一、细胞因子对细胞外基质在肝内沉积的影响（论文文献综述）
张强[1]（2021）在《基于肝窦内皮细胞微尺度生物力学性质研究芪术颗粒抗肝纤维化机制》文中研究表明肝纤维化（Hverfibrosis,LF）是肝胆系统疾病中的常见病,并且是大多数慢性肝病发展的必然阶段。目前医学界普遍认为早期肝纤维化能够逆转,但如何进行逆转,目前尚未形成普遍的共识。肝纤维化早期产生的诸多病理变化中,人们对肝窦内皮细胞（sinusoidal endothelial cells,SECs）的病理变化给予的关注逐渐增多,其特征性的细胞学行为改变包括“窗口”尺寸与数量的变化以及连续性基底膜的形成,一旦SECs发生去窗口化后,则肝纤维化的进程难以逆转,目前这已是不争的事实。目前针对肝纤维化的治疗,现代医学尚且只能给予病因治疗,针对肝纤维化本身而言,目前还没有疗效肯定的药物或治疗手段问世。中医药学在治疗肝纤维化方面的经验历史较长,并对其发病机制形成了完整的认识,尤其是在治未病思想指导下,针对慢性肝病给予早期干预,这在一定程度上能够降低患者未来发生肝纤维化、肝硬化的风险。芪术颗粒是姚乃礼教授经过多年的临床经验总结,结合目前中医药学界对肝纤维化的普遍认识基础上创制的治疗肝纤维化常用方,本课题在国家自然基金“基于肝窦内皮细胞微尺度生物力学性质研究芪术颗粒抗肝纤维化机制”（NO:81774282）的资助下,结合课题组前期的研究成果探讨益气活血方芪术颗粒治疗肝纤维化的机制。1.基于益气活血法治疗肝纤维化临床疗效的Meta分析目的:以Meta分析的方法评价益气活血法治疗肝纤维化的临床疗效。方法:1.以PubMed、中国知识基础设施工程数据库、万方数据知识服务平台为检索资料库,检索时间跨度为自建库到2020年12月31日;以检索词“liver fibrosis”、“hepatic fibrosis”为检索词,然后以“effect”或者“efficacy”作为关键词逐篇进行排除;以“肝纤维化”作为检索词进行检索,然后以“临床观察”、“疗效分析”作为关键词逐篇进行排除。以上数据库没有语言限制。2.纳入随机对照临床研究类文献,以肝纤维化四项、肝脏瞬时弹性成像、肝脾脏的形态、门脾静脉的宽度、不良反应、安全性等结局指标作为考核指标。结果:本次研究共纳入合格文献共93篇,其中有86篇文献以肝纤维化四项作为临床评价指标,两组对比显示中药组的临床疗效比对照组更好,结果对比具有统计学差异[MD=51.15,95%CI（56.95,45.35）,P<0.00001]。15篇文献以肝硬度值作为临床考核指标,两组对比显示中药组在改善肝硬度值方面具有更好的疗效,比较结果具有统计学差异[MD=3.52,95%CI（4.78,2.26）,P<0.00001]。33 篇文献研究以门静脉直径作为临床考核指标,两组对比显示中药组在改善门静脉直径方面具有更好的疗效,比较结果具有统计学差异[MD=1.20,95%CI（2.14,0.26）,P=0.01]。31篇文献研究以脾脏厚度作为临床考核指标,两组对比显示中药组在改善脾脏厚度方面具有更好的疗效,比较结果具有统计学差异[MD=6.83,95%CI（9.54,4.12）,P<0.00001]。13篇文献研究以脾静脉直径作为临床考核指标,两组对比显示中药组在改善脾静脉直径方面具有更好的疗效,比较结果具有统计学差异[MD=1.77,95%CI（3.04,0.49）,P=0.007]。结论:以益气活血为主要功效的中药组方在治疗肝纤维化方面相较于西药而言具有更好的临床疗效。2.基于肝窦内皮细胞微尺度生物力学性质研究芪术颗粒抗肝纤维化机制目的:（1）研究芪术颗粒对肝纤维化大鼠肝脏炎症因子、肝纤维化指标以及病理组织学的调控作用。（2）通过qRT-PCR、Western blot、免疫荧光法明确芪术颗粒对肝窦内皮细胞eNOSmRNA、eNOS、NO表达的影响。（3）基于多相多级次多孔介质理论,明确芪术颗粒干预下肝窦内皮细胞的力学特征。方法:（1）以四氯化碳作为肝纤维化的诱导剂,构建肝纤维化大鼠模型,造模同时给予芪术颗粒进行干预,通过Elisa法、HE以及Masson染色研究芪术颗粒对肝纤维化大鼠的生化、病理组织学的影响。（2）原位胶原酶灌注+离体消化+梯度密度分离法分离提取肝窦内皮细胞。（3）以10%肝纤维化大鼠血清+5%的胎牛血清作为外在损伤因素作用于体外培养状态的肝窦内皮细胞,模拟体内生化环境,构建肝窦内皮细胞损伤模型。将细胞按照正常对照组、损伤组、正常大鼠血清损伤组、芪术颗粒含药血清低、中、高浓度进行分组。（4）采用 qRT-PCR、Western blot、免疫荧光法检测胞内eNOSmRNA、eNOS、NO的表达情况。（5）基于多相多级次多孔介质理论,采用原子力显微镜表征芪术颗粒干预下肝窦内皮细胞的力学属性。结果:（1）芪术颗粒能够改善肝纤维化大鼠生化指标,改善肝脏病理组织形态。