一、弓形虫主要表膜P30抗原的纯化与鉴定（论文文献综述）
薛杨继[1]（2021）在《刚地弓形虫LAMP-LFD检测方法的建立、初步应用及抗弓形虫SAG1纳米抗体的制备、分析》文中研究说明刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种专性细胞内寄生原虫,可导致人畜共患病弓形虫病,又称弓体病。弓形虫病呈世界性分布,据报道全球约三分之一的人口血清弓形虫抗体阳性。一项分析显示,我国普通人群弓形虫抗体阳性率为8.20%。普通人感染弓形虫多为自限性,少部分出现亚临床症状,此后长期呈隐匿性感染状态。但免疫抑制患者如肿瘤、艾滋等病人可导致不良预后。孕妇感染后可经胎盘传给婴儿导致先天性弓形虫病,严重者可导致流产、死胎。现我国孕妇优生优育产前TORCH五项检测中已包含弓形虫抗体检测。但弓形虫抗体检测无法准确的判断现状感染情况,为疾病的诊断与干预治疗带来不便。因此,开发具有诊断价值的弓形虫循环DNA和循环抗原（Circulating antigen,CAg）的检测方法显得尤为重要。本研究分别从弓形虫的循环DNA分子检测和循环抗原的免疫检测两部分进行探究。弓形虫的分子检测,主要以B1、529-RE（Repeat element）等多拷贝基因为靶点。其中529-RE在弓形虫基因组中有200-300拷贝数而被认为是最优的检测靶点。新型的环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）可在1小时内将数个拷贝扩增至109,而被认为是一种可替代PCR扩增技术的高效分子扩增检测技术。本研究采用环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）和侧流试纸条（Lateral-flow-dipstick）结合,设计成为LAMP-LFD一体化核酸扩增检测装置。LAMP-LFD装置将常规LAMP扩增产物与核酸探针杂交,使分子产物检测转化为胶体金免疫检测,同时具有良好的密闭性而有效避免气溶胶污染,探索一种更为简单、高效、特异的弓形虫分子检测方法。弓形虫的抗原检测,主要以免疫学方法筛选制备特异性抗体检测膜表面抗原等弓形虫中丰都较高的靶标。弓形虫膜表面抗原1（Surface antigen 1,SAG1）在弓形虫速殖子表面高表达,被认为是最有价值的检测靶标之一。本研究中,采用骆驼科动物血清中天然存在的单重链抗体（Heavy chain antibodies,HCAb）的重链可变区,即纳米抗体（Nanobody,Nb）,结合噬菌体展示技术,筛选并制备抗弓形虫SAG1纳米抗体,为弓形虫循环抗原检测方法的建立奠定基础。目的1.建立弓形虫LAMP-LFD分子检测方法,采用LAMP-LFD方法对浙江省五座城市流浪猫犬血液样本中弓形虫进行检测,统计浙江省五市流浪猫犬中弓形虫阳性率。2.原核表达弓形虫SAG1抗原,免疫骆驼,构建弓形虫SAG1纳米抗体文库,淘选获得高亲和力的弓形虫SAG1纳米抗体,并表达鉴定。方法1.结合LAMP和LFD方法,优化反应体系,设计LAMP-LFD分子检测装置,建立弓形虫LAMP-LFD分子检测方法,鉴定LAMP-LFD方法的特异性、灵敏度。2.利用建立的LAMP-LFD方法对浙江省五座城市流浪猫犬的318份血液样本中弓形虫循环DNA进行检测,统计分析浙江省流浪猫犬中弓形虫阳性率。3.构建pET-28a-Sag1载体,原核表达弓形虫SAG1抗原,纯化、复性、鉴定后免疫骆驼,利用巢式PCR技术扩增骆驼淋巴细胞中VHH序列,构建抗弓形虫SAG1纳米抗体文库。4.利用噬菌体展示技术,淘选抗弓形虫SAG1纳米抗体,并进行原核表达纯化,免疫杂交分析、鉴定。结果1.成功建立了LAMP-LFD方法检测弓形虫529-RE,通过LFD试纸条读取LAMP反应结果,可在1 h内最低检出1 fg弓形虫全基因组中的529-RE,且与猪隐孢子虫、利什曼原虫、间日疟原虫、溶组织内阿米巴、伊氏锥虫等寄生虫无交叉反应。建立的LAMP-LFD方法检测弓形虫529-RE序列的灵敏度是PCR是PCR方法的100倍。LAMP-LFD检测浙江省五座城市318例流浪猫犬血液样本中弓形虫,其中流浪猫血液样本105份,流浪犬血液样本213份,分别检出率为4.76%（5/105）、4.69%（10/213）。2.成功原核表达了弓形虫SAG1蛋白,并免疫骆驼,制备了3.2×108菌库库容的抗弓形虫SAG1纳米抗体文库。通过噬菌体展示技术,筛选得到8个阳性的Anti-SAG1-Nbs,Western Blot显示均能与重组的弓形虫SAG1抗原反应。其中一株Anti-SAG1-Nb-5能同时与重组的弓形虫r SAG1抗原、天然弓形虫抗原反应,测定其与重组r SAG1抗原之间的亲和常数为1.66×10-9 mol/L。结论1.成功构建了弓形虫循环DNA的LAMP-LFD的分子诊断方法,具有良好的特异性和较高的灵敏度。该检测装置具备良好的气密性和便携性,适用于弓形虫的简便、高效的分子检测。2.利用LAMP-LFD方法对浙江省五市流浪猫犬血液中弓形虫进行检测,弓形虫检出率高于常规PCR方法。3.成功制备了弓形虫SAG1纳米抗体文库,并筛选、表达出具有高亲和力的纳米抗体,为弓形虫的抗原检测方法的建立奠定了基础。
赵旭,张婷,桑晓宇,杨娜,冯颖,王瑶,陈启军,姜宁[2]（2017）在《弓形虫表膜抗原SAG1的研究及应用进展》文中研究指明刚地弓形虫是一种原生动物,被其感染后引起一系列的病理变化和症状。刚地弓形虫表膜抗原SAG1是一类重要的膜蛋白,研究发现其表膜抗原SAG1在制备单克隆抗体、疫苗和临床快速诊断等方面都有着重要的作用。本文主要就弓形虫表膜抗原SAG1的分子生物学信息、SAG1在机体内的免疫应答和应用研究进行综述。
