一、人NKG2D真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的瞬时表达（论文文献综述）
牛金中[1]（2021）在《罗非鱼NCC亚群的构成解析及其活性调控因子半乳糖凝集素（Galectins）的功能研究》文中认为鱼类非特异性细胞毒性细胞（NCC）是自然杀伤细胞（NK）进化上的前体细胞,与NK细胞功能相似,除了非特异性的细胞杀伤作用,还具有免疫调节功能,然而NCC类群及其活性调控机理尚不清楚。本文以我国南方重要的淡水养殖品种尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）为研究对象开展了三方面的研究:一、通过单细胞测序构建了罗非鱼NCC的单细胞转录图谱,鉴定出4个NCC亚群;二、通过转录组数据筛选到系列差异表达的半乳糖凝集素（Galectin）基因家族,通过酵母双杂交及GST Pull-down技术对该类蛋白与NCC受体蛋白非特异性细胞毒性细胞受体Ⅰ型（NCCRP-1）的相互作用进行了鉴定;三、针对与NCC活性调控相关的Gal-2与Gal-8开展了功能研究。取得的主要研究结果如下:1、通过高通量10x单细胞测序获得硬骨鱼免疫细胞图谱及NCC亚群信息。在对罗非鱼进行Poly I:C免疫刺激24 h后,取对照组和处理组的罗非鱼头肾并分离淋巴白细胞,通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）对24,062个淋巴细胞的转录本进行了分析,构建了罗非鱼淋巴细胞图谱。根据细胞异质性和已知标志物,将头肾淋巴细胞分为B细胞、T细胞、NCC和单核/巨噬细胞（Mo/MΦ）四种类型,WGCNA预测NCC群体的调控网络,鉴定出4个中枢基因（STBD1、VWF、PGP和GRN）和1个转录因子（Hvcn1）,并根据细胞异质性和细胞内功能基因的表达,进一步将NCC鉴定出memory-like NCC、mature NCC、immature NCC和pre-NCC4个亚群。2、与NCC互作的Gals蛋白鉴定。（1）从上述单细胞测序数据中筛选差异表达的Gal基因并进行克隆,获得5个Gal基因:Gal-2（OnGal-2）,Gal-3（OnGal-3）,Gal-4（OnGal-4）,Gal-8（OnGal-8）,Gal-9（OnGal-9）,序列特征分析显示基因均无信号肽,均含有至少一个碳水化合物识别域（CRD）以及碳水化合物识别位点（V-N,H-N-R以及W-E-R）,这一结构特征与其他物种的Gal蛋白序列特征一致。（2）分别构建Gal的酵母双杂交诱饵质粒,与NCCRP-1进行互作验证,发现Gal-2可与NCCRP-1相互作用;（3）构建OnGal原核表达载体（GST标签载体）,利用percoll密度梯度方法分离NCC,通过GST Pull-down技术从NCC裂解物中钓取互作蛋白,结果显示r OnGal-2和r OnGal-8筛选鉴定到共同的胞内互作蛋白为基质金属蛋白酶（MMP）;（4）亚细胞定位分析显示MMP与OnGal-2/OnGal-8在细胞内共定位。3、分析了依赖于NCCRP-1受体的OnGal-2的免疫调节功能及其对NCC的活性调控。（1）首先通过qRT-PCR分析OnGal-2的组织分布情况,该基因分布于健康罗非鱼的组织中,其中大脑表达水平最高,其次是脾脏、肝脏、肠道、心脏、胸腺、肌肉、皮肤、头肾和鳃。无乳链球菌刺激后,OnGal-2在胸腺、头肾、脾脏以及单核/巨噬细胞的表达量显着上调,表明OnGal-2参与了罗非鱼抗菌免疫应答。（2）随后制备重组蛋白r OnGal-2（His标签蛋白）对其功能开展系列研究。体外凝集实验发现r OnGal-2对G+（无乳链球菌,海豚链球菌,巴氏葡萄球菌和格氏乳球菌）和G-菌（大肠杆菌、哈维弧菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌）具有凝集和结合作用,多种糖类（LPS、LTA、Gal、Man以及Mal）能削弱r OnGal-2对细菌的结合,并且r OnGal-2能够促进单核/巨噬细胞对细菌的吞噬作用;r OnGal-2可以增强NCC效应基因（Fas L、NK-lysin、Perforin和Granzyme）表达及杀伤活性。（3）双荧光素酶报告系统检测结果表明OnGal-2能够激活NF-κB、IFN-1、STAT1以及ISRE信号通路;表明OnGal-2可能通过与MMP的结合参与NCCRP-1介导的NCC活性调控。（4）进一步的体内实验发现r OnGal-2注射至罗非鱼体内后可显着提高血清的抗菌活性（ALKP、ACP、LZM）和抗氧化能力（CAT、POD、SOD）,还能减少无乳链球菌感染后头肾、脾脏和肝脏中的载菌量、减轻组织损伤,且能调控NCC效应基因的相对表达量,从而提高感染后罗非鱼的相对存活率。4、研究了不依赖于NCCRP-1受体的OnGal-8免疫调节作用。（1）q RT-PCR分析显示OnGal-8在所有检查的组织中广泛存在,其中在脾脏中具有最高表达水平。在无乳链球菌刺激后,脾脏、头肾和脑的OnGal-8转录水平显着上调。（2）体外实验结果表明,OnGal-8重组蛋白（r OnGal-8）可以凝集红细胞、无乳链球菌和嗜水气单胞菌,结合无乳链球菌、嗜水气单胞菌和各种PAMP（脂多糖、脂蛋白、Poly I:C、肽聚糖、半乳糖、甘露糖和麦芽糖）。此外,r OnGal-8还能调节单核/巨噬细胞炎症相关基因表达、促进吞噬和呼吸爆发作用以及增强NCC的杀伤作用。（3）双荧光素酶报告基因检测结果表明OnGal-8过表达抑制NF-κB、IFN-1、STAT1以及ISRE信号通路活性,表明OnGal-8可以通过与MMP的互作参与对NCC的调控;（4）体内实验结果显示,OnGal-8过表达可通过调节血清抗菌活性（AKP、ACP和LZM）和抗氧化能力（CAT、POD和SOD）、降低感染组织中细菌的载量、减轻组织损伤以及增强NCC效应基因（CAS、FADD、Perforin1、Granzym和Fas L）表达来提高无乳链球菌感染后罗非鱼的存活率。
张伟伟[2]（2020）在《miR-218-5p靶向ZMIZ2抑制非小细胞肺癌细胞的增殖和迁移》文中提出研究背景与目的:肺癌作为全球范围内最为常见的恶性肿瘤,其发病率和死亡率均位居所有肿瘤前列。肺癌可分为小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）,其中非小细胞肺癌（NSCLC）占比高达85%。伴随靶向治疗的出现和不断完善,肿瘤的临床治疗手段得以丰富和细化,然而NSCLC患者的五年生存率和预后仍无显着突破,其主要原因是肿瘤的恶性增殖和迁移。MicroRNA可通过负向调控靶基因的表达广泛参与肿瘤的发生、发展,是肿瘤诊治和预后的一类重要分子靶标。研究表明ZMIZ2（zinc finger MIZ-type containing 2）在多种恶性肿瘤中高表达,与癌细胞的增殖与侵袭密切相关,但其在NSCLC中的作用及其调控机制未见报道。本研究旨在探讨miR-218-5p介导的ZMIZ2异常表达对NSCLC细胞增殖及迁移的影响及其调控机制,期许为NSCLC的临床诊治提供新的理论基础。研究方法:（1）利用Real-time PCR检测NSCLC临床样本中miR-218-5p和ZMIZ2 mRNA的表达,进一步分析ZMIZ2与NSCLC患者年龄、性别及转移等因素的关系。（2）通过生物信息学数据库（TargetScan）预测miR-218-5p与ZMIZ2基因的潜在作用关系,构建双荧光报告重组质粒,在NSCLC细胞中开展双荧光素酶实验（Dual luciferase reporter assay）验证 miR-218-5p 对 ZMIZ2 的靶向作用。（3）在A549和SPC-A1细胞株中瞬时转染miR-218-5p mimics,实时定量PCR（Real-time PCR）检测其过表达效率,进一步采用Real-time PCR和Western blot方法检测ZMIZ2的mRNA和蛋白表达水平。（4）分别利用Transwell实验、CCK-8试剂盒和流式细胞术检测过表达miR-218-5p对NSCLC细胞迁移、侵袭、增殖和细胞周期的影响。（5）利用慢病毒载体构建ZMIZ2过表达的NSCLC稳转细胞株,Real-time PCR和Western blot检测ZMIZ2的过表达效果,分别利用Transwell实验、CCK-8试剂盒和流式细胞术检测过表达ZMIZ2对NSCLC细胞迁移、侵袭、增殖和细胞周期的影响。（6）在A549和SPC-A1细胞株中转染靶向ZMIZ2的siRNAs（si-ZMIZ2-1和si-ZMIZ2-2）,Real-time PCR 和 Western blot 检测ZMIZ2 的敲降效果,分别利用Transwell实验、CCK-8试剂盒和流式细胞术检测敲降ZMIZ2对NSCLC细胞迁移、侵袭、增殖和细胞周期的影响。（7）将miR-218-5p mimics瞬时转染至ZMIZ2过表达的NSCLC稳转细胞株内,并利用Transwell实验、CCK-8试剂盒和流式细胞术检测ZMIZ2对miR-218-5p影响的细胞功能的回复作用。（8）在 A549 和 SPC-A1 细胞株中转染 miR-218-5p mimics,Real-time PCR 检测C/EBPβ和IL-6的mRNA表达,Western blot检测ZMIZ2、C/EBPβ、p-C/EBPβ和IL-6的蛋白表达。研究结果:（1）在59对NSCLC临床样本中,与癌旁组织相比,癌组织中miR-218-5p的mRNA表达水平显着下调（p<0.05）,而ZMIZ2 mRNA表达水平显着上调（p<0.01）,进一步分析发现,ZMIZ2 mRNA表达水平与患者性别、年龄及病理等因素密切相关。（2）TargetScan数据库预测提示ZMIZ2基因3’UTR区的617-624序列与miR-218-5p靶向互补。双荧光素酶实验（Dual luciferase reporter assay）进一步证实miR-218-5p对ZMIZ2的靶向作用。（3）在NSCLC细胞株中,过表达miR-218-5p显着降低ZMIZ2 mRNA和蛋白表达水平,并且显着抑制细胞迁移、侵袭、增殖能力以及阻滞细胞周期。（4）成功构建、筛选出ZMIZ2过表达的NSCLC稳转细胞株,过表达ZMIZ2显着增强细胞迁移、侵袭、增殖能力以及促进细胞周期;而si-ZMIZ2有效敲弱ZMIZ2的表达并显着抑制细胞迁移、侵袭、增殖能力以及阻滞细胞周期。（5）回复实验结果显示过表达ZMIZ2能够显着恢复miR-218-5p对NSCLC细胞迁移、侵袭和增殖的抑制效应。（6）miR-218-5p 可以下调 ZMIZ2、C/EBPβ、p-C/EBPβ和 IL-6 的表达。研究结论:在NSCLC细胞株中,ZMIZ2扮演促癌角色,miR-218-5p通过负向调控ZMIZ2基因的表达而发挥抑癌作用,其可能的机制是miR-218-5p负向调控ZMIZ2/C/EBPβ/IL-6轴以发挥抑癌功能。提示将miR-218-5p列为NSCLC临床诊治及预后的标志物且具有一定的科学和应用价值。