（2）经过细胞形态以及免疫荧光鉴定可知,我们所提取的细胞为大鼠肝窦内皮细胞,且纯度较高。（3）经 qRT-PCR、Western blot、免疫荧光法检测胞内 eNOSmRNA、eNOS、NO显示芪术颗粒含药血清能够上调eNOSmRNA、eNOS、NO的表达。（4）经过芪术颗粒含药血清干预后,肝窦内皮细胞的骨架模量、粘度均有所提高,使肝窦内皮细胞向正常力学状态转变,而其扩散系数无明显变化。结论:（1）芪术颗粒能够抑制肝脏炎症状态,恢复肝脏正常组织形态。（2）芪术颗粒能够上调eNOSmRNA、eNOS、NO的表达,从而改善肝窦内皮细胞的病理状态,这可能是其抗肝纤维化的重要机制之一。（3）芪术颗粒能够改善肝窦内皮细胞的力学状态,促进肝窦内皮细胞向正常力学状态恢复,这可能是其发挥抗肝纤维化的另一重要机制。
陈凯[2]（2021）在《miR-876调控POSTN促进肝癌进展和纤维化的机制研究》文中提出一、研究背景肝细胞性肝癌（HCC）是世界范围内最常见恶性肿瘤之一,目前在最致命肿瘤中致死率排名第二。在过去的几十年,针对肝癌已经有了众多治疗手段,如精准的肝段切除术,肝移植术,肝动脉栓塞化疗及肝癌射频消融术等,但是肝癌患者的预后仍然不令人满意,据统计,肝癌患者5年总生存率低于20%。肝癌起病隐匿,肿瘤进展快,容易复发和肝内转移都是导致肝癌预后较差的可能原因。因此,探究肝癌进展,转移的分子学机制有利于寻找潜在的肝癌治疗分子靶点,开发可能的早期肝癌诊断标志物对肝癌的系统治疗非常重要。微小RNA（miRNA）是以由一类进化保守的,由约22个核苷酸组成的非编码小RNA,微小RNA可结合在靶基因信使RNA（m RNA）的3?端的非翻译区（UTR区）通过降解信使RNA或抑制信使RNA翻译的方式发挥转录后调控作用。研究显示微小RNA几乎参与了肿瘤细胞发生发展的全部过程,包括细胞的干性,肿瘤发生,细胞的增殖,细胞的凋亡,细胞的迁移和侵袭,细胞的转移等等。也有越来越多的研究显示各种肿瘤中均有不同微小RNA的异常表达,包括肝癌。例如,miR-876被发现在胆管癌（CCA）中表达降低,并能通过抑制BCL-XL的表达诱导细胞的增殖;miR-589被发现在肝细胞性肝癌中表达增高并能通过STAT3信号通路来促进细胞的干性和化疗抵抗。然而,在肝细胞性肝癌中异常表达和对诊断或者预后有指示作用的miRNA仍然缺乏有待进一步研究。骨膜蛋白（POSTN）,也称为成骨细胞特异性因子2,是一大小为93.3k Da的细胞外基质（ECM）蛋白。POSTN能通过和众多其他蛋白如纤维结合蛋白,胶原蛋白及腱生蛋白等互相联系进而对细胞外基质进行改造。POSTN对胶原纤维的发生,细胞粘附,细胞迁移和上皮间质转换等都有重要作用。目前研究发现多种肿瘤中亦有POSTN的异常表达,包括头颈部肿瘤,肺癌,神经纤维瘤,乳腺癌,结直肠肿瘤及肝细胞性肝癌等,对肿瘤细胞的生存,上皮间质转换,血管生成和肿瘤微环境的形成都有重要作用。例如:研究发现胰腺癌细胞能刺激间质细胞分泌POSTN,进而促进肿瘤基质成绩和上皮间质转化进而促进肿瘤进展。然后,在肝细胞性肝癌中POSTN的表达及调控机制的研究尚少,有待进一步研究。在本文中,我们通过对TCGA数据库中异常表达的miRNA进行筛选,鉴定出了一异常表达的miRNA,即miR-876。我们还进一步探求了其细胞功能和对下游靶基因的调节机制。我们还在众多临床肝细胞性肝癌的临床组织标本中监测了miR-876和其靶基因POSTN的表达,分析了他们的表达和肝细胞性肝癌患者的临床病理参数和预后的关系。我们的研究提示miR-876及POSTN在肝细胞性肝癌中异常表达,可能作为一潜在的诊断性分子标志物和治疗靶点。二、研究方法1.分析49对肝癌及对应的癌旁样本的TCGA数据库,分析异常表达的miRNA,筛选出表达差异倍数最高的前20个微小RNA。2.收集了从2006年到2010年在西南医院肝胆科因患原发性肝细胞性肝癌而行原发性肝癌切除术的共计127例患者的组织样本,本研究说包含的所有病人术前均未接收放疗或者化疗。所有患者术后均定期性影像学（即超声或CT）即血液AFP检测。本研究团队及西南医院临床研究中心完成患者的预后随访,随访为结合到我院复查情况,定期（每2-3月）电话随访。3.采用实时定量PCR的方法检测了肝癌组织样本中miR-876和POSTN的表达水平;采用免疫组化（IHC）方法在原发性肝细胞性肝癌组织样本中检测了样本中POSTN及EMT标志物（E钙粘蛋白,N钙粘蛋白,波形蛋白）的表达情况,并在肝癌合并肝硬化样本中检测了POSTN的表达。4.采用Kaplan-Meier曲线分析（单因素）和Cox回归（多因素）方法分析了影响HCC患者预后的危险因素及独立危险因素,并进一步分析了miR-876和POSTN共表达对HCC预后的影响。5.采用了生物信息学及双荧光素酶报告基因实验研究了miR-876可能的调控靶基因,并进一步采用实时定量PCR及Western Blotting（WB）方法进行验证。