王贝贝[3]（2016）在《弓形虫pET28a-SAG1和pET28a-SAG4重组基因的构建、表达及其免疫保护作用》文中研究指明目的构建弓形虫pET28a-SAG1和pET28a-SAG4重组基因并原核细胞表达弓形虫pET28a-SAG1和pET28a-SAG4重组蛋白；并以此免疫动物来评价pET28a-SAG1和pET28a-SAG4重组蛋白的免疫效果。为弓形虫病的基因疫苗应用提供科学依据。方法根据GenBank发表的RH株弓形虫SAG1和SAG4序列设计合成2对特异性引物,提取弓形虫基因组DNA,以其为模板,PCR扩增这2个抗原基因,并构建到pMD19（Simple）克隆载体上,经菌落PCR、双酶切鉴定并测序正确后,再将酶切产物纯化好的SAG1和SAG4基因构建到pET28a原核表达系统中,并在BL21大肠埃希菌中表达；鉴定并纯化重组蛋白,免疫小鼠,取血清,应用间接ELISA法检测小鼠血清中抗弓形虫抗体IgG,并通过攻虫试验来观察小鼠的发病及死亡情况以评价这2个重组蛋白的免疫保护作用。结果成功获取SAG1与SAG4基因,并且将这2个基因构建到了pMD19 （Simple）载体和原核表达质粒pET28 a载体上,成功获得pET28a-SAG4和pET28a-SAG1。原核表达后分别获取到SAG4和SAG1目的重组蛋白。应用纯化的重组蛋白免疫小鼠后各组小鼠血清OD值差异有统计学意义（p<0.01）,双蛋白免疫组的血清OD值升的最高；攻击实验时,双蛋白免疫组存活时间最长,pET28a-SAG1组存活时间比p ET28a-SAG4组长,差异有统计学意义（p<0.01）。结论1.成功构建pET28a-SAG1和pET28a-SAG4重组基因并表达和纯化出目的重组蛋白。2.国内首次用昆明小鼠做弓形虫的攻虫实验,证明昆明小鼠对弓形虫易感。3.攻虫实验表明双蛋白免疫组小鼠存活时间长于单蛋白免疫的存活时间,pET28a-SAG1组小鼠存活时间长于pET28a-SAG4组。pET28a-SAG1蛋白的免疫保护作用比pET28a-SAG4蛋白好。4.这两个基因所表达的蛋白质皆有免疫保护作用。
张雅岭[4]（2014）在《弓形虫病免疫胶体金诊断试纸条的研制》文中研究表明弓形虫（T.gondii）病是一种呈世界性分布的人畜共患病,人群感染普遍,对孕妇和免疫力低下者,危害很大;200多种动物都能感染该病,多数呈隐性感染,但猪暴发感染弓形虫后,可引起大批死亡。弓形虫病严重威胁着人类的健康,同时也给畜牧业造成了很大的损失。目前,临床上诊断弓形虫病,依赖于血清学诊断,主要包括间接血凝试验、间接荧光抗体试验、染色试验和酶联免疫吸附试验,但这些免疫检测技术费时、费力,还需要特殊仪器设备辅助,不适合大面积推广应用。胶体金技术是一种新型快速诊断技术,已经在弓形虫病的诊断上得到使用,临床检测时操作简便、快速,无需相关专业的技术人员和贵重的仪器设备,适合于基层大面积检测、普查等,从而得到了快速发展。临床上诊断弓形虫病时经常检测血清中的抗体,但是抗体可以在体内长期存在,不能区分现症感染或既往感染,而弓形虫循环抗原存在于急性感染弓形虫病的血清中,适合急性病的诊断。本研究利用胶体金标记技术,运用免疫学方法,根据层析原理,结合单克隆抗体制备和选用新材料等多种方法,建立了一种新的检测弓形虫循环抗原的试纸条诊断方法。利用本实验室制备和保存的D5和B6两株杂交瘤细胞株,分别制备、纯化抗弓形虫P30蛋白和速殖子的单克隆抗体,同时制备弓形虫可溶性速殖子抗原。制备胶体金并标记单抗D5,在NC膜的检测线（T线）和质控线（C线）上分别包被B6单抗和羊抗鼠IgG二抗,经过一系列条件的优化,研制出了弓形虫病免疫胶体金诊断试纸条。经试纸条敏感性检测,可检出1:1000倍稀释的弓形虫阳性血清。与伊氏锥虫VSG抗原、大片吸虫ES抗原、横川后殖吸虫分泌抗原、异尖线虫分泌抗原均无交叉反应。建立弓形虫感染小鼠的动物模型,分别用试纸条和已建立的双抗体夹心ELISA方法检测64份小鼠血清中循环抗原,符合率为93.8%;用这两种方法对在广西采集的80份猪血清分别检测,符合率为98.8%,两者比较一致,结果证明建立的试纸条诊断方法灵敏、特异,另外该方法具有简便、快速、适合现场检测、结果易于判定和基层普通人员即可使用等优点。这种新方法的建立为弓形虫病现症、现场的诊断提供了新的方法,对临床上更有效的防治弓形虫病具有重要的意义。
潘阳[5]（2013）在《人—鼠嵌合型抗弓形虫IgM抗体检测质控物研制和基于病毒样颗粒的microRNA-146a转运方法建立及其在系统性红斑狼疮中的治疗研究》文中提出刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种世界性分布的专性细胞内寄生原虫,能感染人和动物,引发人畜共患性弓形虫病。我国人群弓形虫感染率约为5-20%,成年人多为隐性感染,但孕早期弓形虫感染可引起胎儿畸形、多器官坏死等严重损害。因此弓形虫是孕产妇ToRCH（弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒和单纯疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ型）筛查的检测项目之一。目前国内应用最广泛的弓形虫感染检测方法是特异性IgG、IgM酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）,尤其是特异性IgM抗体的检测有助于确定感染发生的时间,判断感染的性质,预测感染的可能危害。为了保证检测结果的准确可靠,临床实验室需要阳性质控物进行室内质量控制,质评机构亦需要质控物开展相应项目的室间质量评价。通常用于弓形虫IgM检测的质控物为感染者的血清或血浆与正常血清或血浆的混合物,其最大的缺陷是来源极其有限。另外还有价格昂贵、存在IgM抗体特异性和亲和力的批间差异、可能存在医学伦理问题及有潜在的传染危险性等缺点。因此在第一部分中我们使用基因工程嵌合抗体技术制备了可以替代传统含抗弓形虫IgM的血清,用于ELISA检测质控物的人-鼠嵌合型抗弓形虫IgM抗体,并对其作为质控物的稳定性、通用性等特点进行了评价。结果显示本研究制备的人-鼠嵌合型抗弓形虫IgM抗体具有以下特点：①稳定性良好,37℃和室温条件保存一个月,或4℃和-20℃保存两个月不会出现抗体效价的明显变化,满足作为临床实验室抗体检测质控物稳定保存较长时间的要求；②具备较好的通用性,可被目前主要抗弓形虫IgM ELISA试剂盒检出；③通过基因工程嵌合抗体技术真核表达得到,没有生物传染危险性；④制备方法简便易行,成熟廉价,可大量制备；⑤不涉及获取病人阳性样本时可能遇到的伦理问题,克服了传统的血清来源阳性质控物在这些方面的缺陷。因此本研究建立的方法不仅基本解决了抗弓形虫IgM ELISA检测质控物的制备问题,也为其他病原体特异性IgM、IgG质控物的研制提供了有价值的参考依据。系统性红斑狼疮（Systemic lupus erythematosus, SLE）是一种多器官、多系统受损的慢性系统性自身免疫性疾病。目前SLE的确切发病机制仍未完全阐明,患者突出表现为体内存在多种免疫功能异常,如T细胞数量和功能减低、B细胞过度活化增殖、产生多种自身抗体而引发持续的自身反应性炎症,最终出现肾脏、中枢神经系统损害,甚至死亡。MicroRNAs （miRNAs）是在真核生物中发现的一类大小约为20～25个核苷酸的具有调控功能的内源性非编码RNA。成熟的miRNAs可与靶mRNA3’端非翻译区位点特异性结合,根据互补程度的不同降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译,发挥转录后水平基因调控作用。