金张雅[3]（2020）在《乳腺癌脑转移细胞系靶向肽BRBP1结合靶分子的筛选与鉴定》文中研究说明乳腺癌（breast cancer）严重危害女性健康,乳腺癌细胞一旦发生脑转移,患者生活质量及生存时间显着降低,乳腺癌脑转移的分子机制目前尚不清楚。筛选及鉴定乳腺癌细胞脑转移相关分子,探究乳腺癌脑转移的分子机制,发现并确定脑转移性乳腺癌诊断与治疗的新靶标具有重要意义。本实验室前期通过噬菌体展示肽库筛选技术,获得乳腺癌脑转移细胞系231-BR靶向多肽—BRBP1肽（专利号:ZL201210538671.4）。荷瘤鼠模型体内实验证实该肽与231-BR细胞呈特异性结合;乳腺癌临床标本检测结果显示,该肽与人乳腺浸润性导管癌原发灶组织标本结合,并且与转移灶肿瘤细胞结合更强。BRBP1肽与乳腺癌细胞系以及临床标本的结合特异性,提示该肽可能结合高转移潜能乳腺癌细胞表面的脑转移相关分子。为筛选231-BR细胞表面与BRBP1肽结合的靶分子,本实验室前期将BRBP1肽与免疫球蛋白G（immunoglobulin G,Ig G）Fc段融合成肽体,与231-BR细胞总蛋白免疫共沉淀（co-immunoprecipitation,Co-IP）（Fc与231-BR细胞总蛋白Co-IP作为对照）,同时将生物素化BRBP1肽与231-BR细胞膜蛋白Co-IP（生物素化BRBP1肽与MDA-MB-231、MCF-7细胞膜蛋白Co-IP作为对照）。将Co-IP产物银染后,选取实验组Co-IP产物泳道的特异性条带进行质谱分析及筛选鉴定,但均未获得BRBP1肽结合靶分子。因此,本研究进一步探究BRBP1肽结合靶分子。1.乳腺癌脑转移细胞系靶向肽BRBP1结合候选靶分子的鉴定目的:据文献报道,膜突蛋白（moesin,MSN）和肝配蛋白B1（ephrin-B1,EFNB1）在乳腺癌脑转移细胞系231-BR中表达高于亲代细胞系MDA-MB-231,且与细胞转移侵袭有关,有可能是BRBP1肽结合靶分子。此外,本实验室前期通过筛选还获得候选靶分子葡萄球菌核酸酶结构域1（staphylococcal nuclease domain-containing 1,SND1）。因此,本章进一步鉴定MSN、EFNB1、SND1这三个候选靶分子。方法:分别基于MSN和EFNB1基因构建过表达质粒并转染至MCF-7细胞过表达MSN、EFNB1;基于SND1基因合成si RNA-SND1,转染至231-BR细胞干扰SND1表达;流式细胞术鉴定上述细胞与BRBP1肽的结合情况。结果:成功构建pc DNA3.1（-）-MSN与pc DNA3.1（-）-EFNB1质粒并在MCF-7细胞中过表达,但MSN、EFNB1表达上调的MCF-7细胞所结合BRBP1肽均无增加。si RNA-SND1成功干扰231-BR细胞中SND1的表达,但SND1表达下调的231-BR细胞所结合BRBP1肽未减少。结论:MSN、EFNB1、SND1均不是BRBP1肽结合靶分子,后续需要采用新的方法,重新筛选候选靶分子。2.乳腺癌脑转移细胞系靶向肽BRBP1结合靶分子的筛选目的:尝试通过截短或者环化BRBP1多肽以提高其亲和力;基于Co-IP实验思路,分别利用生物素修饰多肽BRBP1-biotin以及BRBP1肽与人Ig G1 Fc段融合形成的BRBP1-Fc1肽体,进行靶分子筛选;流式分选出BRBP1肽高结合的231-BR细胞以及BRBP1肽低结合的231-BR细胞,转录组测序获得差异基因,并进一步分析筛选靶分子。方法:利用数据库预测BRBP1肽中与靶分子结合的关键氨基酸位点,据此设计BRBP1截短肽及环肽并鉴定改造后多肽与231-BR细胞的结合性能。BRBP1-biotin通过Pull-down捕获231-BR细胞蛋白（生物素修饰的无关多肽GK-biotin作为对照）,Western blot进一步鉴定捕获产物（一抗BRBP1-biotin,二抗Streptavidin-HRP）;基于Western blot结果提示BRBP1-biotin所捕获分子的分子量,质谱分析捕获产物银染后对应位置的条带。利用化学交联试剂DTSSP固定BRBP1-Fc1肽体与231-BR细胞间结合（Fc1与同一细胞交联作为对照）,提取细胞总蛋白并用Protein G磁珠纯化肽体（或Fc1）及其偶联产物,纯化产物进行银染,选择肽体纯化产物泳道出现的特异性条带进行质谱分析。利用流式细胞分选术,获得荧光信号最强（结合BRBP1-TAMRA最多）和信号最弱（结合BRBP1-TAMRA最少）的两组231-BR细胞,进行转录组测序,结合文献报道的转录组测序结果,分析筛选差异基因并进行鉴定。结果:两种截短线性肽与231-BR细胞结合性能均弱于BRBP1肽,C6及C9环肽与231-BR细胞不结合。Western blot结果显示BRBP1-biotin Pull-down产物泳道未出现不同于GK-biotin Pull-down产物泳道的特异性条带。成功改造载体并表达得到高纯度BRBP1-Fc1肽体,银染未检测到BRBP1-Fc1交联产物电泳后不同于Fc1交联产物的特异性条带。通过对转录组测序结果分析筛选,得到8个候选靶分子。结论:截短或环化BRBP1肽并未增加与231-BR细胞亲和力;BRBP1-biotin Pull down细胞蛋白,以及DTSSP交联BRBP1-Fc1与细胞的方法也未捕获到BRBP1肽的候选靶分子;转录组测序分析筛选得到8个候选分子。本实验室前期将髓系白血病细胞系HL-60作为原始细胞,通过药物浓度递增间歇诱导法,获得多药耐药（drug-resistance）细胞株HL-60R,利用噬菌体展示肽库消减筛选技术获得与HL-60R结合的5R5肽。该肽与白血病耐药细胞株以及髓系白血病患者骨髓涂片均具有良好结合特异性,提示该肽具有临床应用潜能,并且该肽结合的靶分子可能与白血病细胞耐药相关。本研究在初步鉴定5R5肽临床意义的基础上,构建了5R5-Fc肽体,期望通过多价展示5R5肽来增强肽体与HL-60R细胞亲合力,进而提高5R5-Fc肽体在白血病诊断与治疗中的应用价值,也为5R5肽靶分子的探究奠定实验基础。1.5R5肽临床意义的初步鉴定目的:收集临床髓系白血病患者骨髓涂片,鉴定5R5肽与骨髓涂片结合特异性,以初步判断该多肽的临床意义。方法:合成荧光修饰多肽5R5-TAMRA与对照肽GK-TAMRA,将每张骨髓涂片划分为两个区域,分别孵育5R5-TAMRA与GK-TAMRA,荧光显微镜观察5R5肽与骨髓涂片的结合。结果:5R5肽与四例正常人骨髓涂片均不结合,与16例髓系白血病患者骨髓涂片中,5例呈强阳性结合、9例呈阳性结合、2例不结合,结合阳性率为87.5%。结论:5R5肽与髓系白血病患者骨髓涂片呈特异性结合,初步提示5R5肽具有临床应用潜能,可继续扩大样本量进行验证及统计分析。2.5R5-Fc1二价肽体真核表达质粒载体构建、表达与鉴定目的:免疫球蛋白Ig G1 Fc结构域能够介导较强的免疫效应功能,是开发肽体类药物的良好选择。本节利用Ig G1 Fc与5R5肽融合,构建真核表达的二价5R5-Fc1肽体。方法:Eco RI和Nco I双酶切p FUSE-h Ig G1-Fc得到线性化载体,并合成带有Eco RI和Nco I酶切位点以及Gly-GLy-Gly-Ser linker的5R5肽基因片段,T4连接酶将线性化载体与基因片段连接;将真核表达质粒载体p FUSE-h Ig G1-Fc-5R5转染至293T细胞进行表达,Western blot检测培养上清中5R5-Fc1肽体,流式细胞术鉴定其结合性能。结果:成功构建真核表达质粒载体p FUSE-h Ig G1-Fc-5R5并表达5R5-Fc1肽体,该肽体与HL-60R细胞间结合并不显着高于Fc1与HL-60R细胞间结合。结论:因耐药细胞株HL-60R表达FcγR,Fc1与FcγR间亲合力高于5R5肽与HL-60R细胞间亲合力,导致5R5-Fc1肽体通过其Fc端“倒立”结合至耐药细胞株,无法实现5R5肽依赖性的特异性结合。后续选择利用与FcγR亲和力较低的Ig G4 Fc构建肽体,在5R5-Fc肽体与HL-60R细胞间实现5R5肽依赖性的特异性结合。3.（5R5）2-Fc4四价肽体原核表达质粒载体构建、表达与鉴定目的:选取与FcγR亲和力较低的Ig G4 Fc,并延长多肽与Fc之间linker长度,将两个重复拷贝的5R5多肽串联至Ig G4 Fc,构建四价（5R5）2-Fc4肽体,预期在该肽体与HL-60R细胞间,实现5R5肽依赖性的特异性结合。方法:构建肽体的原核表达质粒载体p ET-16b-（5R5）2-Fc4,转化至BL21,原核表达四价（5R5）2-Fc4肽体,考马斯亮蓝染色鉴定肽体表达,流式细胞术鉴定其结合性能。结果:成功构建原核表达质粒载体p ET-16b-（5R5）2-Fc4并表达四价（5R5）2-Fc4肽体。（5R5）2-Fc4肽体与HL-60R细胞结合并不显着高于Fc4与HL-60R细胞间结合。结论:5R5肽与其靶分子亲和力仍然弱于Fc4与FcγR亲和力,导致（5R5）2-Fc4肽体仍然由于Fc端与HL-60R细胞表面FcγR相互作用而“倒立”结合至细胞,无法依赖于5R5肽而特异性结合。后续实验中,可以考虑改造5R5肽提高亲合力或者突变Fc,消除其与FcγR结合能力,构建依赖于5R5肽与耐药细胞株HL-60R特异性结合的肽体。
何聪[4]（2020）在《增强型NKG2D-CAR T细胞抗前列腺癌作用及其机制的研究》文中认为CAR T细胞免疫疗法的出现,是人类癌症治疗领域的一个重要里程碑。CAR T细胞在血液系统恶性肿瘤中疗效显着,但其在实体肿瘤治疗过程中依然面临着巨大挑战,因此提高CAR T细胞在实体瘤中的疗效是目前急需解决的重大科学前沿问题。NKG2D是一种主要表达于NK细胞的激活性免疫受体,与配体结合后可激活NK细胞,进而释放细胞毒性颗粒和细胞因子发挥杀伤作用。由于NKG2D的配体在多种肿瘤中高表达,以NKG2D作为靶向分子的CAR T细胞治疗NKG2D配体高表达的肿瘤成为一种很有前途的免疫治疗方法。前列腺癌是一种上皮组织恶性肿瘤,其发病率高,复发和转移风险较大,且目前治疗转移性前列腺癌的手段非常有限,因此亟需新的安全有效的策略来治疗转移性前列腺癌。本研究中我们发现前列腺肿瘤细胞高表达NKG2D的配体,通过细胞毒性实验检测发现NKG2D-CAR T细胞对三种前列腺癌细胞系均有杀伤效果,表明使用NKG2D-CAR靶向治疗前列腺癌是一种可行有效的方法。然而和大多数实体肿瘤一样,前列腺肿瘤尤其是发生转移的肿瘤,具有强大的免疫抑制微环境,能够抑制CAR T细胞的增殖、存活和抗肿瘤效应,因此本研究在NKG2D-CAR T细胞的基础上,通过共表达IL-7或下调GPR116的表达来增强CAR T细胞的增殖、存活和抗肿瘤功能,进而为提高前列腺癌以及更多实体瘤的疗效提供新的思路和潜在靶点,为临床应用和疾病治疗提供理论依据。第一部分共表达细胞因子IL-7增强NKG2D-CAR T细胞抗前列腺癌的研究细胞因子IL-7作为一种细胞生长因子,具有促进T细胞增殖、存活以及维持记忆性T细胞生长等功能。为了探究IL-7在CAR T细胞功能中的调控作用及机制,我们制备了共表达IL-7的NKG2D-CAR T细胞,检测发现NKG2DIL7-CAR T细胞具有更高的活化水平以及更强的杀伤前列腺癌PC-3细胞的能力。之后我们对两种CAR T细胞的增殖、凋亡和耗竭等功能进行了检测,结果表明,与靶细胞共培养后,相比于NKG2D-CAR T细胞,NKG2DIL7-CAR T细胞的增殖能力更强,CD8+T细胞亚群的比例更高,并且凋亡细胞比例降低,胞内抗凋亡蛋白Bcl-2的表达升高,且其主要由CD8+T细胞中Bcl-2的表达升高导致。我们还发现NKG2DIL7-CAR T细胞表达更低水平的耗竭分子PD-1和Tim-3,且Tscm样细胞比例更高,以上结果均预示着NKG2DIL7-CAR T细胞具有更强的抗肿瘤功能。我们进一步利用免疫缺陷小鼠的前列腺癌模型进行验证,相比于未治疗组,两种CAR T细胞均有明显的抗肿瘤效果,而NKG2DIL7-CAR T细胞的效果更显着,肿瘤组织中T细胞的积累更明显,且CD8+T细胞比例更高。综上,本研究表明共表达IL-7能够增强NKG2D-CAR T细胞的杀伤、增殖和存活,降低NKG2D-CAR T细胞的凋亡和耗竭,进而增强NKG2D-CAR T细胞抗前列腺癌的效果。本研究为增强CAR T细胞的抗肿瘤效应提供了一种新的思路,也为提高前列腺癌及更多实体瘤的治疗提供了一种新的线索和方向。第二部分下调GPR116的表达增强NKG2D-CAR T细胞抗前列腺癌的研究研究报道,黏附性G蛋白偶联受体GPR116能够参与免疫系统的调节,但其具体功能及机制尚不清楚。前期实验我们发现,与野生型小鼠相比,Gpr116敲除小鼠的脾脏显着增大,且脾脏中CD8+T细胞激活后分泌更高水平的IFN-γ,提示我们GPR116受体可能影响CD8+T细胞的细胞毒性功能。因此我们构建了鼠源的NKG2D-CAR,通过制备野生型和Gpr116敲除型的mNKG2D-CAR T细胞,比较GPR116是否影响CAR T细胞的细胞毒性功能。结果表明,Gpr116敲除的mNKG2D-CAR T细胞杀伤小鼠前列腺癌细胞的效果更强,表达更高水平的激活分子CD25和CD107a,分泌更多的IFN-γ和颗粒酶B。另外我们还发现Gpr116敲除后能显着促进mNKG2D-CAR T细胞的增殖,且体内的抗肿瘤效果也更明显。随后为了进一步验证GPR116对NKG2D-CAR T细胞抗肿瘤功能的影响,我们通过RNA干扰的方法构建并筛选出GPR116敲低效果最显着的shRNA序列及载体,进一步制备人源的NKG2D-CAR T细胞来检测其抗肿瘤功能。与鼠源CAR T的结果相一致,GPR116下调后能明显增强NKG2D-CAR T细胞对前列腺癌细胞PC-3的杀伤,116shRNA-G2DCAR T细胞的激活分子CD69和CD107a的表达升高,IFN-γ和颗粒酶B的分泌增加,增殖和抗凋亡功能增强,并且体内的抗肿瘤效果明显更强。以上结果表明GPR116是一种负调控蛋白,其下调后能够增强NKG2D-CAR T细胞的杀伤、增殖和抗凋亡等功能,从而增强NKG2D-CAR T细胞的抗肿瘤效果。我们进一步对其负调控机制进行了探究,Western blot检测发现GPR116受体通过调节Gαq蛋白来抑制下游的PI3K-Akt-NF-κB信号通路,进而影响T细胞的功能。本研究为增强CAR T细胞的抗肿瘤功能寻找到了一个新的靶点和方向,也为提高实体瘤治疗以及药物靶点开发提供了新的理论依据。