6.Mi R-876的具体体内生物学行为在裸鼠实验中进行检测,最终成瘤效果以活体成像方式进行检测验证。7.采用WB方法分析了miR-876的表达对EMT标志物的影响,并在人肝星状细胞系LX-2中检测了纤维化蛋白α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）,胶原蛋白-I的表达。采用transwell小室侵袭实验研究了miR-876对肝癌细胞系的侵袭能力的影响。三、研究结果1.通过对49对肝癌患者的TCGA数据库进行分析,我们筛选出了表达差异倍数排名前20的高表达及低表达miRNA,进一步筛选鉴定出miR-876。2.我们发现miR-876在肝癌细胞系及肝癌组织中低表达。首先,我们发现miR-876在人正常肝细胞系L02中表达高,而在肝癌细胞系SMMC-7721,Hep G2,Huh-7及HCC-LM3中表达较低;接下来我们在50对肝癌及癌旁样本中检测了miR-876的表达,发现miR-876在肝癌组织/癌旁组织的比率62%有降低,16%变化不明显,而仅有22%表达升高。3.miR-876的低表达和肝硬化、癌栓及肝癌TNM分期相关。我们在127例HCC组织样本中检测了miR-876的表达,分析了其表达水平和HCC患者临床病理参数的相关性。发现miR-876的表达和肝硬化（P=0.026）、肝癌癌栓形成（P=0.031）及TNM分期（P=0.021）相关。而和其他病理参数,如患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤数量、乙肝、AFP水平、肝Child分级未发现显着相关性。我们还进一步在肝硬化及癌栓患者中检测了miR-876的表达水平,发现miR-876在肝硬化组织样本中表达较非肝硬化患者显着低（P=0.0294）,而其在有肝癌癌栓患者中表达亦显着低（P=0.0367）。4.miR-876抑制细胞侵袭、EMT及细胞纤维化。我们通过构建了miR-876过表达及干扰细胞株,通过transwell细胞侵袭实验发现过表达miR-876的肝癌细胞侵袭力减弱,而干扰miR-876后侵袭力增强,进一步通过WB实验发现过表达miR-876后N-钙粘蛋白及波形蛋白表达减弱,而干扰miR-876后E-钙粘蛋白表达亦减弱。在人星状细胞系LX-2中干扰miR-876表达后发现α-SMA及胶原蛋白-I表达减弱。5.miR-876靶向POSTN,并抑制其表达。我们通过生物信息学分析发现POSTN的3?UTR存在2个能与miR-876种子区结合的序列,进一步双荧光素酶报告基因实验发现野生型p GL3 POSTN荧光素酶质粒和miR-876共转染入293细胞后其萤火虫荧光信号/海肾荧光素酶荧光信号比值显着性降低,进一步WB实验证实当干扰miR-876后HCC细胞POSTN表达升高,而过表达组POSTN显着降低。我们进一步在127例肝癌临床组织标本中同时检测了miR-876和POSTN的表达,发现两者表达呈显着负相关,R值为-0.477,相关线性方程为y=-0.486x+0.394。6.miR-876通过POSTN抑制EMT及细胞纤维化。首先,我们发现过表达POSTN的肝癌细胞侵袭力增强,并促进了EMT标志物及纤维化标志物的表达。其次,我们在过表达POSTN的基础上转染了miR-876,发现共转染miR-876后抵消了侵袭力增加及EMT及纤维化标志物蛋白的表达。7.miR-876在体内动物实验下减弱HCC细胞肿瘤成瘤能力及抑制肿瘤进展。HCC细胞其miR-876过表达的HCC细胞被注入裸鼠肝包膜下,进行动物实验,1月后行活体成像检测,我们发现对照组（无干预的HCC细胞）成瘤数量多,活体成像荧光强度强,而实验组行miR-876过表达后,裸鼠原位肝脏成瘤明显减少,活体检测荧光信号弱,表明在体内实验条件下,miR-876能抑制HCC的成瘤及肿瘤进展。8.POSTN和肝组织EMT及肝硬化相关。我们进一步在127例肝癌组织中检测了POSTN的表达,发现同miR-876类似,POSTN表达和肿瘤数量、肝硬化、肝癌癌栓形成及TNM分期相关,而和其他临床标识物未发现明显相关性,进一步非参数检验验证了肝硬化或肿瘤癌栓组HCC患者的POSTN表达明显增高。IHC实验发现POSTN主要表达与肝癌间质,部分肝癌细胞亦有表达,POSTN高表达的样本N钙粘蛋白及波形蛋白表达增高,而E钙粘蛋白表达降低。而在肝癌伴肝硬化标本中发现POSTN亦有强表达。9.miR-876和POSTN和肝癌患者术后预后相关。