miRNAs参与生命过程中的一系列重要进程,如病毒防御、造血分化、器官形成、细胞增殖和凋亡等,并已探索性的进入治疗领域。但目前应用miRNAs进行疾病治疗面临的瓶颈之一是其属于核糖核苷酸类分子,裸露的核酸分子在体内环境中极易被各种核酸酶降解并且很难被细胞摄取。因此miRNAs治疗性研究能否获得理想效果的关键取决于有无高效可靠的miRNAs递送途径。在第二部分的研究中,我们以MS2噬菌体病毒样颗粒包裹miR-146a前体,将其与HIV-1Tat47-57穿透肽交联,建立一种新型的以病毒样颗粒为基础的具有自主转导能力的miRNAs转运方法。随后我们对该方法递送的miR-146a在系统性红斑狼疮小鼠中的治疗作用进行了探讨。体外细胞和体内实验证实,使用该转运方法处理可使1niR-146a水平在细胞中升高4-5倍,并稳定持续约120小时,优于对照组使用的常规脂质体转染方法；体内实验中可诱导miR-146a过表达两倍左右,最大miR-146a浓度的半衰期约为43小时。该方法制备简单,产物稳定,细胞摄取率高、细胞毒性低。在治疗性研究方面,使用该病毒样颗粒4次注射后,狼疮小鼠血清抗dsDNA抗体、ANA和总IgG抗体水平显着下降,SLE相关炎症细胞因子表达降低,SLE相关Toll样受体通路中的白细胞介素1受体相关激酶-1、TNF受体相关因子-6和NF-κB分子表达活化受到明显抑制。本研究的创新在于：①建立了基于MS2VLPs的miR-146a转运方法,该方法可高效、稳定、低毒、灵活的将包括miR-146a在内的多种miRNAs递送到细胞内实现高表达,丰富了RNA干扰的技术手段,部分解决了目前存在的技术瓶颈。②首次将miRNAs引入SLE治疗领域,过表达的miR-146a通过TLR通路抑制了狼疮小鼠体内自身抗体的产生,初步实现了SLE治疗作用,为进一步研究和应用拓展奠定了基础。
刘明如[6]（2012）在《弓形虫单克隆抗体的制备及生物学活性的初步鉴定》文中指出刚地弓形虫（T.gondii）是一种全球性的人畜共患寄生虫,该种寄生虫病的流行与传播不仅严重地影响着畜牧业的可持续发展,同时也对人类的生命与健康造成严重的威胁及危害。本实验目的在于利用分子生物学中的蛋白表达技术及单克隆抗体的制备等分子及免疫学相关技术,选用弓形虫速殖子抗原及膜表面主要致病性抗原P30作为免疫原,制备出弓形虫单克隆抗体为接下来建立弓形虫病快速、简便诊断方法和进一步的研究打下基础。通过对弓形虫P30基因的PCR扩增、克隆、测序,成功的构建了原核表达重组质粒pET32a-P30,并成功的诱导表达了弓形虫P30重组蛋白抗原,经纯化制备出了可溶性弓形虫P30重组蛋白抗原。同时采用小鼠腹腔收集弓形虫速殖子方法,用胰蛋白酶法纯化制备了弓形虫速殖子抗原,为后续试验提供了免疫抗原。用弓形虫P30重组蛋白抗原和弓形虫速殖子抗原分别免疫小鼠、经细胞融合,利用建立的间接ELISA方法对融合胞融克隆进行检测筛选,成功的用表达的P30蛋白制备了2株单克隆抗体杂交瘤细胞分别命名为5D5、2A1；用速殖子抗原制备了2株单克隆抗体杂交瘤细胞,分别命名为5B6、2D2。对这4株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体的生物学特性进行了鉴定：经间接ELISA测定5B6、2D2、5D5、2A1四株杂交瘤细胞单克隆抗体上清的效价分别为：1：800、1：1600、1：3200、1：6400；腹水效价分别为：1：104、1：104、1：105、1：105；经单克隆抗体亚型鉴定,4株单克隆抗体5B6、2D2、5D5、2A1亚型分别为：Ig G1,Ig M,Ig G1和Ig M；染色体计数结果显示：4株杂交瘤细胞染色体计数为90-110条,均大于亲本细胞；经间接ELISA检测（?）SPSS统计软件进行方差分析,四株杂交瘤细胞第一代、第十代细胞培养上清OD450值差异不显着,均能稳定分泌单克隆抗体。广西地区是人畜弓形虫病流行的地区,本实验成功的制备了抗弓形虫速殖子抗原和弓形虫P30重组蛋白抗原的单克隆抗体,并对其生物学特性进行了鉴定,为进一步研究弓形虫病的快速灵敏的诊断检测方法以及弓形虫病的免疫防治奠定了基础。
王妍[7]（2012）在《弓形虫GRA3基因的原核表达及单克隆抗体的制备与初步应用研究》文中提出弓形虫病（toxoplasraosis）,又称弓形体病,它是由一种球虫,即弓形体（Toxoplasma gandii）所引起的一种寄生原虫病。弓形虫体内存在一种重要的分泌抗原致密性颗粒蛋白,经临床人体和动物试验结果显示,致密性颗粒蛋白的反应原性和免疫原性均很高,而目前对GRA3抗原的研究显示,该抗原可以诱发机体产生体液免疫,所以该抗原对于将来用于该病的临床诊断及其疫苗的研究均具有很大价值。本研究旨在成功构建致密性颗粒蛋白GRA3（Dense granle protein GRA3）原核表达载体,进一步利用表达的重组GRA3蛋白抗原制备抗重组GRA3的单克隆抗体,并进行单克隆抗体的鉴定及应用,进一步的研究该抗原的应用价值,为弓形虫病的诊断及亚单位疫苗的研制奠定基础。本研究根据GenBank AF414079已发表的弓形虫GRA3基因序列设计了一对特异性的引物,利用PCR技术成功扩增出了一段687bp的基因片段,对该基因进行了序列分析,结果显示该基因片段为弓形虫GRA3基因；并成功构建了原核表达载体pGEX-GRA3;将构建好的表达载体,经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21中进行了表达,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示,获得了分子量为50ku的融合蛋白GST-GRA3,经分析大部分以可溶性蛋白的形式存在。Western-Blotting免疫印迹分析,该重组蛋白与弓形虫阳性血清发生特异性反应,说明该蛋白具有一定的反应原性。为进一步探讨重组蛋白作为诊断抗原的可能性。本研究利用高效表达的重组GRA3蛋白免疫BALB/c小鼠,采用细胞融合技术,经间接ELISA方法筛选和有限稀释法克隆后获得一株抗重组GRA3蛋白的杂交瘤细胞株（5E4）。经鉴定,其McAb的亚型为IgGl型。ELISA和western blotting试验结果表明,获得的5E4McAb可特异性的识别弓形虫GRA3蛋白,表明5E4McAb识别的表位可能位于GRA3蛋白的保守区域。并以兔抗弓形虫IgG为捕获抗体,利用抗重组GRA3蛋白单克隆抗体为检测抗体,成功建立了用于弓形虫病检测的单抗双夹心ELISA方法,该方法对弓形虫检病检测灵敏度达0.154ug/mL。用该法对延边某猪场152头猪进行检测,结果阳性率为13.2%。并与常规ELISA相比较,该法更加敏感、特异,更有利于准确诊断。为临床研制弓形虫诊断试剂、治疗试剂奠定了基础,为制备疫苗的候选基因的筛选提供依据,同时为弓形虫的检测和区域流行病学调查提供了一种简便快速的诊断方法。