张雅静[5]（2020）在《胃癌癌变过程分子特征的研究 基于免疫组预测鼻咽癌远处转移的研究》文中研究指明该博士学位论文由相对独立的两部分工作组成,其中第一部分分为两章。第一部分胃癌癌变过程分子特征的研究第一章利用肠型胃癌癌前病变组织及早期胃癌组织基因表达谱深度剖析肠型胃癌癌变过程中重要分子特征的研究肠型胃癌具有明确的、多阶段的组织学演变过程。迄今为止,没有研究综合性地探索过胃癌癌变的整个过程。本课题中,我们试图探索肠型胃癌癌变过程中的特征,识别其中包含的预后信息。我们入组了 47位患者的94个样本,包括胃癌癌前病变组织（GPL:低级别上皮内瘤变（LGIN）和高级别上皮内瘤变（HGIN）组织）、早期胃癌组织（EGC）和各自配对的对照组织,并对每个样本进行了安捷伦芯片检测。结果发现,相比于EGC组织,LGIN和HGIN组织的表达谱更加接近,HGIN相对于LGIN组织出现潜在的侵袭特性,而EGC组织中免疫微环境的活跃性显着高于GPLs组织。肠型胃癌癌变过程中,活性异常的肿瘤特征数量逐渐增多,病变组织胃上皮细胞的干细胞特性显着高于对照组织中。肠型胃癌癌变过程中包含了许多与胃癌患者总生存和无病生存显着相关的基因特征集,这些基因特征集对胃癌患者生存的预测效能显着高于已经建立的基因集模型。此外,在肠型胃癌癌变过程中持续低表达和持续发生差异共表达的基因GSTM2,与胃癌患者的耐药性相关。总之,在肠型胃癌癌变过程中,类似胃癌中发生的变化在LGIN阶段已经发生,并且在HGIN和EGC组织中进一步累积。HGIN相对于LGIN组织获得潜在的侵袭特性,而EGC中的免疫微环境活跃性显着高于癌前病变组织。肠型胃癌癌变过程中识别到的基因特征集对胃癌患者生存的预测具有强健的效能。第二章时间进展性肠型胃癌癌前病变组织及癌组织多组学测序的研究胃癌的基因组异常分子事件（基因突变、拷贝数变异和基因融合等）已被大体描绘,但是它们的发生顺序依旧未知。胃癌是一种复杂的异质性疾病。本课题中,我们入组两位胃疾病患者,对同一患者、不同时间点采集的相对正常胃粘膜组织、低级别上皮内瘤变（LGIN）组织、高级别上皮内瘤变（HGIN）组织和胃癌（GC）组织,以及外周血白细胞进行全基因组、全外显子组和转录组的多组学测序。我们发现,正常胃粘膜组织中存在一定量的基因突变、拷贝数变异和基因融合等事件,但不存在驱动基因的突变,癌前病变组织（GPLs）中出现驱动基因的突变。癌前病变组织中各类基因组分子事件与胃癌中相似。在胃癌癌变过程中,拷贝数变异事件可能发生在基因突变之前。此外,我们还检出了可能在胃癌癌变中发挥重要作用的高频突变基因SVEP1。第二部分基于免疫组预测鼻咽癌远处转移的研究迄今为止,尚无适合所有鼻咽癌患者来预测远处转移的外周血生物标志物。外周血T淋巴细胞受体序列库（TCR repertoire）已经在多种癌种中实现了生存的预测。我们通过高通量测序检测非远处转移性（nM group,n=21）和治疗后发生远处转移（M group,n=19）的鼻咽癌患者治疗前和治疗后外周血中的TCR repertoire,并且比较了 nM组和M组患者间TCR repertoire的动态变化,探索了 TCR repertoire对鼻咽癌患者治疗后发生远处转移的预测价值。我们发现,在nM和M两组中,治疗后top10%和top100克隆的累积频率均显着升高,TCR repertoire的丰富度和均衡性均显着降低。但是,无论是在整个TCR repertoire中还是在重叠克隆中,nM组中大克隆比例增加量均显着高于M组。M组患者治疗后TCR repertoire的多样性显着降低,而nM组则没有。更重要的是,TCR repertoire多样性升高（log rank test:p=0.036）、治疗前和治疗后样本间TCR repertoire的相似性高（log rank test:p=0.014）与较好的无远处转移生存相关。对于TCR repertoire多样性降低的鼻咽癌患者,治疗前后TCR repertoire的相似性仍然具有强健的无远处转移预测效能。总之,治疗对非远处转移性和治疗后发生远处转移的鼻咽癌患者的TCR repertoire的组成产生不同的影响。TCR repertoire多样性的动态变化和TCR repertoire组成的相似性可以作为所有鼻咽癌患者的无创的无远处转移生存预测指标。
陈艾[6]（2019）在《IDH1突变体引起的糖脂代谢改变及其在肿瘤发生中的可能作用》文中研究指明异柠檬酸脱氢酶1（IDH1）催化异柠檬酸氧化脱羧形成α-酮戊二酸（α-KG）。近年来,IDH1 Arg132位点的各种突变体被发现能催化产生大量的癌性代谢产物2-HG,导致胶质瘤、急性髓细胞性白血病和肝癌等多种肿瘤的发生。研究表明,2-HG致癌的机理与其抑制α-KG依赖的双加氧酶,增强HIF-1α的表达,并引起DNA或组蛋白的高甲基化,阻碍细胞分化等有关。糖脂代谢重塑在肿瘤发生中起重要作用,然而,目前尚缺乏在动物水平对IDH1突变体导致的糖脂代谢紊乱及其在肿瘤发生中的作用的较为全面的研究。由于肝脏是机体糖脂代谢的核心器官,因此,我们构建了肝脏特异性表达IDH1 R132Q的基因敲入小鼠（Alb-KI小鼠）,初步研究了 IDH1突变引起的糖脂代谢改变。我们发现与野生型小鼠相比Alb-KI小鼠的体型显着变小,体重减轻,肝脏会产生大量的2-HG并伴有自发性肝癌的形成,且生存期显着缩短。Alb-KI小鼠的代谢模式发生了显着改变:日)由于大量的碳源以2-HG的方式被排出体外,突变体小鼠表现为高消耗的代谢模式,进食量和分解代谢明显增强。（2）Alb-KI小鼠肝脏的糖代谢明显改变,表现为糖酵解及乳酸生成显着增强、血糖浓度减低,相应的糖酵解的关键酶的表达均被上调。（3）TCA循环中的α-KG脱氢酶被2-HG抑制,且线粒体氧化磷酸化的能力被削弱。（4）小鼠体脂含量降低,脂肪酸从头合成通路受到抑制,而脂肪酸β-氧化显着增强,相应的该通路的限速酶CPT1A被上调。上述代谢模式的改变在携带天然IDH1 R132C突变体的HT1080肿瘤细胞及过表达IDH1 R132H突变体的HepG2肝癌细胞中得到了验证。进一步研究表明在IDH1突变情况下,脂肪酸的分解代谢的增强显得尤为重要:一方面可以提供能量,更重要的是可以通过IDH2产生NADPH,清除ROS,抑制脂肪酸β-氧化的关键酶CPT1A能显着抑制IDH1突变体细胞的存活及增殖,说明这种代谢改变在肿瘤发生中起重要作用。总之,我们利用Alb-KI小鼠揭示了 IDH1突变引起的糖脂代谢模式的改变,探讨了其在肿瘤发生中的作用,并为IDH1突变体所致肿瘤的治疗提供了潜在的靶点。
吴迪[7]（2019）在《卵巢癌干细胞疫苗抗卵巢癌疗效及机制研究》文中提出卵巢癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一,其中上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer,EOC）占85%-90%。尽管化疗方案不断优化,但是EOC治疗效果却不尽人意,5年生存率仍徘徊于30%-40%,复发率超过60%,死亡率居妇科恶性肿瘤首位。EOC已成为严重威胁女性生命和健康的恶性肿瘤。癌干细胞（cancer stem cell,CSC）是肿瘤组织中一小部分具有自我更新、分化、无限增殖等干细胞特性的肿瘤细胞,是肿瘤发生发展的根源,与肿瘤的化疗耐药、转移侵袭以及复发密切相关。所以,探究EOC CSC的特性,寻找针对靶向CSC治疗EOC有效方法,是控制并根治卵巢癌的关键。近年来肿瘤免疫治疗受到高度关注,在基础研究和临床应用研究方面都取得了一些可喜的进展,而针对靶向CSC的免疫治疗目前主要倾向于:靶向CSC表型的免疫治疗、靶向CSC的T细胞过继免疫、靶向CSC的DC疫苗、靶向CSC憩室的免疫治疗、免疫检查点、CSC疫苗等,特别是疫苗研究,因其能激活机体的自然杀伤细胞（NK）和特异性细胞毒性T细胞（CTL）、产生抗肿瘤的保护性抗体等免疫应答,是一种有应用前景的肿瘤免疫治疗方法。然而,由于肿瘤抗原免疫原性较弱、肿瘤的异质性、肿瘤免疫逃逸机制的复杂性等原因,尽管有众多的可喜研究报道,但肿瘤疫苗的实际疗效与预期效果仍有很大的差距,要作为治疗性肿瘤疫苗用于临床,仍有一些障碍需要克服,关键是如何提高肿瘤疫苗免疫原性,激发宿主免疫反应对瘤细胞免疫攻击。最新研究显示,CSC疫苗因其高表达优势抗原,可引发有效的靶向CSC免疫反应,达到抑制肿瘤生长和转移的效应,更引人关注。本课题组前期研究已发现,CD44+CD117+的EOC SKOV3/HO8910细胞具有CSC特性。因此,本研究将EOC CSC分离出来,采用简捷的工艺方法直接制备溶解完整的CSC疫苗,探究该疫苗抗卵巢癌效应及其机制。目的:探究EOC CSC疫苗在动物体内诱发抗肿瘤效应及其可能机制,为今后临床上使用该疫苗防治卵巢癌提供实验和理论依据。方法:1.通过免疫磁珠分选系统（MACS）从人EOC SKOV3/HO8910两种细胞系中分离出CD117+CD44+CSC,经反复冻融三次将其制备成CSC疫苗再接种到免疫缺陷的裸鼠体内（4×105CD117+CD44+CSC/鼠）,总共三次,每两次免疫间隔10天,末次免疫后第10天,再用5×106个野生型SKOV3/HO8910细胞皮下攻击免疫小鼠。通过观察体内肿瘤生长及各免疫小鼠生存情况,初步评价SKOV3和HO8910 CSC疫苗的抗癌效果。通过流式细胞仪（FCM）分析免疫鼠肿瘤细胞的CD117+CD44+亚群以及I型乙醛脱氢酶高表达(ALDH-1high)细胞群比例;此外,酶联免疫吸附实验（ELISA）检测小鼠外周血清IFN-γ和TGF-β细胞因子水平,细胞杀伤实验测定NK细胞杀伤能力,实时定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）和免疫印迹实验（Western blotting）检测小鼠肿瘤组织中颗粒酶和穿孔素以及NKG2D和MICA的表达水平,初步分析抗瘤效应及其分子机制。同时,经NOD/SCID鼠模型反向验证CSC疫苗的免疫效应。2.因受体酪氨酸激酶孤儿样受体1（ROR1）分子可能是EOC CSC的一种优势抗原,在CSC疫苗激发机体免疫反应中具有重要作用。本研究分别设计针对ROR1基因序列短发夹RNA（shROR1）以及采用Gateway位点专一性重组方法,扩增ROR1序列,分别构建下调或上调ROR1的慢病毒重组质粒（pLV-shROR1或pLV-ovROR1）,进行慢病毒包装,利用倍比稀释法测定病毒滴度,再将含有pLV-shROR1和pLV-ovROR1慢病毒感染细胞,筛选出稳定表达ROR1的细胞克隆并扩大培养。用MACS分离出HO8910-pLV-shROR1 CD117+CD44+CSC（简称HO8910-shROR1 CSC）和HO8910-pLV-ovROR1CD117+CD44+CSC（HO8910-ovROR1 CSC）,用上述同样方法制备成疫苗后接种到免疫缺陷的裸鼠体内,再用5×106个野生型HO8910细胞皮下攻击免疫小鼠。经体内致瘤实验分别评价下调或上调ROR1的HO8910 CSC疫苗的抗癌效果;FCM、ELISA、NK杀伤实验、qRT-PCR、Western blotting等实验进一步分析优势抗原ROR1对HO8910 CSC疫苗抗瘤效应的影响。3.用无血清培养法（SFM）,筛选出鼠源性EOC细胞株ID8卵巢癌干样细胞（OCSC）,取2×105OCSC经反复冻融三次将其制备成疫苗,接种到C57BL/6小鼠体内,总共三次,每两次免疫间隔10天,末次免疫后第10天,再用2×106个野生型ID8细胞皮下攻击免疫小鼠,观察免疫小鼠生存和肿瘤生长情况。继而构建下调ROR1的重组质粒,进行慢病毒包装并使用倍比稀释法测定病毒滴度,将含有pLV-shROR1的慢病毒感染小鼠卵巢癌ID8细胞,用qRT-PCR和Western bloting分析ID8细胞中ROR1分子下调表达情况。再用上述同样方法,在C57BL/6小鼠体内评价ID8-OCSC和ID8-OCSC-shROR1疫苗抗癌效果。采用FCM、ELISA、NK杀伤实验、CD4+T和CD8+T细胞杀伤实验、补体依赖的细胞毒活性（CDC）,qRT-PCR和Western blotting进一步分析疫苗诱发的免疫反应以及抗瘤效应与机制。此外,本研究还进行了用树突状细胞（DC）负载OCSC裂解物用于疫苗实验,试图比较两种方法制备的疫苗在诱导免疫鼠抗EOC效应是否有明显差异。结果:1.疫苗免疫鼠肿瘤体积大小、瘤体生长曲线及小鼠无瘤生存期显示,SKOV3/HO8910 CD117+CD44+CSC疫苗能在无胸腺裸鼠体内中诱导免疫反应,体现在接种CD117+CD44+CSC疫苗的小鼠,与non-CD117+CD44+CSC疫苗组和SKOV3/HO8910细胞疫苗组及PBS组相比,肿瘤形成时间延迟、肿瘤体积较小、荷瘤鼠生存时间延长;血清中IFN-γ水平升高,TGF-β水平降低,且具有较强的NK杀伤活性。这些结果与不同对照组相比,差异有显着性意义（p（27）0.05）。另外,qRT-PCR结果显示,SKOV3/HO8910 CD117+CD44+CSC疫苗免疫的小鼠肿瘤组织中,具有更高水平的穿孔素和颗粒酶表达;同时,qRT-PCR和Western blotting结果显示,肿瘤组织中具有高水平的NKG2D和MIC A表达（p（27）0.05）。