进一步KM单因素生存分析发现肿瘤大小（P=0.037）、肝硬化（P=0.041）、肝癌癌栓状态（P=<0.01）、TNM分期（P=0.001）、miR-876低表达（P=0.022）及POSTN高表达（P=0.012）均是影响HCC患者预后的危险因素,多因素回归分析发现肝癌癌栓（风险比=2.530,95%CI区间=1.433-4.468,P=0.001）及POSTN的表达（风险比=1.717,95%CI区间=1.008-2.926,P=0.047）是影响肝癌预后的独立危险因素。进一步共表达分析提示miR-876低表达和POSTN高表达的HCC患者预后较之于miR-876低表达和POSTN高表达更差。四、研究结论综上所述,我们从公开的TCGA数据库中鉴定出了肝癌中一显着性低表达的miRNA,即miR-876。并探索了其对细胞的功能,即能抑制细胞侵袭,EMT和纤维化。而miR-876这些功能是通过调控POSTN的表达实现的。miR-876在体内动物实验下能抑制肝癌的成瘤及进展;我们还在众多肝癌临床标本中从m RNA及蛋白水平证明了miR-876和POSTN的异常表达和肝癌的EMT水平,纤维化水平及进展相关,而miR-876和POSTN的异常表达和HCC的预后相关,而联合miR-876和POSTN检测可能更好预测HCC的预后以及作为潜在的治疗靶点。
宋健[3]（2021）在《基于核受体探讨人参皂苷25-OCH3-PPD和M4调控肝纤维化的作用机制研究》文中指出目的:肝纤维化（hepatic fibrosis）是慢性肝病的常见病理基础,并且是慢性肝病发展为肝硬化的必要阶段。肝纤维化的主要特征是激活肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）介导细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的过度沉积。并且慢性肝脏炎症也会加速肝纤维化的进程。人参皂苷活性成分是人参中主要的活性物质,其药理作用与能量代谢和调控炎症反应有关。人参皂苷具有肝保护、抗氧化、抗炎等广谱的药理活性。核受体肝X受体（liver X receptor,LXRs）与法尼酯X受体（Farnesoid X receptor,FXR）作为调节能量代谢的重要途径,在调控肝纤维化和炎症中发挥重要作用。本课题是基于核受体LXRs与FXR探讨人参皂苷25-OCH3-原人参二醇（25-OCH3-PPD）及20S-原人参三醇（M4）调控肝纤维化的作用与机制研究。方法:1.人参皂苷25-OCH3-PPD促进LXRs的活性改善P2X7r介导的NLRP3炎症小体在肝纤维化进程中的作用:（1）TAA诱导的肝纤维化:C57BL/6小鼠分为六组:正常组、TAA组、TAA+25-OCH3-PPD（5、10、20 mg/kg）给药组和TAA+Silymarin（100 mg/kg）组。25-OCH3-PPD与Silymarin组小鼠通过灌胃的方式给药。除正常组外,其他各组小鼠均通过腹腔注射TAA（第一周100 mg/kg,三次;第二周至第五周200mg/kg,每周两次）。相关指标的测定:采用H&E染色、Sirius Red染色、Masson染色法检测组织病理学变化。检测血清中ALT、AST变化水平。TUNEL染色法检测25-OCH3-PPD对肝细胞凋亡的影响。在TAA诱导的肝纤维化中,通过蛋白印记、RT-PCR、免疫组织化学染色以及组织荧光染色实验检测细胞外基质、炎症因子、SIRT1、FXR、LXRα、LXRβ、P2X7r和NLRP3等蛋白或m RNA的表达情况。分析了与TAA诱导的凋亡途径相关的几个分子蛋白的表达,包括caspase-3、Bcl-2、Bax、Bid、c FILP。（2）体外实验:选用HSC-T6细胞,TGF-β刺激2 h,然后用25-OCH3-PPD（1、5或10μM）或caspase-1抑制剂I培养6 h。这些细胞被收集,分别做Western blotting以及免疫荧光实验,检测HSC-T6细胞中α-SMA、P2X7r、NLRP3、LXRβ、LXRα、caspase-1、IL-1β等蛋白的表达水平;并通过免疫荧光染色做进一步验证。2.20S-原人参三醇通过调控FXR-P2X7r信号通路改善肝纤维化进程的研究中:（1）TAA诱导的肝纤维化:C57BL/6小鼠随机分成4组:正常组、TAA组、TAA+M4-10组、TAA+M4-20组。小鼠每天采用M4（10和20 mg/kg）或等量生理盐水灌胃处理。除正常组小鼠外,小鼠腹腔注射TAA（第一周100 mg/kg,三次;第二周至第五周200 mg/kg,每周两次）,以建立小鼠肝纤维化模型。相关指标的测定:采用H&E染色法检测组织病理学变化。提取总蛋白进行蛋白印迹分析实验,检测α-SMA、Collagen I、TIMP-1、MMP-13、FXR、P2X7r、NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-6等蛋白的表达水平;并提取RNA,通过RT-PCR定量分析,检测m RNA的表达水平,以及免疫荧光染色做进一步验证。