卢致民,张进顺[8]（2011）在《弓形虫感染免疫诊断抗原研究进展》文中指出诊断抗原历来是弓形虫病免疫诊断研究的重点。随着分子生物学技术的发展,弓形虫诊断抗原由最初的粗抗原发展成为组分抗原以及重组抗原。本文综述了近年来弓形虫病诊断抗原的研究现状与进展。
曹丽艳[9]（2009）在《弓形虫GJS株表面抗原1基因的克隆、表达及鉴定》文中认为弓形虫（Toxoplasma gondii）为专性细胞内寄生原虫,能引起人兽共患弓形虫病,严重危害人类健康和畜牧业发展。弓形虫表面抗原1 （surface antigen 1,SAG1）是位于弓形虫速殖子表面的特异性蛋白,也是最早被克隆测序的弓形虫表面蛋白,SAG1因为在诊断和免疫中具有双重价值而得到广泛研究。根据GenBank数据库中的弓形虫RH株表面抗原1（SAG1）基因序列设计1对引物,应用PCR技术从弓形虫GJS株基因组DNA中扩增SAG1基因片段,克隆入pMD18-T载体,构建重组质粒pMD-SAG1。测序结果表明获得1011 bp的SAG1基因片段,编码336个氨基酸,与已知的SAG1基因核苷酸序列（序列号S76248）及其编码氨基酸序列的同源性分别为98.9%、97.3%。重新设计一对从SAG1蛋白强抗原表位开始的引物,将SAG1基因片段定向亚克隆至原核表达载体pET-30a中,重组质粒pET-SAG1转化至E. coli BL21（DE3）中,经IPTG诱导表达。表达产物用SDS-PAGE进行鉴定,结果表明SAG1基因片段在大肠杆菌中主要以包涵体的形式表达,分子量大小约为35 kD,Western-blot鉴定结果表明,表达产物可以被羊抗弓形虫阳性血清所识别。重组抗原经纯化和复性后免疫小鼠,间隔两周,免疫三次,最后一次免疫后1W对小鼠腹腔注射弓形虫速殖子攻击感染。对抗血清进行间接ELISA检测,结果小鼠免疫后产生了较高滴度的特异性抗体,虽然与对照组相比免疫组小鼠存活时间有一定的延长,但差异无显着性。为了获得与天然SAG1蛋白构型接近的重组蛋白,另外设计一对引物扩增SAG1的基因片段。PCR产物经纯化、酶切后定向插入pcDNA3.1真核表达载体,转化至大肠杆菌DH5α,经酶切及PCR鉴定后进行测序。结果表明,从弓形虫GJS株基因组DNA中扩增出1008 bp的特异SAG1片段,大小与预测值相符。pcDNA-SAG1的成功构建,为进一步在细胞中的表达及弓形虫核酸疫苗的研制奠定了基础。
张安勇[10]（2007）在《弓形虫P30重组蛋白的表达、纯化与复性》文中研究说明目的构建刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）表膜蛋白P30基因的表达载体，在大肠杆菌中诱导表达，纯化表达产物P30并进行抗原性分析，研究P30在弓形虫病血清学诊断中的应用价值。方法（1）P30蛋白的表达、纯化与复性巨噬细胞培养弓形虫，提取弓形虫DNA为模板，PCR扩增目的片断，将目的片断克隆至pUCm-T Vector，酶切后用PCR鉴定，再亚克隆到原核表达载体pET28b（+）中、构建重组质粒pET28b（+）／P30，经酶切、PCR及测序鉴定后转化至表达宿主菌BL21（DE3）中诱导表达，SDS-PAGE和Western-Blot鉴定表达产物；包涵体经8M尿素变性，Ni-NTA亲和层析柱纯化重组蛋白，变性蛋白经稀释透析复性，SDS-PAGE和Western-Blot分析和鉴定复性P30蛋白，BCA法测定复性蛋白浓度，用于ELISA包板。（2）小鼠弓形虫抗血清的制备及临床弓形虫病患者阳性血清的收集纯化的弓形虫速殖子经～80℃反复冷冻3次，制备抗原，免疫昆明小鼠，制备小鼠弓形虫阳性血清。（3）弓形虫病人IgG抗体ELISA检测方法的建立以纯化复性后的P30为抗原，包板，用间接ELISA检测临床疑似弓形虫病人，用制备的小鼠弓形虫阳性血清为对照，并同时与国外试剂盒检测结果比较，以评价纯化的P30在弓形虫病诊断中的应用价值。结果1．PCR扩增得到长800bp的目的片断，测序结果与Genbank上登录序列一致；2．含pET28b（+）／P30重组菌经IPTG诱导，SDS-PAGE电泳结果显示，得到一分子量（Mr）约30 kDa的重组蛋白，目的蛋白在菌体细胞内以包涵体形式存在；3．8M尿素溶解后经Ni-NTA亲和柱纯化获得了纯度大于95％的重组蛋白；4．复性后，得到溶解状态的复性蛋白，Western-Blot结果显示，该蛋白能被抗6—His单抗、小鼠抗弓形虫血清和部分临床弓形虫病患者阳性血清识别；5．以纯化的P30重组蛋白为包被抗原建立间接ELISA法，检测小鼠抗弓形虫血清和临床弓形虫病患者阳性血清，与进口试剂盒检测的结果比较，结果：灵敏度为93.3％，特异度为100％，ELISA法与进口试剂盒的总符合率为96.7％。结论1．获得了高纯度的弓形虫P30复性蛋白；2．复性的P30蛋白具有较好的抗原性，能与小鼠抗弓形虫阳性血及部分临床疑似弓形虫病患者发生特异性反应，可用于弓形虫病人血清学诊断。
二、弓形虫主要表膜P30抗原的纯化与鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、弓形虫主要表膜P30抗原的纯化与鉴定（论文提纲范文）
（1）刚地弓形虫LAMP-LFD检测方法的建立、初步应用及抗弓形虫SAG1纳米抗体的制备、分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分:刚地弓形虫LAMP-LFD检测方法的建立、初步应用 |
| 材料与方法 |
| 结果与分析 |
| 讨论与建议 |
| 第二部分:抗弓形虫SAG1 纳米抗体的制备、分析 |
| 材料与方法 |
| 结果与分析 |
| 讨论与建议 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述及参考文献 弓形虫病分子诊断方法的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附件1 攻读学位期间发表论文目录 |
| 附件2 攻读学位期间参与的项目及学术交流 |
（2）弓形虫表膜抗原SAG1的研究及应用进展（论文提纲范文）
| 1 SAG1 (P30) 结构特点 |
| 2 SAG1诱导的免疫应答机制 |
| 3 表膜抗原SAG1的应用 |
| 3.1 临床诊断方面 |
| 3.2 预防弓形虫方面 |
| 3.2.1 自杀性DNA疫苗 |