此外,SKOV3/HO8910 CD117+CD44+CSC疫苗能够显着地减少小鼠卵巢癌异体移植瘤组织中CD117+CD44+CSC细胞群以及ALDH-1high细胞群比例。结果提示:SKOV3/HO8910CSC疫苗能靶向杀伤EOC CSC,抑制裸鼠体内肿瘤生长;而在NOD/SCID鼠模型因其T和B淋巴细胞严重缺乏,却没有明显抑瘤效应,从而反向证明了CSC疫苗的抗瘤效应是因其诱发免疫效应所致。2.分别筛选出感染pLV-shROR1的HO8910-pLV-shROR1细胞（简称HO8910-shROR1）和过表达ROR1分子的HO8910-pLV-ROR1细胞（简称HO8910-ovROR1）。qRT-PCR和Western blotting分析显示,ROR1分子分别被有效地下调和上调,表明从基因和蛋白水平证实,在HO8910细胞调控ROR1表达成功。HO8910-shROR1或HO8910-ovROR1细胞扩大培养后,经MACS分选出CD117+CD44+CSC,制备疫苗免疫裸鼠结果显示,HO8910-shROR1和HO8910-ovROR1以及HO8910三组CD117+CD44+CSC疫苗,在免疫鼠激发的抗HO8910卵巢癌效应中,HO8910-ovROR1 CSC疫苗抗瘤效果最强,小鼠肿瘤生长最慢,体积最小,无瘤生存期最长,HO8910 CSC疫苗次之（p（27）0.05）,HO8910-shROR1疫苗最低（p（27）0.05）。ROR1高表达的HO8910-ovROR1 CSC疫苗免疫鼠,在三组疫苗免疫鼠中,血清IFN-γ和抗ROR1水平最高,而TGF-β水平最低;同时,NK杀伤能力也最强。qRT-PCR结果显示HO8910-ovROR1 CSC疫苗组,小鼠肿瘤组织中含有较高水平的颗粒酶和穿孔素,qRT-PCR和Western blotting显示,表达高水平NKG2D和MIC A（p（27）0.05）。此外,以HO8910-ovROR1 CSC为基础的疫苗能够更明显地下调裸鼠卵巢癌异体移植瘤组织中CD117+CD44+CSC亚群以及ALDHhigh细胞群的比例。以上结果证实:ROR1分子可能是EOC CSC疫苗的优势抗原,在HO8910 CSC疫苗中发挥关键的免疫原性作用。3.ID8-OCSC疫苗在C57BL/6小鼠体内抗肿瘤实验结果显示,从肿瘤生长速度、肿瘤大小以及无瘤生存期显示方面,明显优于非ID8-OCSC疫苗组,差异有统计学意义（p<0.05）。将ROR1分子下调后,ID8-OCSC-shROR1疫苗组小鼠的抗肿瘤效应显着弱于ID8-OCSC疫苗组（p<0.05）,且NK细胞和脾细胞杀伤能力、抗体水平、CDC活性、血清IFN-γ水平等均显着下降（p<0.05）,但TGF-β水平则升高（p（27）0.05）。对ID8-OCSC疫苗激发免疫鼠脾脏T细胞功能检测显示,分离的CD4+T和CD8+T细胞对靶细胞杀伤实验与与ID8-OCSC-shROR1疫苗相相比,ID8-OCSC疫苗免疫鼠的CD4+T和CD8+T杀伤能力最强,特别是CD8+T的杀伤能力更为明显。qRT-PCR分析显示,ID8-OCSC疫苗组瘤组织中颗粒酶和穿孔素分子表达高于ID8-OCSC-shROR1和ID8疫苗组;同时,NKG2D和MIC A的水平也高于其他对照组,差异有显着性意义（p（27）0.05）。此外,FCM分析肿瘤组织中ALDHhigh细胞群比例明显减少,而ID8-OCSC-shROR1和ID8疫苗组依次增高,提示ID8-OCSC疫苗能诱导免疫鼠靶向杀伤OCSC。该结果不仅说明ID8 OCSC疫苗有较强的抗肿瘤免疫效应,而且进一步证实ROR1分子可能是ID8 OCSC疫苗的优势抗原,当其下调后,在C57BL/6小鼠诱发抗肿瘤免疫效应也随之减弱。此外,反复冻融OCSC制备的疫苗与反复冻融OCSC负载DC制备的疫苗诱导小鼠的抗EOC效应相似,虽略有差异,但无统计学意义。结论:1.人源性EOC SKOV3/HO8910 CD117+CD44+CSC疫苗能诱导免疫鼠产生抗肿瘤效应,拮抗卵巢癌生长,其效应机制与其高表达ROR1优势抗原诱导强免疫反应相关,下调或上调ROR1分子表达,可影响CSC疫苗的免疫效应和抗卵巢癌效应。2.鼠源性ID8 OCSC疫苗能诱发C57BL/6免疫鼠产生免疫效应而抑制卵巢癌生长,其效应机制与其高表达ROR1优势抗原相关,下调ROR1分子表达,可影响ID8 OCSC疫苗的免疫效应和抗卵巢癌效应。3.本研究制备的EOC CSC疫苗有效地增强免疫鼠产生抗肿瘤效应,这为临床上应用CSC疫苗免疫防治EOC提供了科学的实验依据。
杨勇[8]（2019）在《miR-557靶向调控EGFR抑制胰腺癌细胞增殖和侵袭的机制研究》文中认为第一部分胰腺癌组织中差异表达miRNA的筛选及验证目的:利用miRNA芯片技术筛选出人胰腺癌组织及癌旁组织之间差异表达的miRNA,并进行数据分析,以期为胰腺癌的分子生物治疗提供理论依据和潜在靶点。方法:（1）收集39例胰腺癌患者标本及其配对的癌旁组织,并记录患者的临床病理特征。（2）选取其中3例胰腺癌组织及其配对癌旁组织行Affymetrix miRNA芯片检测,分析miRNA的差异性表达,筛选出上调和下调有显着差异的miRNA。（3）挑选5种差异表达显着的miRNA,扩大样本量,运用qRT-PCR检测其在胰腺癌组织中的表达情况,包括2个在胰腺癌中表达上调的miRNA基因（miR-422a和miR-628-5p）和3个胰腺癌中表达下调的miRNA基因（miR-557、miR-563和miR-658）。（4）根据miR-557在肿瘤组织中的表达水平,分析miR-557的表达水平与胰腺癌患者性别、年龄、肿瘤大小、淋巴结转移、血管侵犯和临床分期等病理特征的关系。结果:（1）通过检测3组胰腺癌组织样本,Affymetrix miRNA芯片筛选获得558个差异表达的miRNA,其中癌组织中表达上调的有213个,表达下调的有345个。（2）经 qRT-PCR 验证的 5 个 miRNAs（miR-422a、miR-628-5p、miR-557、miR-563和miR-658）,其表达情况与芯片结果符合,挑选其中差异表达倍数最显着的miR-557作为进一步研究对象。（3）miR-557在胰腺癌组织中显着低表达,经统计分析,miR-557表达水平下降与肿瘤的分化程度较低、淋巴结转移、血管侵犯和TNM分期偏晚均有显着相关性（P<0.05）,但与患者的年龄、性别、肿瘤大小、部位无关（P>0.05）。结论:本实验通过miRNA芯片技术筛选获得胰腺癌组织中miRNA的差异表达谱。miR-557在胰腺癌组织中呈显着低表达,并与胰腺癌患者的恶性临床病理特征密切相关。第二部分miR-557对胰腺癌细胞恶性生物学行为的影响目的:观察miR-557过表达对胰腺癌细胞恶性表型的影响并讨论其作用机理。方法:（1）qRT-PCR检测3种胰腺癌细胞株和正常胰腺导管上皮细胞中miR-557的表达水平。（2）构建过表达miR-557的慢病毒表达载体LV-miR-557,侵染胰腺癌PANC-1细胞,获得稳定转染miR-557的PANC-1细胞株。（3）应用CCK8、Annexin V-FITC/7-ADD双染、Transwell实验及划痕实验等方法观察miR-557对胰腺癌细胞体外增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响。（4）免疫荧光检测miR-557对EMT标记物及相关调控蛋白表达变化的影响。（5）构建荷瘤裸鼠模型。裸鼠皮下成瘤实验检测miR-557对胰腺癌细胞体内成瘤能力的影响,裸鼠肺转移模型观察miR-557对胰腺癌远处转移能力的影响。结果:（1）3种胰腺癌细胞中miR-557的表达水平均较正常胰腺导管上皮细胞显着降低（P<0.01）。（2）qRT-PCR分析结果显示,转染慢病毒过表达载体后PANC-1细胞中miR-557的表达水平显着提高,表明慢病毒载体构建成功。（3）CCK8检测细胞增殖活性,结果表明,培养48小时后,miR-557过表达组的PANC-1细胞表现出明显的增殖抑制作用。双染法流式细胞术检测凋亡结果显示,miR-557对胰腺癌细胞的凋亡无明显影响（P>0.05）。Transwell侵袭实验结果显示,与对照组相比,miR-5 5 7过表达组PANC-1细胞的穿膜细胞数明显减少（P<0.01）,表明其能明显减弱胰腺癌细胞的体外侵袭能力。划痕实验结果显示miR-557过表达后PANC-1细胞的迁移距离显着缩短（P<0.01）,划痕修复能力减弱,提示miR-557能明显抑制胰腺癌细胞的迁移活动能力。（4）免疫荧光检测结果显示,miR-557过表达后上皮型标志物E-cadherin的表达明显增强,而间质型标志物N-cadherin的表达明显减弱,调控分子p-Smad2/3的表达明显减弱,表明miR-557可能通过负调控p-Smad2/3的表达逆转胰腺癌的EMT进程。（5）体内实验中,与对照组相比,miR-557过表达组的皮下成瘤时间明显延长,并能显着抑制胰腺癌细胞的体内成瘤能力,此外,miR-557对裸鼠体内胰腺肿瘤的远处转移也具有明显抑制作用。结论:miR-557在胰腺癌细胞系中低表达,并且上调miR-557的表达不仅能够显着抑制胰腺癌细胞的体外增殖、迁移和侵袭能力,还能遏制荷瘤裸鼠体内的肿瘤生长和远处转移。第三部分miR-557调控胰腺癌恶性生物学行为的机制研究目的:预测miR-557的靶基因并进行筛选、验证,揭示miR-557调控胰腺癌增殖和侵袭的潜在分子机制。方法:（1）运用生物信息分析技术预测miR-557的候选靶基因。（2）Western blot法检测miR-557过表达对候选靶基因蛋白水平表达的影响。（3）构建EGFR 3’-UTR野生和突变型重组载体,双荧光素酶基因报告实验验证miR-557与EGFR的靶向关系。（4）构建EGFR过表达质粒载体,通过Rescue实验策略进行增殖、迁移、侵袭等相关功能测验以揭示其调控机制,并分析EMT标志物的表达变化。结果:（1）采用生物信息学方法分析推测EGFR为miR-557的靶基因之一。（2）Western blot结果表明过表达miR-557可以阻遏EGFR蛋白的表达。（3）双荧光素酶基因报告实验结果显示,miR-557 mimics 和野生型重组载体psiCHECK-2-EGFR-UTR共转染时,荧光素酶活性明显受到抑制（P<0.05）,提示miR-557可以通过作用于EGFR的3’-UTR区,负向调控其表达。（4）CCK8实验结果显示,相比于单转染miR-557组,共表达miR-557/EGFR组中PANC-1细胞的增殖活性明显增强（P<0.05）,且与对照组比较已无显着性差异（P>0.05）,提示EGFR能抵消miR-557诱导的增殖抑制作用。Transwell实验的结果显示,转染EGFR质粒后,共转染miR-557/EGFR组与单转染miR-557组比较,穿膜细胞数明显增多,而与对照组相比显着性减少,差异有统计学意义（P<0.05）,提示EGFR仅能部分阻断miR-557抑制侵袭的作用。划痕实验结果显示,相比于对照组,共转染miR-557/EGFR组细胞的迁移距离显着缩短（P<0.05）,而与单转染miR-557组相比迁移距离明显增宽,同样提示EGFR仅部分减弱了 miR-557抑制肿瘤细胞迁移活动的能力。（5）免疫荧光结果显示,与单转染miR-557组相比,共转染miR-557/EGFR组E-cadherin的荧光强度变弱,N-cadherin和p-Smad2/3的荧光强度明显增强;与对照组相比,共转染miR-557/EGFR组E-cadherin的荧光强度增强,N-cadherin的荧光强度减弱,而p-Smad2/3的荧光强度差异不明显（P>0.05）。结论:EGFR是miR-557的靶基因之一,miR-557通过负向调控肿瘤细胞内EGFR的表达从而影响胰腺癌的增殖、迁移和侵袭等恶性生物学表现,此外,miR-557还可能通过其他靶基因介导的分子效应影响胰腺癌的EMT变化。