（2）HSC-T6细胞体外实验:HSC-T6细胞被TGF-β刺激2 h后,再用浓度为10、20μM的M4或guggulsterone（50μM）或GW4064（2μM）处理4 h。提取细胞总蛋白进行蛋白印迹分析实验,检测HSCs细胞中α-SMA、FXR、P2X7r、caspase-1等蛋白的表达水平;并提取RNA,通过RT-PCR定量分析,检测m RNA的表达水平,以及FXR与P2X7r免疫荧光染色做进一步验证。（3）Hep G2细胞质粒转染（sh RNA-FXR）:对Hep G2细胞给予FXR特异性si RNA转染48 h,然后给予TGF-β培养2 h,再用M4孵育细胞4 h。利用RT-PCR、Westeron blot,以及免疫荧光法检测FXR、α-SMA和P2X7r的表达变化以及IL-1β蛋白表达情况。结果:1.人参皂苷25-OCH3-PPD通过促进LXRs的活性改善P2X7r介导的NLRP3炎症小体在肝纤维化进程中的研究:（1）TAA诱导肝纤维化小鼠模型:TAA组小鼠血清ALT、AST水平升高,肝组织发生损伤并有大量胶原沉积;而25-OCH3-PPD可以降低血清中ALT、AST水平;改善TAA诱导小鼠肝脏组织的病理变化以及肝组织中胶原沉积情况;25-OCH3-PPD可以改善肝组织中纤维化相关指标α-SMA、Collagen-I、TIMP-1、MMP-13;降低促炎细胞因子表达水平,包括降低caspase-1、IL-1β、IL-18等蛋白和m RNA的表达水平;改善肝组织中肝细胞凋亡情况,调控了caspase-3、Bcl-2、Bax、Bid、FILP凋亡途径相关分子蛋白的表达;并抑制P2X7r-NLRP3炎症小体的活化进;抑制PI3K/Akt磷酸化,活化LKB1/AMPK-SIRT1信号通路;25-OCH3-PPD还能改善由TAA诱导的LXRs和FXR的活性降低。（2）体外实验中,25-OCH3-PPD减弱HSC-T6细胞中促纤维化标志物α-SMA的转录活性;25-OCH3-PPD可以通过调控LXRs和P2X7r-NLRP3、P-PI3K/P-Akt的表达降低,抑制肝星状细胞的活化;并且在肝星状细胞中抑制了caspase-1、IL-1β、IL-18的表达,与caspase-1抑制剂I效果一致。2.20S-原人参三醇通过调控FXR-P2X7r信号通路改善肝纤维化进程的研究:（1）在TAA诱导的小鼠肝纤维化中,M4可减轻组织病理学改变,改善肝损伤;M4可以调节肝组织中肝纤维化相关指标α-SMA、Collagen-I、TIMP-1、MMP-13的表达;并降低肝组织中促炎细胞因子表达水平,包括降低F4/80、caspase-1、IL-1β、IL-18等蛋白和m RNA的表达水平;蛋白印记、RT-PCR、组织免疫荧光实验表明,M4显着增加FXR的蛋白和m RNA的表达;M4也抑制了和P2X7r、NLRP3的表达,对P2X7r-NLRP3信号通路具有调控作用。（2）HSC-T6细胞体外实验中,TGF-β刺激后肝星状细胞被活化;给予M4可抑制HSC-T6中细胞外基质（ECM）的沉积包括α-SMA、Collagen-I、TIMP-1的表达,升高MMP-13的表达;以及降低caspase-1、IL-1β、IL-1R1和IL-6等炎症因子的表达水平;M4显着增加了FXR的表达,抑制了P2X7r-NLRP3信号通路,并作为FXR激动剂GW4064发挥作用;M4与GW4064激活FXR,抑制了P2X7r、α-SMA、caspase-1、IL-1β、IL-1R1的表达;（3）并且对Hep G2细胞转染FXR,建立sh RNA-FXR,实现了Hep G2细胞低表达FXR;但给予M4后FXR被激活,活化FXR后进而抑制了P2X7r、α-SMA、caspase-1的表达。结论:人参皂苷25-OCH3-PPD与M4可改善TAA诱导小鼠和活化HSCs中纤维化形成及炎症。25-OCH3-PPD可能激活LXRs,以改善P2X7r介导的NLRP3炎症小体。并且25-OCH3-PPD可以通过调控LKB1-AMPK信号通路以及激活SIRT1调节TAA诱导的肝纤维化和肝脏炎症。M4改善了TAA诱导的肝纤维化,其调控肝纤维化机制可能通过激活FXR介导P2X7r-NLRP3炎症信号通路。因此,25-OCH3-PPD和M4可能是一种有效的抗肝纤维化和抗肝脏炎症活性物质。