| 3.2.2 基因工程核酸疫苗 |
| 4 展望 |
（3）弓形虫pET28a-SAG1和pET28a-SAG4重组基因的构建、表达及其免疫保护作用（论文提纲范文）
| 个人简历 |
| 英文缩略词汇表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 弓形虫pET28a-SAG1和pET28a-SAG4基因的构建及鉴定 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 第二章 弓形虫pET28a-SAG1和pET28a-SAG4蛋白的原核表达 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 第三章 弓形虫pET28a-SAG1和pET28a-SAG4所表达的蛋白疫苗的动物免疫保护性作用 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表的论文 |
（4）弓形虫病免疫胶体金诊断试纸条的研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 综述 |
| 1.1 弓形虫病 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 生活史 |
| 1.1.3 流行病学 |
| 1.1.4 致病作用 |
| 1.1.5 弓形虫病的诊断 |
| 1.2 免疫胶体金技术研究进展 |
| 1.2.1 胶体金的的特性 |
| 1.2.2 胶体金制备的方法 |
| 1.2.3 胶体金试纸条层析原理 |
| 1.2.4 胶体金诊断技术优势 |
| 1.2.5 胶体金技术的临床应用 |
| 1.2.6 胶体金技术在弓形虫病诊断上的应用 |
| 1.3 本研究的目的和意义 |
| 第二章 弓形虫可溶性速殖子抗原、抗弓形虫单克隆抗体的制备 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 弓形虫虫株 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 试剂配制 |
| 2.1.5 主要仪器及设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 弓形虫速殖子抗原的制备 |
| 2.2.2 抗弓形虫单克隆抗体的制备 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 腹水中速殖子镜检结果 |
| 2.3.2 速殖子可溶性抗原、纯化后的单抗D5、B6浓度 |
| 2.3.3 D5、B6单抗亚型鉴定 |
| 2.3.4 D5、B6单抗效价的测定 |
| 2.3.5 D5、B6单抗纯度的鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 速殖子抗原与单抗的制备 |
| 2.4.2 弓形虫的复苏与冻存 |
| 2.4.3 超声破碎全虫抗原 |
| 2.4.4 杂交瘤细胞的复苏 |
| 2.4.5 两株单抗的纯化 |
| 第三章 弓形虫病免疫胶体金诊断试纸条的研制 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 主要试剂配制 |
| 3.1.3 主要仪器及设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 玻璃试剂瓶的清洗 |
| 3.2.2 胶体金溶液的制备 |
| 3.2.3 胶体金质量鉴定 |
| 3.2.4 胶体金稳定性试验 |
| 3.2.5 单抗中盐离子和杂质的去除 |
| 3.2.6 胶体金标记最佳PH值的优化 |
| 3.2.7 胶体金标记最适蛋白用量的优化 |
| 3.2.8 单抗的标记与纯化 |
| 3.2.9 金标单抗活性的鉴定 |
| 3.2.10 试纸条制备 |
| 3.2.11 试纸条质量的检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 胶体金溶液的制备 |
| 3.3.2 胶体金溶液的质量鉴定 |
| 3.3.3 胶体金溶液保存稳定性结果 |
| 3.3.4 胶体金粒径选择结果 |
| 3.3.5 胶体金标记单抗的优化 |
| 3.3.6 金标单抗活性的鉴定 |
| 3.3.7 试纸条制备 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 免疫胶体金诊断试纸条的研制 |
| 3.4.2 金颗粒制备与鉴定 |
| 3.4.3 影响胶体金标记的因素 |
| 3.4.4 试纸条各部分材料的筛选 |
| 3.4.5 检测线与质控线的包被量 |
| 3.4.6 缓冲液的作用 |
| 3.4.7 免疫胶体金技术展望 |
| 第四章 检测弓形虫循环抗原双抗体夹心ELISA方法的建立 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 血清样品 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器及设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 兔多抗IgG的制备 |
| 4.2.2 检测弓形虫循环抗原双抗体夹心ELISA检测方法的初步建立 |
| 4.2.3 双抗夹心ELISA方法建立条件的优化 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 兔多抗效价的测定 |
| 4.3.2 双抗体夹心ELISA方法的建立 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 双抗夹心ELISA方法的建立 |
| 4.4.2 单抗与循环抗原的反应性 |
| 4.4.3 双抗体夹心ELISA方法检测循环抗原的意义 |
| 第五章 弓形虫病免疫胶体金试纸条诊断效果的评估与初步应用 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 实验动物 |
| 5.1.2 待测血清样本 |
| 5.1.3 主要仪器及设备 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 弓形虫循环抗原血清样本的采集 |
| 5.2.2 试纸条诊断效果的评估 |
| 5.2.3 试纸条的初步应用 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 试纸条诊断结果评估 |