简行[9]（2019）在《MYH9促进食管癌细胞侵袭迁移的作用机制研究》文中提出食管鳞癌（以下简写为“食管癌”）是我国高发且预后较差的常见恶性肿瘤。肿瘤的侵袭转移是食管癌治疗失败和患者死亡的重要原因之一。因此迫切需要深入研究食管癌细胞侵袭运动和肿瘤转移的分子机制,改进食管癌的分型和治疗。在前期工作中,我们发现蛋白酪氨酸磷酸酶1B（Protein tyrosine phosphatase 1B,PTP1B）在食管癌组织中高表达;利用免疫共沉淀（Co-IP）技术,发现PTP1B可与肌球蛋白重链9（myosin heavy chain 9,MYH9）相互作用,使MYH9尾部结构域（Tail Domain,TD;aa 837～1960）Y1408位点去磷酸化,促进转录因子SP1由细胞浆转入细胞核并上调表皮生长因子（epidermal growth factor receptor,EGFR）的表达,促进食管癌细胞的侵袭和迁移。然而PTP1B与MYH9尾部结构域之间是否存在直接的相互作用及MYH9尾部结构域影响的下游作用分子仍不清楚。本研究首先利用MYH9 siRNA,验证MYH9对食管癌细胞侵袭迁移的作用。Transwell实验和细胞划痕实验结果显示,敲降MYH9显着抑制食管癌KYSE510细胞的侵袭迁移和划痕愈合。我们利用KYSE510细胞cDNA扩增获得MYH9尾部结构域的编码序列（CDS）序列,构建Y1408位点突变型（Y1408F和Y1408D）重组质粒p3×FLAG-MYH9（TD）-Y1408（F/D）,转化人胚肾细胞293FT细胞表达重组蛋白3×FLAG-MYH9（TD）-Y1408（F/D）,通过FLAG标签琼脂糖凝胶亲和纯化获得重组蛋白;利用活性酪氨酸磷酸酶PTP1B与上述重组蛋白,在体外缓冲体系中验证了PTP1B与MYH9存在直接的相互作用。为了深入研究MYH9促进食管癌细胞侵袭迁移的分子机制,我们利用Co-IP及免疫荧光共定位实验验证,发现KYSE510细胞中MYH9与下游转录因子SP1不存在相互作用,提示MYH9 可能通过其它的相互作用分子促进SP1的入核。采用GST pull-down联合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术,筛选了KYSE510细胞中MYH9尾部结构域的相互作用蛋白。质谱鉴定结果显示,KYSE510细胞中存在72个潜在的与MYH9尾部结构域直接或间接相互作用的蛋白。Gene Ontology（GO）基因功能富集分析结果显示,潜在的相互作用蛋白涉及多种生物学过程,包括JAK-STAT信号通路、细胞粘附调控、NIK/NF-κB信号通路、细胞周期检验点、膜脂筏形成、DNA转录起始、mRNA加工等。通过Co-IP分析对其中的候选分子与MYH9尾部结构域的相互作用进行了初步验证,结果显示PC4和SFRS1结合蛋白1（PC4 and SFRS1 interacting protein 1,PSIP1）和染色质重组蛋白 1（BRG1,由SMARCA4基因编码）与MYH9存在相互作用。综上所述,敲降MYH9可抑制食管癌细胞的侵袭和迁移;MYH9尾部结构域介导多种与细胞运动相关蛋白的相互作用,其中MYH9与PSIP1和BRG1的相互作用已经得到验证。以上结果为阐明MYH9在食管癌侵袭迁移中的作用机制提供了新的线索,为深入研究食管癌的治疗策略提供了候选靶点分子。
罗丹[10]（2019）在《miR-362在非小细胞肺癌转移中的作用及分子机制》文中进行了进一步梳理系统生物学是研究生物系统中所有组成成分（基因、mRNA、蛋白质等）的构成,以及在特定条件这些组分间的相互关系的学科。本课题是研究某一基因改变后其上游、下游分子在生物系统内的改变,研究整体的变化情况。肺癌是世界范围内严重影响人们健康的恶性肿瘤之一,最新的统计结果表明,肺癌死亡率已居恶性肿瘤中首位,而肺癌的发病率和死亡率仍呈上升趋势。其中非小细胞肺癌（non-small-celllungcancer,NSCLC）约占肺癌的85%。近年来,随着包括手术切除、化疗、放疗及生物治疗等手段的综合应用,NSCLC患者的生活质量和生存期均有明显的改善,但患者的5年生存率仍然不高,其原因与NSCLC的转移密切相关,约40%的I期和60%的II期NSCLC死亡患者均具有远端转移。因此,研究NSCLC侵袭转移的分子机制,阐明其作用机理,不仅有助于深入了解NSCLC在疾病演进中的分子变化,而且还有助于提高患者的生存期。恶性肿瘤的转移是一个涉及多个水平（如基因、蛋白等）、多个分子的共同作用的结果。随着基因组测序的完成,近年来非编码基因在肿瘤发生发展中的作用受到密切的关注。MicroRNAs（miRNAs）是一类内源性微小RNA分子,其通过转录后水平调控蛋白的表达。研究表明miRNAs在癌症的发生发展中发挥着重要的作用。我们前期研究结果表明,miR-362在NSCLC组织中高表达,然而该分子在NSCLC中的作用尚不明确。本文中的研究是复杂生物系统里的组成部分,是对整体系统理论研究的一个重要补充。本文通过t检验方法分析正常组与miR-362基因敲除组间各参数差异的显着性;结合细胞体外实验中对多组数据的单因素方差分析,探讨了 miR-362在NSCLC转移中的作用及其机制。研究目的探讨miR-362在NSCLC转移中的作用及其机制。研究方法运用CRISPR/Cas9基因编辑技术,建立miR-362基因敲除的A549、95-D肺癌细胞株;利用transwell分析miR-362对细胞侵袭、迁移能力的影响;用克隆形成实验研究miR-362对细胞克隆形成能力的影响;利用流式细胞术检测miR-362对细胞周期、细胞凋亡的影响;通过小鼠体内实验评估miR-362对肿瘤生长的作用;利用生物信息学方法结合分子生物学手段检测miR-362的下游靶基因,并评估该靶基因对NSCLC细胞生物学行为的作用;免疫组织化学法检测NSCLC与癌旁组织中miR-362靶基因的表达水平并与miR-362的表达水平进行相关性分析。结果1、miR-362在NSCLC组织与细胞系中高表达。与癌旁的正常组织相比,miR-362在NSCLC组织中高表达（p=0.0498）,miR-362与患者手术切除后肿瘤的复发时间密切相关（p=0.0454）;miR-362在NSCLC细胞系（A549、95-D、NCI-H1299、NCI-H292和NCI-H460）中高表达;2、miR-362在体外可促进NSCLC的侵袭、迁移、克隆形成,体内促进小鼠肿瘤的形成。成功构建了miR-362基因敲除细胞系A549KO和95-DKO;与野生型细胞相比,A549KO细胞的细胞侵袭、迁移能力分别下降了48.68%（p=0.0003）和51.56%（p=0.0005）;细胞克隆形成能力降低了 47.78%（p=0.0005）;95-DKO细胞的细胞侵袭、迁移能力分别下降了30.45%（p=0.0001）和33.23%（p=0.0002）;细胞克隆形成能力降低了30.56%（p=0.0153）;细胞体内成瘤实验中miR-362敲除后肿瘤增长能力显着降低（p<0.0001）;细胞周期、细胞凋亡率无显着性差异;3、发现并确定了miR-362直接作用靶基因SEMA3A及其功能。生物信息学结合分子生物学分析结果表明SEMA3A是miR-362的直接作用靶基因;含SEMA3A全长编码区的载体转染A549细胞后,细胞侵袭、迁移能力分别下降61.64%（p= 0.0006）和75.90%（p= 0.0002）,细胞克隆形成能力下降了56.77%（p=0.0016）,转染95-D细胞后,细胞侵袭、迁移能力下降61.29%（p=0.0005）和70.29%（p=0.0023）,细胞克隆形成能力下降了63.39%（p<0.0001）;4、免疫组化结果显示SEMA3A在癌旁组织中高表达,与miR-362表达呈负相关。结论利用CRISPR/Cas9系统成功构建了 miR-362基因敲除的A549和95-D细胞系;miR-362在NSCLC中高表达,具有促进NSCLC转移、克隆形成以及体内成瘤的作用;miR-362靶向SEMA3A,通过负调控SEMA3A的表达促进肿瘤转移;miR-362/SEMA3A阐明了NSCLC侵袭和迁移的分子机制,为NSCLC治疗提供了新的潜在治疗靶点。本文取得的创新性成果主要有:1.本研究采用了CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑技术,通过同源重组途径,并结合Cre/LoxP系统首次构建了miR-362敲除的A549KO和95-DKO细胞株,为进一步建立A549/95-D的其他基因敲除细胞系提供了参考;2.证明miR-362在体外可促进NSCLC的侵袭、迁移、克隆形成,体内敲除miR-362可促进化疗药物抑制肿瘤增殖的敏感性,为进一步研究miR-362在NSCLC中的作用机制和功能奠定了基础;3.发现并确定了miR-362直接作用靶基因SEMA3A;4.miR-362/SEMA3A解释了 NSCLC侵袭和迁移的的分子机制之一,为NSCLC治疗提供了新的潜在治疗靶点。综上所述,依托多种数理统计方法,本研究发现miR-362在NSCLC组织中高表达,该分子通过下调SEMA3A的表达,促进NSCLC的转移。本研究为阐明NSCLC转移提供了新的机制,为NSCLC治疗提供了新的潜在治疗靶点。
二、人NKG2D真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的瞬时表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人NKG2D真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的瞬时表达（论文提纲范文）
（1）罗非鱼NCC亚群的构成解析及其活性调控因子半乳糖凝集素（Galectins）的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 鱼类的免疫系统 |
| 1.1.1 免疫器官 |
| 1.1.2 免疫细胞 |
| 1.1.3 免疫分子 |
| 1.2 NCC的研究现状 |
| 1.3 Galectin家族研究进展 |
| 1.3.1 Galectin家族的分类 |
| 1.3.2 Galectin家族基因的结构 |
| 1.3.3 Galectin基因的免疫调节功能 |
| 1.3.3.1 Galectin与 T细胞 |
| 1.3.3.2 Galectin与炎症反应 |
| 1.3.3.3 Galectin与 NK细胞 |
| 1.3.4 硬骨鱼Galectin的研究概述 |
| 1.4 单细胞转录组测序研究进展 |
| 1.4.1 scRNA-Seq的实验原理 |
| 1.4.2 scRNA-Seq的局限 |
| 1.4.3 scRNA-Seq的应用 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 2 罗非鱼淋巴细胞的单细胞转录组分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验用鱼 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 罗非鱼及细胞处理 |
| 2.2.2 单细胞RNA测序 |
| 2.2.3 RNA-seq数据处理 |
| 2.2.4 质量控制和数据量化 |
| 2.2.5 细胞聚类 |
| 2.2.6 差异表达基因(DEG)分析 |
| 2.2.7 NCC亚群的WGCNA分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 测序数据质控和表达定量 |
| 2.3.2 单细胞亚群分类 |
| 2.3.3 基于标记分子细胞类群的鉴定 |
| 2.3.4 NCC的 DEGs分析 |
| 2.3.5 WGCNA分析结果 |
| 2.3.6 细胞亚聚类和NCC亚群鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 头肾白细胞中鉴定出四种免疫细胞群 |
| 2.4.2 WGCNA分析揭示NCC的基因调控网络 |
| 2.4.3 四个NCC亚群的确定 |
| 3 与NCCRP-1 互作的Gals蛋白鉴定 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验用鱼 |
| 3.1.2 实验用细胞 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.1.4 实验仪器 |
| 3.1.5 实验引物 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 罗非鱼Galectin基因的克隆与分析 |
| 3.2.1.1 Gals基因的ORF克隆 |
| 3.2.1.2 Gals的序列分析 |
| 3.2.2 酵母双杂交验证与NCCRP-1 的互作蛋白 |
| 3.2.2.1 载体构建 |
| 3.2.2.2 准备酵母感受态细胞(LiAc Method) |
| 3.2.2.3 pGBKT7和pGADT7 共转化酵母菌株AH109 |
| 3.2.2.4 x-gal检测实验 |
| 3.2.3 GST Pull-down验证与NCC互作蛋白 |
| 3.2.3.1 原核表达载体的构建及诱饵蛋白准备 |
| 3.2.3.2 诱饵蛋白固定化 |
| 3.2.3.3 目的蛋白(NCC裂解液蛋白)的准备 |
| 3.2.3.4 目的蛋白质捕获 |
| 3.2.3.5 诱饵-目的蛋白洗脱 |
| 3.2.3.6 目的蛋白的收集 |
| 3.2.3.7 MS质谱鉴定及分析 |
| 3.2.4 亚细胞定位分析显示MMP与 OnGal-2/OnGal-8 在细胞内定位 |
| 3.2.4.1 MMP的克隆及真核表达载体的构建 |
| 3.2.4.2 OnGal-2/OnGal-8 绿色荧光真核表达载体构建 |
