apoja KpRs偶联Gαq介导下游信号通路 |
| 3.3.5 AjKiss1b-10 激活Apoja KpRs并介导下游信号通路 |
| 3.3.6 AjKiss1b-10 激活Apoja KpRs介导ERK1/2 磷酸化机制不同 |
| 3.3.7 AjKiss1b-10 激活Apoja KpRs并介导PKC活化 |
| 3.3.8 Apoja Kisspeptin系统和脊椎动物Kisspeptin系统的交互作用 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 家蚕神经肽CAPA-PVK受体可变剪接体介导的ERK1/2 磷酸化机制研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 Bom CAPA-PVK-R1 天然剪接突变体△341 的产生 |
| 4.3.2 剪接突变体△341 在细胞中的表达 |
| 4.3.3 △341 能够被CAPA-PK激活 |
| 4.3.4 剪接突变体△341 偶联Gαi/o介导下游信号通路 |
| 4.3.5 剪接突变体△341 通过Gβγ介导下游ERK1/2 信号通路 |
| 4.3.6 剪接突变体△341 通过PKCζ介导下游ERK1/2 信号通路 |
| 4.3.7 剪接突变体△341 通过PI3K介导下游ERK1/2 信号通路 |
| 4.3.8 缺少C末端,剪接突变体△341 激动剂引起的内吞受损 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 全文总结 |
| 5.1 主要研究成果 |
| 5.2 本文创新点 |
| 5.3 本文的后续研究及展望 |
| 作者简介 |
（9）以多巴胺受体D1为靶点筛选中药中的抗帕金森病的活性成分（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 PD的病理特征 |
| 1.2 PD与多巴胺系统 |
| 1.2.1 神经递质DA在PD中显着降低 |
| 1.2.2 遗传因素导致的DA系统水平异常降低与PD紧密关联 |
| 1.2.3 环境因素导致的DA系统功能低下是PD的重要诱因 |
| 1.3 G蛋白偶联受体是最重要的药物靶点 |
| 1.3.1 G蛋白偶联受体分类及配体识别 |
| 1.3.2 G蛋白偶联受体信号转导通路 |
| 1.4 多巴胺能系统与神经保护 |
| 1.4.1 大脑中的DA起源及投射途径 |
| 1.4.2 多巴胺受体 |
| 1.5 中药中的活性成分筛选、靶点发现和药理学研究是中药现代化的必经之路 |
| 1.5.1 中药分类 |
| 1.5.2 中药活性成分发现及筛选技术 |
| 1.5.3 中药药物靶点分类 |
| 1.5.4 与神经保护相关的中药活性成分 |
| 1.6 论文研究意义 |
| 第二章 多巴胺受体D_1过表达载体的构建 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 载体和菌种 |
| 2.1.2 仪器和设备 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 实验试剂配方 |
| 2.2 实验内容 |
| 2.2.1 构建多巴胺受体D_1表达载体质粒 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 PCR产物的验证 |
| 2.3.2 p MD?19-T-D_1 的菌落PCR验证 |
| 2.3.3 pMD?19-T-D_1的测序 |
| 2.3.4 pc DNA5/FRT/TO-VSV-Glu R5-D_1 菌的落PCR验证 |
| 2.3.5 pc DNA5/FRT/TO-VSV-Glu R5-D_1 的测序 |
| 2.3.6 pc DNA5/FRT/TO-VSV-Glu R5-D_1-turquiose的测序 |
| 2.3.7 pc DNA5/FRT/TO-VSV-Glu R5-D_1-flash-turquiose的测序 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 多巴胺受体D_1诱导表达稳定细胞株的构建及验证 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验用细胞 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 仪器与设备 |
| 3.1.4 试剂的配方 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞的复苏 |
| 3.2.2 细胞的培养 |
| 3.2.3 细胞的传代 |
| 3.2.4 细胞的冻存 |
| 3.2.5 活细胞计数 |
| 3.2.6 细胞转染 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 D_1瞬时表达检测 |
| 3.3.2 D_1最佳诱导浓度检测 |
| 3.3.3 Western Blotting检测细胞中激动剂对诱导表达D_1 介导的ERK磷酸化水平的影响 |
| 3.4 小结 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 D_1诱导表达稳定细胞株对中药成分的筛选 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验细胞 |
| 4.1.2 实验仪器和设备 |
| 4.1.3 实验试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 中药有效成分的获取 |
| 4.2.2 复苏细胞 |
| 4.2.3 培养细胞 |
| 4.2.4 Western blot |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 检测市售激动剂对D_1稳定细胞株介导的ERK磷酸化水平的影响 |
| 4.3.2 细胞水平上检测中药中的有效成分对D_1介导的ERK信号通路的作用 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 D_1探针诱导表达稳定细胞株的构建及验证 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验细胞 |
| 5.1.2 实验仪器和设备 |