| 5.3.2 试纸条的初步应用 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 胶体金诊断试纸条的应用价值 |
| 5.4.2 检测感染弓形虫动物血清中循环抗原的意义 |
| 5.4.3 试纸条检测猪血清循环抗原的初步应用 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
（5）人—鼠嵌合型抗弓形虫IgM抗体检测质控物研制和基于病毒样颗粒的microRNA-146a转运方法建立及其在系统性红斑狼疮中的治疗研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 人-鼠嵌合型抗弓形虫IgM抗体检测质控物研制 |
| 前言 |
| 1. 材料和方法 |
| 1.1. 实验材料和试剂配制 |
| 1.2. 方法 |
| 1.2.1. 人-鼠嵌合抗弓形虫IgM抗体表达质粒的构建 |
| 1.2.2. 人-鼠嵌合抗弓形虫IgM抗体的真核瞬时表达 |
| 1.2.3. 人-鼠嵌合抗弓形虫IgM抗体作为质控物的应用研究 |
| 2. 结果 |
| 2.1. 人-鼠嵌合抗弓形虫IgM抗体表达质粒的构建 |
| 2.2. 人-鼠嵌合抗弓形虫IgM抗体的表达与鉴定 |
| 2.3. 人-鼠嵌合抗弓形虫IgM抗体作为质控品的应用研究 |
| 3. 讨论 |
| 第二部分 基于病毒样颗粒的microRNA-146a转运方法建立及其在系统性红斑狼疮中的治疗研究 |
| 前言 |
| 1. 材料和方法 |
| 1.1. 实验材料和试剂配制 |
| 1.2. 方法 |
| 1.2.1. 内含miRNAs-146a的重组病毒样颗粒原核表达载体的构建 |
| 1.2.2. 重组病毒样颗粒的表达和纯化 |
| 1.2.3. 重组病毒样颗粒的鉴定 |
| 1.2.4. 重组病毒样颗粒与Tat47-57转导肽的交联及鉴定 |
| 1.2.5. 重组病毒样颗粒的FITC荧光素标记及穿透能力验证 |
| 1.2.6. 重组病毒样颗粒介导的miR-146a过表达体外有效性验证 |
| 1.2.7. 重组病毒样颗粒介导的miR-146a过表达体内有效性验证 |
| 1.2.8. 重组病毒样颗粒对系统性红斑狼疮小鼠的治疗作用研究 |
| 1.2.9. 统计学分析 |
| 2. 结果 |
| 2.1. 重组病毒样颗粒的表达和纯化 |
| 2.2. 重组病毒样颗粒的鉴定 |
| 2.3. 重组病毒样颗粒与Tat47-57转导肽的交联鉴定 |
| 2.4. FITC标记的交联重组病毒样颗粒转入细胞后检测 |
| 2.5. 重组病毒样颗粒介导的miR-146a过表达体外有效性验证 |
| 2.6. 重组病毒样颗粒介导的miR-146a过表达体内有效性验证 |
| 2.7. 重组病毒样颗粒对系统性红斑狼疮小鼠的治疗作用研究 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 论文综述 人源化抗体制备技术研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录1 pcDNA3.0载体详细信息 |
| 附录2 鼠抗弓形虫P30抗原轻、重链可变区序列 |
| 附录3 重组表达载体pcDNA3-Kchain和pcDNA3-μchain测序结果 |
| 附录4 已发表治疗性miRNAs研究使用的转运递送系统文献分析 |
| 附录5 pACYC-Duet1载体详细信息 |
| 附录6 pmirGLO载体详细信息 |
| 附录7 pMS-miR146a和pMS-miRNC表达质粒全基因合成测序结果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（6）弓形虫单克隆抗体的制备及生物学活性的初步鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 弓形虫病概述 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 流行病学及危害 |
| 1.1.3 检测方法 |
| 1.1.4 弓形虫病的防治 |
| 1.2 弓形虫主要抗原基因 |
| 1.3 弓形虫单克隆抗体 |
| 1.4 本实验的目的及意义 |
| 第二章 弓形虫P30蛋白的原核表达及弓形虫速殖子抗原的制备 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 抗弓形虫P30重组蛋白及速殖子抗原单克隆抗体的制备 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 细胞株 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 试验用试剂配制 |
| 3.1.5 主要仪器设备及耗材 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 动物免疫 |
| 3.2.2 间接ELISA方法检测小鼠血清效价 |
| 3.2.2.1 间接ELISA方法反应条件的优化 |
| 3.2.2.2 间接ELISA方法检测小鼠血清效价 |
| 3.2.3 细胞融合 |
| 3.2.3.1 饲养细胞的制备 |
| 3.2.3.2 骨髓瘤细胞的准备 |
| 3.2.3.3 免疫脾细胞的制备 |
| 3.2.3.4 细胞融合 |
| 3.2.4 阳性杂交瘤细胞的筛选 |
| 3.2.5 阳性杂交瘤细胞的克隆化培养 |
| 3.2.6 杂交瘤细胞的冻存与复苏 |
| 2.2.6.1 杂交瘤细胞的冻存 |
| 2.2.6.2 杂交瘤细胞的复苏 |
| 3.2.7 单克隆抗体的制备 |
| 3.2.7.1 细胞培养上清的制备 |
| 3.2.7.2 单抗小鼠腹水的制备 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 间接ELISA方法检测小鼠血清效价 |
| 3.3.1.1 间接ELISA方法反应条件的优化 |
| 3.3.1.2 免疫小鼠血清效价的测定 |
| 3.3.2 细胞融合 |
| 3.3.2.1 饲养细胞的制备 |
| 3.3.2.2 骨髓瘤细胞的准备 |
| 3.3.2.3 细胞融合 |
| 3.3.3 杂交瘤细胞的形态观察 |
| 3.3.4 阳性杂交瘤细胞的克隆化培养 |