| 3.2.4.3 细胞复苏及传代。 |
| 3.2.4.4 细胞共转染 |
| 3.2.4.5 细胞爬片、固定及DAPI染色 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 NCC中 Gals的表达情况 |
| 3.3.2 OnGals基因克隆与分析 |
| 3.3.2.1 OnGals的基因克隆 |
| 3.3.2.2 OnGals基因结构分析 |
| 3.3.2.3 OnGals多序列比对 |
| 3.3.2.4 OnGals进化树分析 |
| 3.3.3 OnGals与 NCCRP-1 互作结果 |
| 3.3.4 OnGals与 NCC蛋白互作结果 |
| 3.3.4.1 OnGals蛋白表达 |
| 3.3.4.2 Pull-down及质谱分析结果 |
| 3.3.5 亚细胞共定位结果 |
| 3.4 讨论 |
| 4 依赖于NCCRP-1 受体的OnGal-2 的免疫调节功能及对NCC活性调控的研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验用鱼 |
| 4.1.2 实验用细菌 |
| 4.1.3 实验用细胞 |
| 4.1.4 实验试剂 |
| 4.1.5 实验仪器 |
| 4.1.6 实验引物 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 OnGal-2 的表达模式分析 |
| 4.2.1.1 实验用鱼的处理及样品收集 |
| 4.2.1.2 qRT-PCR检测基因表达 |
| 4.2.2 OnGal-2 体外过表达研究 |
| 4.2.2.1 过表达载体的构建 |
| 4.2.2.2 细胞转染 |
| 4.2.2.3 双荧光素酶报告系统分析 |
| 4.2.3 OnGal-2 体外蛋白功能研究 |
| 4.2.3.1 His标签原核表达载体构建 |
| 4.2.3.2 细菌凝集试验 |
| 4.2.3.3 细菌结合实验 |
| 4.2.3.4 多糖结合实验 |
| 4.2.3.5 单核/巨噬细胞吞噬实验 |
| 4.2.3.6 OnGal-2对NCC效应基因表达研究 |
| 4.2.3.7 OnGal-2对NCC杀伤活性研究 |
| 4.2.4 OnGal-2 体内蛋白功能研究 |
| 4.2.4.1 罗非鱼注射及样品采集 |
| 4.2.4.2 NCC效应基因表达情况 |
| 4.2.4.3 血清酶活测定 |
| 4.2.4.4 组织载菌量测定 |
| 4.2.4.5 组织切片 |
| 4.2.4.6 罗非鱼存活率 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 OnGal-2 的表达模式 |
| 4.3.1.1 OnGal-2 的组织分布 |
| 4.3.1.2 OnGal-2 的时序表达结果 |
| 4.3.2 双荧光素表达结果 |
| 4.3.3 OnGal-2 蛋白体外功能研究 |
| 4.3.3.1 rOnGal-2 蛋白表达 |
| 4.3.3.2 rOnGal-2 对细菌的凝集作用 |
| 4.3.3.3 rOnGal-2 对细菌的结合作用 |
| 4.3.3.4 rOnGal-2 与多糖对细菌的竞争结合作用 |
| 4.3.3.5 rOnGal-2 对单核/巨噬细胞的吞噬促进作用 |
| 4.3.3.6 rOnGal-2对NCC效应基因表达分析 |
| 4.3.3.7 rOnGal-2对NCC杀伤活性分析 |
| 4.3.4 OnGal-2 蛋白体内功能研究 |
| 4.3.4.1 rOnGal-2 对罗非鱼血清酶活的作用 |
| 4.3.4.2 rOnGal-2 对罗非鱼组织载菌量的作用 |
| 4.3.4.3 rOnGal-2 对罗非鱼组织损伤的作用 |
| 4.3.4.4 rOnGal-2对NCC效应基因表达的作用 |
| 4.3.4.5 rOnGal-2 对罗非鱼存活率的作用 |
| 4.4 讨论 |
| 5 不依赖于NCCRP-1 受体的OnGal-8 的免疫调节功能及对NCC活性调控的研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验用鱼 |
| 5.1.2 实验用细菌 |
| 5.1.3 实验用细胞 |
| 5.1.4 实验试剂 |
| 5.1.5 实验仪器 |
| 5.1.6 实验引物 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 OnGal-8 的表达模式 |
| 5.2.1.1 实验用鱼处理及组织取样 |
| 5.2.1.2 罗非鱼单核/巨噬细胞的处理及样品收集 |
| 5.2.1.3 qRT-PCR检测基因表达模式 |
| 5.2.2 OnGal-8 体外蛋白功能研究 |
| 5.2.2.1 rOnGal-8 的血凝作用研究 |
| 5.2.2.2 rOnGal-8 对细菌凝集作用研究 |
| 5.2.2.3 rOnGal-8 对细菌结合作用研究 |
| 5.2.2.4 rOnGal-8 对多糖的结合研究 |
| 5.2.2.5 rOnGal-8 对细菌生长抑制作用研究 |
| 5.2.2.6 rOnGal-8 对单核/巨噬细胞炎症因子作用研究 |
| 5.2.2.7 rOnGal-8 对单核/巨噬细胞吞噬作用研究 |
| 5.2.2.8 rOnGal-8 对单核/巨噬细胞呼吸爆发作用研究 |
| 5.2.2.9 rOnGal-8对NCC杀伤活性研究 |
| 5.2.3 OnGal-8 体外过表达研究 |
| 5.2.4 OnGal-8 体内过表达研究 |
| 5.2.4.1 罗非鱼注射及检测 |
| 5.2.4.2 血清酶活检测 |
| 5.2.4.3 组织载菌量检测 |
| 5.2.4.4 组织切片检测 |
| 5.2.4.5 NCC效应基因表达检测 |
| 5.2.4.6 罗非鱼存活率检测 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 OnGal-8 的表达模式分析 |
| 5.3.1.1 OnGal-8 的组织表达分析 |
| 5.3.1.2 OnGal-8 的时序表达分析 |
| 5.3.2 OnGal-8 体外蛋白功能分析 |
| 5.3.2.1 rOnGal-8 对血细胞及细菌的凝集作用 |
| 5.3.2.2 rOnGal-8 对细菌的结合作用 |
| 5.3.2.3 rOnGal-8 对多糖的竞争结合作用 |
| 5.3.2.4 rOnGal-8 对细菌生长的抑制作用 |
| 5.3.2.5 rOnGal-8 对单核/巨噬细胞炎症因子表达的作用 |
| 5.3.2.6 rOnGal-8 对单核/巨噬细胞的促吞噬作用 |
| 5.3.2.7 rOnGal-8 对单核/巨噬细胞呼吸爆发作用 |
| 5.3.2.8 rOnGal-8对NCC杀伤活性分析 |
| 5.3.3 OnGal-8 体外过表达分析 |
| 5.3.4 OnGal-8 体内过表达分析 |
| 5.3.4.1 OnGal-8 对罗非鱼血清酶活的作用 |
| 5.3.4.2 OnGal-8 对罗非鱼组织载菌量的作用 |
| 5.3.4.3 OnGal-8 对罗非鱼组织损伤的作用 |
| 5.3.4.4 OnGal-8对NCC效应基因表达的作用 |
| 5.3.4.5 OnGal-8 对罗非鱼存活率的作用 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 OnGal-8 的基因表达分析 |
| 5.4.2 OnGal-8 体外蛋白功能分析 |
| 5.4.3 OnGal-8 体外过表达分析 |
| 5.4.4 OnGal-8 体内过表达分析 |
| 6 结论与展望 |
| 6.1 全文总结 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（2）miR-218-5p靶向ZMIZ2抑制非小细胞肺癌细胞的增殖和迁移（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 第二章 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 临床组织样本 |
| 2.1.3 慢病毒表达载体与双荧光报告载体 |
| 2.1.4 实验使用的试剂和仪器 |
| 2.1.5 常用试剂的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 RNA提取、反转录及Real-time PCR |
| 2.2.3 细胞总蛋白质的提取 |
| 2.2.4 Western blot |
| 2.2.5 过表达稳转细胞系的筛选 |
| 2.2.6 细胞转染 |
| 2.2.7 细胞增殖检测 |
| 2.2.8 流式细胞的检测 |
| 2.2.9 重组质粒的构建 |
| 2.2.10 miR-218-5p和重组质粒的瞬时共转染以及荧光素报告实验 |
| 2.2.11 细胞迁移与侵袭(Transwell)实验 |
| 2.2.12 统计分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 miR-218-5p和ZMIZ2 mRNA在NSCLC临床组织中的表达水平 |
| 3.1.1 NSCLC临床组织中ZMIZ2基因上调表达 |
| 3.1.2 NSCLC临床组织中miR-218-5p下调表达 |
| 3.2 miR-218-5p结合并靶向调控ZMIZ2基因的表达 |
| 3.2.1 生物信息学软件预测miR-218-5p可靶向结合ZMIZ2转录本3'UTR特定区域 |
| 3.2.2 miR-218-5p靶向结合并负向调节ZMIZ2基因3'UTR活性 |
| 3.2.3 miR-218-5p负向调控内源性ZMIZ2基因的表达 |
| 3.3 miR-218-5p过表达对NSCLC细胞增殖、周期及侵袭能力的影响 |
| 3.3.1 在NSCLC中瞬时过表达miR-218-5p |
| 3.3.2 miR-218-5p过表达显着抑制NSCLC细胞增殖能力 |
| 3.3.3 过表达miR-218-5p后细胞S期比例减少,G1期比例增加 |
| 3.3.4 miR-218-5p过表达显着抑制NSCLC细胞迁移与侵袭能力 |
| 3.4 过表达ZMIZ2对NSCLC细胞增殖、周期、侵袭能力的影响 |
| 3.4.1 ZMIZ2过表达稳转细胞株的建立及筛选 |
| 3.4.2 ZMIZ2过表达显着增强NSCLC细胞增殖能力 |
| 3.4.3 过表达ZMIZ2后细胞S期比例增加,G1期比例减少 |
| 3.4.4 ZMIZ2过表达显着促进NSCLC细胞的迁移与侵袭能力 |
| 3.5 敲弱ZMIZ2对NSCLC细胞增殖、周期及侵袭能力的影响 |
| 3.5.1 在NSCLC细胞中瞬时转染靶向ZMIZ2的siRNAs |
| 3.5.2 敲弱ZMIZ2显着抑制NSCLC细胞的增殖能力 |
| 3.5.3 敲弱ZMIZ2基因后细胞S期比例减少,G1期比例增加 |
| 3.5.4 敲弱ZMIZ2显着抑制NSCLC细胞迁移与侵袭能力 |
| 3.6 过表达ZMIZ2部分削弱了miR-218-5p对NSCLC细胞功能的影响 |
| 3.6.1 过表达ZMIZ2部分削弱了miR-218-5p对NSCLC细胞增殖能力的影响 |
| 3.6.2 过表达ZMIZ2部分削弱了miR-218-5p对NSCLC细胞周期的影响 |
| 3.6.3 过表达ZMIZ2部分削弱了miR-218-5p对NSCLC细胞迁移和侵袭能力的影响 |
| 3.7 过表达miR-218-5p抑制C/EBPβ和IL-6的表达 |
| 3.8 总结 |
| 第四章 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 miR-218-5p在肺癌发生发展过程中的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 附录: 缩略词表及注释 |
| 致谢 |
（3）乳腺癌脑转移细胞系靶向肽BRBP1结合靶分子的筛选与鉴定（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 主要英文缩写词表 |
| 前言(一) |
| 第一章 乳腺癌脑转移细胞系靶向肽BRBP1结合候选靶分子的鉴定 |
| 第一节 候选靶分子MSN、EFNB1的鉴定 |
| 1 材料及试剂 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第二节 候选靶分子SND1的鉴定 |
| 1 材料及试剂 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第二章 乳腺癌脑转移细胞系靶向肽BRBP1结合靶分子的筛选 |