苏骁男[4]（2021）在《纤维连接蛋白额外结构域A促进肝纤维化及血管异常增生的作用与机制研究》文中指出研究背景肝纤维化是众多慢性肝脏疾病发生发展中重要的病理过程,其主要表现为肝脏内纤维结缔组织的异常沉积和病理性的血管增生。在各种慢性损伤因素的持续刺激下,肝纤维化会逐渐向肝硬化发展,进而引起肝门静脉高压、食管静脉曲张等一系列严重并发症。肝纤维化肝硬化在发达国家中造成的死亡率高达约45%,尽管有证据表明早期及时地对其进行干预可以缓解甚至逆转肝纤维化肝硬化,但临床上目前仍然缺乏统一规范的治疗方案。因此,进一步探究肝纤维化的发病机制,研发新的肝纤维化治疗靶点,对临床有着重要的指导意义。肝纤维化的发病机制主要包括两个方面。一方面,肝星状细胞在各种刺激下持续活化,分泌大量细胞外基质,造成纤维结缔组织过度沉积,导致肝脏硬度升高,压迫正常肝脏组织。另一方面,肝窦内皮细胞的活化导致肝内血管病理性增生血管网络发生重构,引起肝内血管阻力增加,进而影响正常肝脏血供,引起门脉高压。肝内血管异常增生对肝纤维化的发生发展有着重要的促进作用,有研究表明在肝纤维化早期利用特异性抗血管药物可以抑制肝纤维化的发展,但其具体机制目前还有待进一步的研究。纤维连接蛋白（Fibronectin）作为细胞外基质的重要组成成分,其包含有额外结构域 A 的 RNA 剪接体 FN-EDA（Fibronectin containing Extra Domain A）特异性表达在胚胎早期,以及特定的病理环境中。FN-EDA在包括肺、肾脏、皮肤、肝脏、骨髓在内的多种组织器官的纤维化中都扮演了重要的角色,但其具体机制目前尚未完全阐明。在肝纤维化中,早期研究提示FN-EDA参与了星状细胞的活化;但近期研究表明,FN-EDA主要影响了肝星状细胞的迁移能力而对于星状细胞的活化影响有限。肝内血管病理性异常增生作为肝纤维化过程中的重要部分,目前被认为是治疗肝纤维化的一个重要靶点。尽管FN-EDA在胚胎阶段参与了心血管系统的发生,并且有研究指出其促进了视网膜血管的生成,但FN-EDA在包括肝纤维化在内的一系列纤维化疾病中,对血管异常增生的影响以及其分子机制,目前尚未见报道。综上,本研究主要分为三个部分。第一部分利用临床标本、小鼠肝纤维化模型以及体外细胞共培养模型,深入探讨了 FN-EDA在肝纤维化中与肝内血管增生的关系以及作用效应。第二部分通过细胞实验和动物模型,深入探究了 FN-EDA促进肝纤维化血管增生的主要通路和具体调控机制。第三部分通过动物实验初步探究FN-EDA与其受体的特异性阻断剂Irigenin对肝纤维化血管增生潜在的治疗作用。本研究从崭新的角度揭示FN-EDA促进肝纤维化发生发展的相关机制,为肝纤维化的临床治疗策略提供了潜在的靶点以及相应的理论基础。第一部分星状细胞上的FN-EDA促进肝纤维化及血管异常增生研究目的FN-EDA在纤维化疾病中发挥着重要作用,但其在纤维化中对血管异常增生的影响尚不明确。本研究旨在探究FN-EDA与肝纤维化及血管异常增生的关系。研究方法1.检测FN-EDA在肝纤维化样本中的表达水平运用RT-qPCR检测临床肝纤维化患者以及正常人的肝脏组织中FN-EDA mRNA的表达水平,运用免疫蛋白印迹实验与免疫组织化学染色检测纤维化患者及正常人群肝脏组织中FN-EDA表达水平和定位情况,并进行统计分析。2.检测纤维化肝组织中FN-EDA与血管标志物CD31的表达并分析其相关性运用RT-qPCR检测临床肝纤维化患者的肝脏组织中FN-EDA与CD31的表达水平;运用免疫组化检测患者以及造模小鼠肝纤维化肝组织中FN-EDA与CD31的表达水平和定位情况,量化统计后进行相关性分析。3.研究FN-EDA对肝纤维化血管异常增生的促进作用通过组织免疫荧光双染实验明确FN-EDA的主要来源（星状细胞）后,体外实验构建抑制FN-EDA表达的星状细胞。同时利用共培养体系,检测星状细胞在敲低FN-EDA前后对内皮细胞成管以及迁移功能的影响。同时利用FN-EDA特异性阻断抗体,进一步验证FN-EDA在该过程中的作用。4.在FN-EDA抑制的小鼠模型中检测肝纤维化及肝内血管增生情况利用带有FN-EDA shRNA的腺相关病毒AAV9,构建FN-EDA敲低的小鼠肝纤维化模型。利用冰冻切片组织免疫荧光实验以及Western blot检测CD31以及α-SMA的表达水平和分布情况。研究结果1.FN-EDA在肝纤维化肝组织中的表达水平显着升高通过RT-qPCR、Western blot、免疫组化检测FN-EDA在纤维化肝组织及正常肝组织中的表达水平。结果显示,与正常肝组织相比,纤维化肝组织中的FN-EDA的表达水平显着升高,并且主要定位在纤维化肝组织的窦间隙附近。2.在肝纤维化中FN-EDA与肝内血管增生正相关通过RT-qPCR及免疫组化检测FN-EDA以及血管标志物CD31在纤维化肝组织中的mRNA水平。结果显示,在纤维化肝组织中FN-EDA与CD31的表达呈显着正相关。同时利用四氯化碳构建小鼠肝纤维化模型,每隔两周取造模小鼠的肝组织,免疫组化检测FN-EDA与CD31在肝组织中的表达情况。结果显示,随着造模时间的延长,FN-EDA与CD31的表达呈现升高趋势,且两者的变化情况存在同步性。3.星状细胞表达的FN-EDA促进了血管增生通过免疫荧光双染实验检测小鼠纤维化肝组织中FN-EDA与星状细胞标志物α-SMA、肝细胞标志物白蛋白、内皮细胞标志物CD31的共定位情况。