| 3.3.5 单克隆抗体的制备 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 抗弓形虫单克隆抗体生物学特性的鉴定 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要试剂 |
| 4.1.2 试验用试剂配制 |
| 4.1.3 主要仪器设备及耗材 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 单克隆抗体杂交瘤细胞及小鼠腹水效价的测定 |
| 4.2.2 单克隆抗体亚类的鉴定 |
| 4.2.3 单克隆抗体杂交瘤细胞的染色体分析 |
| 4.2.4 单克隆抗体杂交瘤细胞的稳定性鉴定 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 杂交瘤细胞培养上清及小鼠腹水效价的测定 |
| 4.3.2 单克隆抗体亚型鉴定 |
| 4.3.3 单克隆抗体杂交瘤细胞染色体分析 |
| 4.3.4 杂交瘤细胞的稳定性检测 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（7）弓形虫GRA3基因的原核表达及单克隆抗体的制备与初步应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1 弓形虫病原学国内外的研究情况 |
| 2 弓形虫病流行病学研究进展 |
| 2.1 区域分布 |
| 2.2 传播途径 |
| 2.3 贮存宿主 |
| 2.4 季节分布 |
| 2.5 感染人群 |
| 3 弓形虫抗原基因的研究进展及在疾病诊断中的应用情况 |
| 3.1 抗原基因的克隆与表达的研究进展 |
| 4 PCR技术在弓形虫病诊断中研究进展 |
| 5 芯片技术在弓形虫诊断中研究进展 |
| 6 弓形虫疫苗的研究进展 |
| 7 单克隆抗体技术在疾病诊断中的应用 |
| 8 弓形虫病在防治方面的研究进展 |
| 9 本研究目的及意义 |
| 第二章 弓形虫GRA3基因原核表达的研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 RH强度株 |
| 1.2 主要材料 |
| 1.3 试验所用溶液及其配制方法 |
| 1.4 试验所需设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 弓形虫基因组DNA的制备 |
| 2.2 目的基因的扩增 |
| 2.3 目的基因的分离纯化 |
| 2.4 编码的蛋白质的分析 |
| 2.5 目的基因的克隆 |
| 2.6 GRA3表达载体的构建 |
| 3 结果 |
| 3.1 目的基因的扩增结果 |
| 3.2 基因的克隆与鉴定结果 |
| 3.3 目的基因编码的蛋白质的性质分析 |
| 3.4 构建的表达载体的鉴定结果 |
| 3.5 SDS-PAGE和Western-blotting分析表达产物的结果 |
| 3.6 表达产物的溶解性分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 抗重组蛋白GRA3单克隆抗体的制备与分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 抗原 |
| 1.2 细胞 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 主要仪器 |
| 1.6 技术路线 |
| 2 方法 |
| 2.1 抗原制备 |
| 2.2 动物免疫 |
| 2.3 间接ELISA法检测免疫小鼠抗体效价 |
| 2.4 细胞的制备与融合 |
| 2.5 阳性克隆的筛选与克隆化 |
| 2.6 腹水制备 |
| 2.7 单克隆抗体核型的分析 |
| 2.8 单克隆抗体的SDS-PAGE分析 |
| 2.9 单克隆抗体效价测定 |
| 2.10 单克隆抗体的特异性鉴定 |
| 2.11 单克隆抗体的纯化 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫动物的抗体效价测定 |
| 3.2 杂交瘤细胞株的建立 |
| 3.3 杂交瘤细胞的染色体分析 |
| 3.4 5E4杂交瘤细胞株分泌的McAb的亚型鉴定结果 |
| 3.5 腹水的效价检测结果 |
| 3.6 5E4 McAb与重组GRA3蛋白反应结果 |
| 3.7 McAb的Western-Blotting分析结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 单抗双夹心ELISA检测方法的建立与初步应用 |
| 1 材料 |
| 1.1 抗原 |
| 1.2 抗体 |
| 1.3 试验所用溶液的配制 |
| 1.4 主要仪器及设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 单抗双夹心ELISA步骤 |
| 2.2 鼠抗弓形虫IgG最适包被浓度及包被时间的确定 |
| 2.3 蛋白抗原与McAb最佳包被条件的确定 |
| 2.4 酶标二抗的最佳使用浓度及反应条件的确定 |
| 2.5 封闭液的最佳工作时间确定 |
| 2.6 底物显色液(OPD)的最适工作时间的确定 |
| 2.7 阴阳性临界值的确定 |
| 2.8 交叉反应试验 |
| 2.9 敏感性试验 |
| 2.10 应用试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 单抗双夹心ELISA检测方法最佳反应体系及条件的筛选结果 |
| 3.2 阴阳性临界值的确定 |
| 3.3 交叉反应试验结果 |
| 3.4 敏感性试验 |
| 3.5 应用试验 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文 |
（9）弓形虫GJS株表面抗原1基因的克隆、表达及鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 英文缩略词 |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 弓形虫表面抗原1(SAG1)的研究进展 |
| 1 SAG1(P30)基因和蛋白结构 |
| 2 SAG1(P30)与弓形虫侵入细胞的关系 |
| 3 SAG1(P30)蛋白诱导的免疫作用 |
| 4 SAG1(P30)在弓形虫病诊断方面的应用 |
| 5 SAG1(P30)在弓形虫疫苗研制中的应用 |
| 6 结语 |