| 第一节 BRBP1肽的改造与结合特性鉴定 |
| 1 材料及试剂 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第二节 生物素修饰多肽BRBP1-biotin筛选BRBP1肽结合靶分子的探索 |
| 1 材料及试剂 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第三节 BRBP1-Fc1肽体筛选BRBP1肽结合靶分子的探索 |
| 1 材料及试剂 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第四节 转录组测序筛选BRBP1肽结合靶分子的探索 |
| 1 材料及试剂 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 前言(二) |
| 第三章 白血病耐药细胞株靶向肽体的构建与鉴定 |
| 第一节 5R5肽临床意义的初步鉴定 |
| 1 材料与试剂 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第二节 5R5-Fc1二价肽体真核表达质粒载体构建、表达与鉴定 |
| 1 材料及试剂 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第三节 (5R5)_2-Fc4四价肽体原核表达质粒载体构建、表达与鉴定 |
| 1 材料及试剂 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 小结与展望 |
| 文献综述(一) 肽体的研究进展 |
| 1 肽体的设计与构建 |
| 2 肽体的优化 |
| 3 展望 |
| 文献综述(二) 细胞膜结合蛋白鉴定研究进展 |
| 1 蛋白质与蛋白质之间相互作用鉴定的意义 |
| 2 蛋白质相互作用鉴定的策略 |
| 3 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（4）增强型NKG2D-CAR T细胞抗前列腺癌作用及其机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 研究背景及文献综述 |
| 1.CAR T细胞免疫疗法及其研究进展 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 嵌合抗原受体(CAR)的结构和原理 |
| 1.3 CAR T细胞治疗的研究进展 |
| 1.4 CAR T细胞治疗的安全性问题 |
| 2.前列腺癌及其治疗现状 |
| 3.NKG2D及其配体在CAR T细胞免疫治疗中的应用 |
| 3.1 NKG2D及 NKG2D配体 |
| 3.2 NKG2D及 NKG2DLs在 CAR T细胞疗法中的应用 |
| 4.细胞因子IL-7 及其在CAR T细胞治疗中的应用 |
| 4.1 细胞因子IL-7 及其生物学活性 |
| 4.2 细胞因子与CAR T细胞治疗的联合应用 |
| 5.黏附性G蛋白偶联受体GPR116 及其研究现状 |
| 5.1 黏附性G蛋白偶联受体 |
| 5.2 GPR116 受体简介 |
| 6.本文主要研究内容及意义 |
| 第二章 NKG2D-CAR T细胞靶向治疗前列腺癌及共表达IL-7 增强其抗肿瘤效果的研究 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 慢病毒表达载体构建 |
| 3.2 慢病毒V-NKG2D-CAR、V-NKG2DIL7-CAR的制备 |
| 3.3 两种CAR T细胞的制备 |
| 3.4 前列腺癌细胞中高表达NKG2D的配体 |
| 3.5 NKG2DIL7-CAR T 细胞分泌更高的 IL-7 |
| 3.6 NKG2D-CAR T细胞有效识别并杀伤前列腺癌细胞且共表达IL-7 后效果增强 |
| 3.7 共表达IL-7 增强NKG2D-CAR T细胞的活化 |
| 3.8 共表达IL-7 增强NKG2D-CAR T细胞的增殖 |
| 3.9 共表达IL-7 增强NKG2D-CAR T细胞的存活 |
| 3.10 共表达IL-7 降低NKG2D-CAR T细胞的耗竭 |
| 3.11 共表达IL-7 有利于Tscm样细胞的分化 |
| 3.12 两种CAR T细胞治疗前列腺癌动物水平实验 |
| 4.讨论 |
| 第三章 下调GPR116 的表达增强NKG2D-CAR T细胞抗前列腺癌的研究 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 Gpr116 敲除小鼠的脾脏变大且CD8+T 细胞分泌更多的IFN-γ |
| 3.2 慢病毒V-mNKG2D-CAR的制备 |
| 3.3 Gpr116 敲除后增强mNKG2D-CAR T细胞的杀伤 |
| 3.4 Gpr116 敲除后增强mNKG2D-CAR T细胞的活化 |
| 3.5 Gpr116 敲除后增强mNKG2D-CAR T细胞杀伤因子的分泌 |
| 3.6 Gpr116 敲除后增强mNKG2D-CAR T细胞的增殖 |
| 3.7 Gpr116 敲除后增强mNKG2D-CAR T细胞的体内抗肿瘤效果 |
| 3.8 GPR116-shRNA干扰载体构建及筛选 |
| 3.9 GPR116 敲低后增强NKG2D-CAR T细胞的杀伤 |
| 3.10 GPR116 敲低后增强NKG2D-CAR T细胞的活化及杀伤因子分泌 |
| 3.11 GPR116 敲低后增强NKG2D-CAR T细胞的增殖和存活 |
| 3.12 GPR116 敲低后降低NKG2D-CAR T细胞的耗竭 |
| 3.13 GPR116 敲低后增强NKG2D-CAR T细胞的体内抗肿瘤效果 |
| 3.14 GPR116 受体抑制NKG2D-CAR T细胞中PI3K-Akt-NF-κB通路的激活 |
| 4.讨论 |
| 全文总结 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附录一 PCR引物 |
| 附录二 博士期间发表文章及获得奖励 |
| 致谢 |
（5）胃癌癌变过程分子特征的研究 基于免疫组预测鼻咽癌远处转移的研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 胃癌癌变过程分子特征的研究 |
| 前言 |
| 第一章 利用肠型胃癌癌前病变组织及早期胃癌组织基因表达谱深度剖析肠型胃癌癌变过程中重要分子特征的研究 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 肠型胃癌癌前病变组织和早期胃癌组织样本 |
| 1.2 公共数据库中胃癌表达数据收集整理 |
| 1.3 细胞系 |
| 1.4 引物序列 |
| 1.5 质粒 |
| 1.6 实验试剂 |
| 1.7 实验器材及耗材 |
| 1.8 主要生物信息学分析软件及网站 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 肠型胃癌癌前病变组织、早期胃癌组织及配对对照组织样本的收集 |
| 2.2 组织样本总RNA提取 |
| 2.3 组织样本总RNA的纯化 |
| 2.4 组织样本RNA浓度的测定 |
| 2.5 组织样本RNA完整性的鉴定 |
| 2.6 基因表达谱芯片检测组织样本mRNA表达谱 |
| 2.7 芯片原始表达数据的提取及标准化 |
| 2.8 差异表达基因的识别和功能性通路富集 |
| 2.9 肿瘤Hallmark的活性评估 |
| 2.10 干细胞特性得分的计算 |
| 2.11 肠型胃癌癌变过程中驱动基因的表达 |
| 2.12 组织中免疫细胞浸润评估 |
| 2.13 构建胃癌患者生存相关的5-基因风险评分系统 |
| 2.14 肠型胃癌癌变过程中基因间共表达关系差异性分析 |
| 2.15 GSTM2相关模块挖掘以及其与胃癌患者预后之间关系的评估 |
| 2.16 实时定量PCR对基因表达进行相对定量 |
| 2.17 分子克隆构建GSTM2真核表达质粒 |
| 2.18 细胞培养 |
| 2.19 细胞转染 |
| 2.20 5-氟尿嘧啶(5-FU)对胃癌细胞系抑制实验 |
| 2.21 胃癌细胞系转录组测序及分析 |
| 3. 统计学分析 |
| 结果 |
| 1. 入组样本临床信息 |
| 2. 肠型胃癌癌变过程中差异表达基因的识别 |
| 3. 肠型胃癌癌变过程中生物学功能的变化 |
| 4. 肠型胃癌癌变过程中肿瘤恶性表型逐步呈现 |
| 5. 肠型胃癌癌变过程中胃上皮细胞的干细胞特性增强 |
| 6. 肠型胃癌癌变过程中重要驱动基因的识别 |
| 7. 早期胃癌组织中免疫微环境活跃程度高于癌前病变组织 |
| 8. 各个病变阶段一致性变化的基因在肠型胃癌癌变过程中具有重要作用 |
| 9. 各个病变阶段一致性变化的基因与胃癌患者预后显着相关 |
| 10. 5-gene signature预后能力评估 |
| 11. 肠型胃癌癌变过程中基因间差异共表达关系分析 |
| 12. GSTM2相关模块与胃癌患者预后显着相关 |
| 13. 独立样本验证GSTM2在胃癌组织中的表达 |
| 14. GSTM2抑制5-FU对胃癌细胞的杀伤 |
| 15. GSTM2降低5-FU诱导的胃癌细胞凋亡活性 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 不足之处 |
| 第二章 时间进展性肠型胃癌癌前病变组织及癌组织多组学测序的研究 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 时间进展性肠型胃癌患者胃活检组织样本和外周血样本 |
| 1.2 实验试剂及耗材 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 主要生物信息学分析软件及网站 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 时间进展性肠型胃癌患者胃活检组织样本和外周血样本的收集 |
| 2.2 直接冻存组织和外周血白细胞DNA的提取 |
| 2.3 直接冻存组织和外周血白细胞RNA的提取及定量 |
| 2.4 DNA及RNA样本质量检测 |
| 2.5 二代测序文库构建 |
| 2.6 测序数据处理 |
| 3. 统计分析 |
| 结果 |
| 1. 入组样本及测序数据 |
| 2. 正常胃粘膜中存在功能性基因突变 |
| 3. 胃癌癌前病变组织基因组存在微卫星不稳定现象 |
| 4. 肠型胃癌癌变过程中染色体变异负荷 |
| 5. 肠型胃癌癌变过程中克隆进化 |
| 6. 肠型胃癌癌变过程中组织基因表达变化特征 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 不足之处 |
| 第二部分 基于免疫组预测鼻咽癌远处转移的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 鼻咽癌患者治疗前和治疗后血液样本 |
| 1.2 实验试剂及耗材 |
| 1.3 实验器材 |
| 1.4 主要生物信息学分析软件和网站 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 鼻咽癌患者外周血中白细胞的分离 |
| 2.2 鼻咽癌患者外周血白细胞总RNA的提取 |
| 2.3 鼻咽癌患者外周血白细胞总RNA浓度的测定和完整性的检测 |
| 2.4 T淋巴细胞受体序列文库的构建和测序 |
| 2.5 TCR repertoire的二代测序及二代测序数据的分析 |
| 2.6 RNA测序数据分析 |
| 3. 统计分析 |
| 结果 |
| 1. 入组鼻咽癌患者的临床特征 |
| 2. 鼻咽癌患者治疗前和治疗后血细胞的动态变化 |
| 3. 鼻咽癌患者外周血TCR repertoire的特征 |
| 4. 治疗对非远处转移性鼻咽癌患者和治疗后发生远处转移的鼻咽癌患者的TCR克隆比例产生不同的影响 |
| 5. TCR repertoire多样性的降低与鼻咽癌患者较差的无远处转移生存显着相关 |
| 6. 治疗前后外周血TCR repertoire相似性与鼻咽癌患者无远处转移显着相关 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 不足之处 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 基金资助 |
| 已发表与学位论文相关的英文论文及成果 |
| 文献综述 胃癌变与免疫应答 |
| 致谢 |