结果显示FN-EDA的定位主要和α-SMA重合,提示FN-EDA主要来源于星状细胞。因此我们利用Transwell细胞培养板将LX-2星状细胞与HUVEC、SK-hep1以及人原代HSEC进行共培养,期间敲低LX-2中的FN-EDA或预先加入FN-EDA特异性中和抗体IST-9及3E2,然后进行成管和迁移实验。结果显示,敲低LX-2中FN-EDA或预先加入上述中和抗体显着抑制共培养条件下内皮细胞的成管长度及迁移数目。4.敲低FN-EDA抑制了小鼠模型中的肝纤维化及血管增生水平在四氯化碳诱导的C57BL/6小鼠肝纤维化造模过程中,利用带有FN-EDA shRNA的AAV9通过尾静脉注射方式敲低小鼠肝脏中的FN-EDA。通过组织免疫荧光以及Western blot检测FN-EDA的敲低情况以及相应小鼠肝脏中CD31和α-SMA的表达情况。结果显示,与对照组相比,四氯化碳诱导的小鼠纤维化肝脏中的FN-EDA,α-SMA与CD31表达水平显着提高;敲低FN-EDA的表达显着抑制了肝纤维化中α-SMA与CD31的表达。提示FN-EDA参与了肝纤维化及血管增生。第二部分肝纤维化中FN-EDA通过整合素激活VEGFR2促进血管异常增生研究目的FN-EDA在肝纤维化中促进了血管异常增生,但其具体作用机制尚不明确。本研究旨在研究FN-EDA促进了血管异常增生的具体机制,为肝纤维化抗血管增生治疗提供潜在靶点。研究方法1.探究FN-EDA对VEGFR2的调控效应运用Western blot分别检测:利用AAV-9敲低小鼠体内FN-EDA并进行肝纤维化造模后,小鼠肝脏中的VEGFR2磷酸化水平;敲低LX-2星状细胞中的FN-EDA后,共培养条件下HUVEC与HSEC的VEGFR2磷酸化水平;以及利用FN-EDA特异性中和抗体阻断后内皮细胞的VEGFR2的磷酸化水平。并进行统计分析。另外,利用VEGF与VEGFR2的特异性阻断剂ZM323881与FN-EDA共同或单独刺激HUVEC,检测内皮细胞VEGFR2磷酸化水平的变化。2.探究EDA片段自身对内皮细胞的活化作用分别利用不含有EDA片段的FN,全长的FN-EDA蛋白以及重组EDA片段蛋白刺激HUVEC以及HSEC,检测在不同刺激下两种内皮细胞的成管与迁移能力以及内皮细胞VEGFR2相关通路的变化。3.探究FN-EDA作用于内皮细胞的特异性受体利用FN-EDA与TLR4的抑制剂Restorvid以及FN-EDA与整合素的抑制剂Irigenin分别预处理后再用FN-EDA刺激HUVEC与HSEC,检测在阻断不同受体后两种内皮细胞的成管与迁移能力以及内皮细胞VEGFR2相关通路蛋白磷酸化的变化。利用不同的整合素中和抗体anti-α4、anti-α9、anti-β1和对照IgG预处理后再用重组EDA蛋白刺激HUVEC与HSEC,检测在阻断不同整合素亚基后两种内皮细胞的成管与迁移能力以及内皮细胞VEGFR2相关通路的变化。4.探究CD63是否介导了 FN-EDA刺激下整合素到VEGFR2之间的信号转导4.1检测FN-EDA是否通过反式激活作用促进了 VEGFR2的磷酸化利用FN-EDA与整合素的抑制剂Irigenin预处理后再加入FN-EDA共同刺激HUVEC,通过Western blot检测整合素下游FAK、Src的磷酸化水平变化。并利用Src磷酸化抑制剂SU6656预处理后再加入FN-EDA共同刺激HUVEC,通过Western blot检测阻断Src后FN-EDA对VEGFR2磷酸化的影响。4.2检测CD63是否参与了整合素与VEGFR2共受体的形成利用带有Flag标签的重组EDA蛋白刺激HUVEC后,用相应标签抗体进行蛋白免疫共沉淀实验。通过Western blot检测与重组EDA蛋白结合的膜蛋白复合物,观察VEGFR2、整合素β1与CD63三者的结合情况。4.3抑制或过表达CD63后检测FN-EDA对整合素下游通路及VEGFR2磷酸化水平的影响在HUVEC中利用lipo3000单独转染CD63 siRNA或先后转染CD63 siRNA和CD63过表达质粒后,用FN-EDA继续刺激6小时。随后利用Western blot检测整合素下游FAK和Src以及VEGFR2磷酸化水平的变化。4.4抑制或过表达CD63后检测FN-EDA对内皮细胞功能的影响在HUVEC中利用lipo3000单独转染CD63 siRNA或先转染CD63 siRNA,24小时后转染CD63过表达质粒,72小时后用FN-EDA继续刺激6小时,检测在敲低或敲低后过表达CD63的情况下,FN-EDA对HUVEC的成管和迁移能力的影响。4.5检测CD63在肝纤维化中的表达水平及分布情况利用免疫组化检测纤维化肝组织中CD63的表达水平以及分布情况。