| 第二章 弓形虫GJS 株表面蛋白1（SAG1）基因的克隆、表达 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 弓形虫GJS 株速殖子 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 质粒和菌株 |
| 1.4 主要实验试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 弓形虫基因组 DNA 的提取 |
| 2.2 目的基因 SAG1 的扩增 |
| 2.3 克隆载体的构建 |
| 2.4 重组质粒的鉴定 |
| 2.5 表达载体的构建 |
| 2.6 重组质粒的鉴定 |
| 2.7 重组质粒的诱导表达 |
| 2.8 表达产物的SDS－PAGE 电泳检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 目的片断的扩增 |
| 3.2 pMD-SAG1 重组质粒的鉴定 |
| 3.3 重组质粒的测序鉴定及序列分析 |
| 3.4 物理化学特性分析 |
| 3.5 弓形虫SAG1 蛋白分子的结构预测 |
| 3.6 pET-SAG1 重组质粒的鉴定 |
| 3.7 SAG1 基因表达产物SDS-PAGE 分析 |
| 4 讨论 |
| 第三章 重组蛋白的纯化及功能分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要实验试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 SAG1 基因的大量表达 |
| 2.2 包涵体的提取 |
| 2.3 包涵体的纯化 |
| 2.4 重组蛋白rSAG1 的Western Blot 鉴定 |
| 2.5 动物试验及攻击感染 |
| 2.6 ELISA 检测抗融合蛋白血清 |
| 3 结果 |
| 3.1 表达产物的定性分析 |
| 3.2 重组蛋白包涵体的纯化 |
| 3.3 重组蛋白rSAG1 抗原性分析 |
| 3.4 弓形虫GJS 株速殖子攻击感染后免疫小鼠存活时间 |
| 4 讨论 |
| 第四章 弓形虫GJS 株表面抗原1 基因的真核表达质粒的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 弓形虫GJS 株速殖子 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 质粒和菌株 |
| 1.4 酶和试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 弓形虫基因组DNA 的提取 |
| 2.2 引物设计 |
| 2.3 目的片段的扩增 |
| 2.4 PCR 产物的回收与纯化 |
| 2.5 目的片段与pCDNA3.1 载体的酶切回收 |
| 2.6 目的片段与表达载体的连接转化 |
| 2.7 重组质粒的提取与鉴定 |
| 2.8 序列测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 SAG1 基因获得结果 |
| 3.2 pcDNA3.1- SAG1 重组质粒的PCR 及酶切鉴定 |
| 3.3 pcDNA3.1- SAG1 重组质粒的测序结果及分析 |
| 4 讨论 |
| 第五章 研究结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（10）弓形虫P30重组蛋白的表达、纯化与复性（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 仪器设备 |
| 第一部分 弓形虫的培养及虫体DNA的抽提 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 方法及步骤 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 第二部分 pET28b(+)/P30原核表达载体的构建及P30蛋白的表达 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 方法及步骤 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三部分 P30蛋白的纯化与复性 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 方法和步骤 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四部分 弓形虫IgG ELISA监测方法的建立 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 方法和步骤 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 主要缩略语英文索引 |
| 文献综述 |
| 成果目录 |
| 致谢 |
四、弓形虫主要表膜P30抗原的纯化与鉴定（论文参考文献）
- [1]刚地弓形虫LAMP-LFD检测方法的建立、初步应用及抗弓形虫SAG1纳米抗体的制备、分析[D]. 薛杨继. 浙江省医学科学院, 2021(02)
- [2]弓形虫表膜抗原SAG1的研究及应用进展[J]. 赵旭,张婷,桑晓宇,杨娜,冯颖,王瑶,陈启军,姜宁. 中国病原生物学杂志, 2017(07)
- [3]弓形虫pET28a-SAG1和pET28a-SAG4重组基因的构建、表达及其免疫保护作用[D]. 王贝贝. 广西医科大学, 2016(02)
- [4]弓形虫病免疫胶体金诊断试纸条的研制[D]. 张雅岭. 广西大学, 2014(01)
- [5]人—鼠嵌合型抗弓形虫IgM抗体检测质控物研制和基于病毒样颗粒的microRNA-146a转运方法建立及其在系统性红斑狼疮中的治疗研究[D]. 潘阳. 北京协和医学院, 2013(11)
- [6]弓形虫单克隆抗体的制备及生物学活性的初步鉴定[D]. 刘明如. 广西大学, 2012(03)
- [7]弓形虫GRA3基因的原核表达及单克隆抗体的制备与初步应用研究[D]. 王妍. 延边大学, 2012(01)
- [8]弓形虫感染免疫诊断抗原研究进展[J]. 卢致民,张进顺. 中国血吸虫病防治杂志, 2011(05)
- [9]弓形虫GJS株表面抗原1基因的克隆、表达及鉴定[D]. 曹丽艳. 甘肃农业大学, 2009(06)
- [10]弓形虫P30重组蛋白的表达、纯化与复性[D]. 张安勇. 青岛大学, 2007(02)