（6）IDH1突变体引起的糖脂代谢改变及其在肿瘤发生中的可能作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 IDH1突变体研究进展 |
| 1.1.1 IDH简介 |
| 1.1.2 IDH1突变体产生2-HG |
| 1.1.3 2-HG被认为是一种“癌性代谢物” |
| 1.1.4 IDH1突变体致癌机理的研究 |
| 1.1.5 IDH1突变体对细胞代谢通路的影响 |
| 1.1.6 含有IDH1突变体的肿瘤的治疗策略 |
| 1.2 肝脏代谢调控研究进展 |
| 1.2.1 肝癌中发现IDH1的突变 |
| 1.2.2 肝脏协同其他器官调控机体能量代谢 |
| 1.2.3 肝脏的糖代谢 |
| 1.2.4 肝脏的脂肪酸代谢 |
| 1.3 肿瘤代谢重塑机制研究进展 |
| 1.3.1 肿瘤细胞可以应对无限增殖的需求 |
| 1.3.2 肿瘤细胞可以优化氧化还原状态 |
| 1.3.3 肿瘤细胞可以应对极端的生存环境 |
| 1.3.4 肿瘤细胞协调与基质细胞的合作 |
| 1.3.5 利用肿瘤代谢的重塑治疗肿瘤 |
| 1.4 立题背景 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 常用药品和试剂 |
| 2.2 DNA相关实验方法 |
| 2.2.1 质粒载体 |
| 2.2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.2.3 PCR反应 |
| 2.2.4 DNA片段的纯化 |
| 2.2.5 DNA连接反应 |
| 2.2.6 DNA转化 |
| 2.2.7 质粒DNA的提取 |
| 2.3 细胞实验 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 瞬时转染 |
| 2.3.3 慢病毒包装与感染 |
| 2.4 蛋白质相关实验 |
| 2.4.1 蛋白质的SDS-PAGE电泳与Western blot分析 |
| 2.4.2 融合蛋白的表达与纯化 |
| 2.5 动物相关实验 |
| 2.5.1 小鼠基因型的鉴定 |
| 2.5.2 小鼠代谢笼分析 |
| 2.5.3 葡萄糖耐量、胰岛素耐量和丙酮酸耐量 |
| 2.5.4 体内葡萄糖摄入量检测 |
| 2.6 组织学分析 |
| 2.6.1 小鼠组织切片 |
| 2.6.2 苏木精-伊红染色 |
| 2.6.3 油红O染色 |
| 2.6.4 PAS染色 |
| 2.6.5 免疫组化 |
| 2.7 实时定量荧光PCR |
| 2.7.1 RNA样品的抽提 |
| 2.7.2 RNA的纯度检测及浓度测定 |
| 2.7.3 mRNA逆转录 |
| 2.7.4 Real-time PCR样品制备与上机 |
| 2.8 酶活分析 |
| 2.8.1 α-酮戊二酸脱氢酶酶活 |
| 2.8.2 糖酵解关键酶酶活 |
| 2.9 NMR样品制备 |
| 2.9.1 小鼠血浆样品制备 |
| 2.9.2 小鼠肝脏样品制备 |
| 2.10 气相色谱质谱联用样品制备 |
| 2.10.1 细胞样品制备 |
| 2.10.2 尿液样品制备 |
| 2.11 细胞能量代谢仪 |
| 2.11.1 测定细胞氧气消耗速率(OCR) |
| 2.11.2 测定细胞外酸化速率(ECAR) |
| 2.12 葡萄糖摄入量检测 |
| 2.13 细胞内ATP含量测定 |
| 2.14 NADPH/NADP~+检测 |
| 2.15 甘油三脂的测定 |
| 2.16 脂肪酸从头合成的测定 |
| 2.17 脂肪酸氧化的测定 |
| 2.18 DARTS实验 |
| 2.19 利用流式细胞仪测定细胞的存活率 |
| 2.20 利用流式细胞仪测定细胞的ROS |
| 2.21 数据的统计学处理 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 结果 |
| 3.1.1 成功构建在肝脏特异性表达IDH1 R132Q突变体的基因敲入小鼠,即Alb-KI小鼠 |
| 3.1.2 Alb-KI小鼠与Alb-WT小鼠在组织方面存在差异 |
| 3.1.3 Alb-KI小鼠肝脏自发形成肿瘤,并且生存期缩短 |
| 3.1.4 Alb-KI小鼠表现出高耗能的代谢模式 |
| 3.1.5 Alb-KI小鼠糖异生减弱,TCA被抑制 |
| 3.1.6 Alb-KI小鼠肝脏的糖酵解代谢通路被激活 |
| 3.1.7 Alb-KI小鼠肝脏脂肪酸从头合成通路被抑制,脂肪酸分解代谢通路被激活 |
| 3.1.8 表达IDH1突变体的肿瘤细胞的代谢模式与Alb-KI小鼠相似 |
| 3.1.9 表达IDH1突变体的肿瘤细胞对脂肪酸分解代谢的抑制剂更敏感性 |
| 3.1.10 表达IDH1突变体的肿瘤细胞对脂肪酸分解代谢抑制剂更敏感的原因 |
| 3.2 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 图表索引 |
（7）卵巢癌干细胞疫苗抗卵巢癌疗效及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号、变量、缩略词等本论文专用术语注释表 |
| 绪论 |
| 一、研究背景 |
| 二、研究的创新点和意义 |
| 三、参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 第一章 人源性卵巢癌干细胞疫苗的抗肿瘤效应及机制 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第二章 人源性卵巢癌干细胞疫苗机制探究 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第三章 鼠源性卵巢癌干样细胞疫苗机制探究 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（8）miR-557靶向调控EGFR抑制胰腺癌细胞增殖和侵袭的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 胰腺癌组织中差异表达miRNA的筛选及验证 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 miR-557对胰腺癌细胞恶性生物学行为的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 miR-557调控胰腺癌恶性生物学行为的机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 不足与展望 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 全文缩略词 |
| 攻读学位期间公开发表的论文 |
| 致谢 |
（9）MYH9促进食管癌细胞侵袭迁移的作用机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 结果 |
| 一、敲降MYH9抑制食管癌细胞的侵袭和迁移 |
| 二、PTP1B与MYH9尾部结构域直接相互作用体外验证 |
| 三、MYH9影响食管癌细胞的侵袭和迁移的作用机制分析 |
| 讨论 |
| 一、MYH9是肿瘤治疗的潜在靶点 |
| 二、PTP1B作用于MYH9尾部结构域的酪氨酸去磷酸位点 |
| 三、MYH9尾部结构域相互作用蛋白 |
| 结论 |
| 附录 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 课题资助 |
（10）miR-362在非小细胞肺癌转移中的作用及分子机制（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 序言 |
| 1 引言 |
| 1.1 系统理论与系统生物学 |
| 1.2 肺癌研究进展 |
| 1.3 miRNA概述 |
| 1.4 miRNA在癌症中的作用 |
| 1.5 CRISPR/Cas9基因编辑技术 |
| 1.5.1 CRISPR/Cas9系统简介 |
| 1.5.2 CRISPR/Cas9系统工作原理 |
| 1.5.3 CRISPR/Cas9系统研究历程 |
| 1.5.4 CRISPR/Cas9技术优缺点 |
| 1.5.5 CRISPR/Cas9系统的应用与展望 |
| 1.6 论文研究方案 |
| 1.7 论文创新点 |
| 2 miR-362在NSCLC组织与细胞中的表达 |
| 2.1 实验材料和实验试剂 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 miR-362在NSCLC组织和细胞中上调表达 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 miR-362在NSCLC中的功能研究 |
| 3.1 实验材料和实验试剂 |
| 3.1.1 细胞株 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 CRISPR/Cas9技术构建miR-362敲除细胞系 |
| 3.3.2 miR-362促进NSCLC细胞转移 |
| 3.3.3 miR-362促进NSCLC细胞的克隆形成能力 |
| 3.3.4 miR-362对NSCLC细胞周期无影响 |
| 3.3.5 miR-362对NSCLC细胞凋亡率的影响 |
| 3.3.6 miR-362对NSCLC细胞抑制率的影响 |
| 3.3.7 miR-362提高肺癌细胞系在小鼠体内的成瘤能力 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 miR-362靶基因的鉴定 |
| 4.1 实验材料和实验试剂 |
| 4.1.1 细胞株 |
| 4.1.2 细菌菌株 |
| 4.1.3 质粒载体 |
| 4.1.4 主要试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 miR-362靶基因的预测 |
| 4.3.2 miR-362靶基因的鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 SEMA3A在NSCLC中的功能及与miR-362的相关性 |
| 5.1 实验材料和实验试剂 |
| 5.1.1 细胞株 |
| 5.1.2 质粒载体 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 SEMA3A抑制NSCLC细胞的转移 |
| 5.3.2 SEMA3A抑制NSCLC细胞的克隆形成 |
| 5.3.3 miR-362与靶基因SEMA3A相关性分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 6 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录A |
| 附录B |
| 附录C |
| 作者简历及攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 学位论文数据集 |
四、人NKG2D真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的瞬时表达（论文参考文献）
- [1]罗非鱼NCC亚群的构成解析及其活性调控因子半乳糖凝集素（Galectins）的功能研究[D]. 牛金中. 广东海洋大学, 2021(02)
- [2]miR-218-5p靶向ZMIZ2抑制非小细胞肺癌细胞的增殖和迁移[D]. 张伟伟. 苏州大学, 2020(02)
- [3]乳腺癌脑转移细胞系靶向肽BRBP1结合靶分子的筛选与鉴定[D]. 金张雅. 东南大学, 2020
- [4]增强型NKG2D-CAR T细胞抗前列腺癌作用及其机制的研究[D]. 何聪. 华东师范大学, 2020(12)
- [5]胃癌癌变过程分子特征的研究 基于免疫组预测鼻咽癌远处转移的研究[D]. 张雅静. 北京协和医学院, 2020(05)
- [6]IDH1突变体引起的糖脂代谢改变及其在肿瘤发生中的可能作用[D]. 陈艾. 厦门大学, 2019(01)
- [7]卵巢癌干细胞疫苗抗卵巢癌疗效及机制研究[D]. 吴迪. 东南大学, 2019(05)
- [8]miR-557靶向调控EGFR抑制胰腺癌细胞增殖和侵袭的机制研究[D]. 杨勇. 苏州大学, 2019(04)
- [9]MYH9促进食管癌细胞侵袭迁移的作用机制研究[D]. 简行. 北京协和医学院, 2019
- [10]miR-362在非小细胞肺癌转移中的作用及分子机制[D]. 罗丹. 北京交通大学, 2019(01)