| 5.1.3 实验试剂 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 利用FRET技术检测D_1-flash-turquiose分子探针活性 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 检测D_1-flash-turquiose分子探针稳定细胞株荧光表达情况 |
| 5.3.2 检测D_1-flash-turquiose分子探针稳定细胞株灵敏度 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A (攻读学位其间发表论文目录) |
| 附录 B |
（10）基于荧光标记G蛋白偶联受体细胞模型的环境雌激素检测及新药筛选研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 G蛋白偶联受体 |
| 1.1.1 G蛋白偶联受体(GPCRS)的分类 |
| 1.1.2 重要的生物效应靶标 |
| 1.1.3 G蛋白偶联受体(GPCR)的信号传导 |
| 1.1.4 G蛋白偶联受体(GPCR)研究热点 |
| 1.2 高内涵筛选技术及其应用 |
| 1.2.1 高内涵筛选技术在检测中的应用 |
| 1.2.2 高内涵技术在分子机制研究中的应用 |
| 1.2.3 高内涵靶向药物筛选技术 |
| 1.3 环境激素及其检测 |
| 1.3.1 环境及环境污染的定义及种类 |
| 1.3.2 化学污染物及其分类 |
| 1.3.3 环境荷尔蒙 |
| 1.3.4 环境雌激素及其危害 |
| 1.4 天然产物(中药)活性成分的筛选技术 |
| 1.4.1 天然产物的高通量筛选技术 |
| 1.4.2 基于GPCRs的新药筛选 |
| 1.4.3 药物HCS分析用于中药和天然药物现代化的优势 |
| 1.5 研究内容与技术路线 |
| 1.5.1 研究内容 |
| 1.5.2 研究路线 |
| 1.6 论文的意义 |
| 第二章 ERα荧光标记细胞系的建立及雌激素的检测 |
| 2.1 重组质粒的构建 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.3 结果 |
| 2.2 稳定转染ERα的 U2OS细胞系建立 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.2.3 结果 |
| 2.3 ERα受体激动剂的高通量筛选模型建立 |
| 2.3.1 材料 |
| 2.3.2 方法 |
| 2.3.3 结果 |
| 2.4 本章总结与讨论 |
| 第三章 荧光标记GLP-1R高内涵细胞筛选平台的建立及天然活性成分的筛选 |
| 3.1 重组pCMV6-GFP-GLP-1R质粒的构建 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.3 结果 |
| 3.1.4 小结 |
| 3.2 稳定转染pCMV6-GFP-GLP-1R的 U2OS细胞系的建立 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.2.3 结果 |
| 3.2.4 小结 |
| 3.3 重组细胞hGLP-1R-tGFP高内涵药物筛选体系的建立 |
| 3.3.1 材料 |
| 3.3.2 方法 |
| 3.3.3 结果 |
| 3.3.4 小结 |
| 3.4 基于高内涵系统GLP-1R/U2OS对天然产物活性成分的初筛 |
| 3.4.1 材料 |
| 3.4.2 方法 |
| 3.4.3 结果 |
| 3.4.4 小结 |
| 3.5 本章总结与讨论 |
| 第四章 基于荧光标记P2Y1R高内涵系统对P2Y1 信号通路的解析 |
| 4.1 重组质粒p CMV6-t GFP-P2Y1、p CMV6-t GFP-barresin2 和p S100024-P2Y1R的构建 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.1.3 结果 |
| 4.1.4 小结 |
| 4.2 p CMV6-t GFP- P2Y1R、barresin2 和p S100024-P2Y1R细胞系的构建 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 方法 |
| 4.2.3 结果 |
| 4.2.4 小结 |
| 4.3 P2Y1R受体、配体相互作用机制及信号通路的解析 |
| 4.3.1 材料 |
| 4.3.2 方法 |
| 4.3.3 结果 |
| 4.3.4 小结 |
| 4.4 本章总结与讨论 |
| 第五章 总结及展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 论文的创新性 |
| 5.3 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A攻读博士期间取得的科研成果及奖励 |
四、REVERSIBLE BINGING OF NEW SYNTHESIZED OPIOID RECEPTOR LIGANDS TO CLONED OPIOID RECEPTORS STABLY EXPRESSED IN CHO CELL AND IDENTIFICAITON OF STIMULATING OPIOID RECEPTOR SUBTYPE（论文参考文献）
- [1]蒂巴因衍生物的镇痛作用研究[D]. 叶荣荣. 上海应用技术大学, 2021
- [2]局麻药过敏的回顾性分析及MRGPRX2参与类过敏反应肥大细胞脱颗粒的机制研究[D]. 左君. 北京协和医学院, 2021
- [3]4’-氨基取代苯蒂巴因类似物生物活性研究[D]. 蒋爽. 南京中医药大学, 2021
- [4]A20增强吗啡镇痛机制研究[D]. 邵帅. 军事科学院, 2020(02)
- [5]马齿苋中儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱的合成及其抗哮喘和抗炎活性研究[D]. 杨二兰. 山东大学, 2020
- [6]ABIN-1及Hsp90对吗啡药理学作用的影响及机制研究[D]. 张艺馨. 军事科学院, 2020(02)
- [7]2-（2-苯并呋喃基）-2-咪唑啉在急性脊髓损伤大鼠模型中的神经保护作用及其机制研究[D]. 林小龙. 苏州大学, 2020(06)
- [8]G蛋白偶联受体介导的蛋白激酶C激活及其下游信号通路机制研究[D]. 曹铮. 浙江大学, 2020(08)
- [9]以多巴胺受体D1为靶点筛选中药中的抗帕金森病的活性成分[D]. 王进. 昆明理工大学, 2020(05)
- [10]基于荧光标记G蛋白偶联受体细胞模型的环境雌激素检测及新药筛选研究[D]. 张胜婷. 昆明理工大学, 2019(06)