利用免疫荧光双染检测CD63与内皮细胞标志物CD31的共定位情况。研究结果1.FN-EDA促进了内皮细胞上VEGFR2磷酸化与正常肝组织相比,纤维化肝组织中的VEGFR2磷酸化水平显着升高;敲低小鼠肝脏中的FN-EDA显着抑制了纤维化肝组织中的VEGFR2磷酸化水平。敲低LX-2星状细胞中的FN-EDA后显着抑制共培养条件下HUVEC以及人原代HSEC上的VEGFR2磷酸化水平。FN-EDA特异性中和抗体IST-9、3E2显着抑制共培养条件下HUVEC以及人原代HSEC上的VEGFR2磷酸化水平。Western blot显示FN-EDA敲低后的LX-2星状细胞中VEGF的表达水平有一定降低。因此利用VEGF与VEGFR2的特异性阻断剂ZM323881与FN-EDA共同或单独刺激HUVEC,检测内皮细胞VEGFR2磷酸化水平的变化。结果显示,ZM323881只能轻微抑制FN-EDA促进的VEGFR2磷酸化。以上结果提示FN-EDA可以以VEGF非依赖的方式促进VEGFR2磷酸化。2.EDA片段自身可以促进内皮细胞激活以及VEGFR2磷酸化分别利用不含有EDA片段的FN,全长的FN-EDA蛋白以及重组EDA片段蛋白刺激HUVEC以及HSEC,检测在不同刺激下内皮细胞成管和迁移能力的变化以及VEGFR2相关通路蛋白的磷酸化情况。结果显示,FN-EDA以及重组EDA蛋白显着促进内皮细胞的成管长度与迁移数目,以及VEGFR2、PI3K、AKT、PLCγ和ERK的磷酸化。3.FN-EDA通过整合素受体促进VEGFR2磷酸化3.1阻断FN-EDA与整合素结合显着抑制内皮细胞激活以及VEGFR2磷酸化利用FN-EDA与整合素的抑制剂Irigenin以及与TLR4的抑制剂Restorvid预处理后再用FN-EDA刺激HUVEC与HSEC,检测两种内皮细胞的成管长度和迁移数目。结果显示,加入Irigenin显着抑制内皮细胞的成管长度和迁移数目以及VEGFR2磷酸化,而Restorvid几乎对此没有作用。上述结果提示FN-EDA主要通过整合素受体影响内皮细胞功能及VEGFR2的激活。3.2 FN-EDA主要通过整合素β1促进内皮细胞的激活分别利用不同的整合素中和抗体anti-α4、anti-α9、anti-β1和对照IgG与重组EDA蛋白共同刺激HUVEC与HSEC,检测在阻断不同整合素下两种内皮细胞的成管长度、迁移能力以及VEGFR2的磷酸化水平。结果显示,anti-α4、anti-β1显着抑制FN-EDA促进的内皮细胞成管能力,而anti-α9并无明显抑制作用;anti-α9、anti-β1 显着抑制 FN-EDA 促进的内皮细胞成管能力,而 anti-α4 并无明显抑制作用;anti-α4、anti-α9、anti-β1抑制FN-EDA促进的VEGFR2磷酸化水平,其中anti-β1作用尤为显着。以上结果提示整合素β1为FN-EDA激活内皮细胞最重要的整合素。4.FN-EDA通过整合素激活VEGFR2依赖于CD634.1 FN-EDA通过整合素下游Src反式激活作用VEGFR2磷酸化利用FN-EDA与整合素受体抑制剂Irigenin共同或单独刺激HUVEC,Western blot检测整合素下游FAK、Src的磷酸化水平。结果显示,FN-EDA可以显着促进FAK、Src的磷酸化,Irigenin抑制了该促进作用。接着利用FN-EDA与Src磷酸化阻断剂SU6656共同或单独刺激HUVEC,Western blot检测,Src以及VEGFR2的磷酸化水平。结果显示,抑制Src磷酸化后,FN-EDA促进的VEGFR2磷酸化得到抑制。4.2 CD63参与了整合素与VEGFR2共受体的形成利用带有Flag标签的重组EDA蛋白刺激HUVEC后,用相应标签抗体进行蛋白免疫共沉淀实验。Western blot检测与重组EDA蛋白结合的蛋白复合物中,相应蛋白的水平。结果显示,VEGFR2、整合素β1与CD63可以在与EDA结合的蛋白复合物中检测到,提示CD63参与了整合素β1与VEGFR2共受体的形成。4.3 CD63介导了 FN-EDA刺激下整合素到VEGFR2之间的信号转导利用CD63 siRNA和CD63过表达质粒,在HUVEC中敲低或敲低后过表达CD63,随后用FN-EDA进行刺激,Western blot检测整合素下游FAK和Src以及VEGFR2的磷酸化水平。结果显示,敲低CD63可以显着抑制FN-EDA刺激的VEGFR2磷酸化水平升高,但对FN-EDA刺激的整合素下游FAK和Src的磷酸化水平无明显抑制作用,并且敲低后再过表达CD63可以恢复VEGFR2的磷酸化水平。提示CD63介导了 FN-EDA刺激下整合素到VEGFR2的信号转导。4.4敲低CD63抑制了内皮细胞的成管和迁移功能利用CD63 siRNA和CD63过表达质粒,在HUVEC中敲低或敲低后过表达CD63,随后用FN-EDA进行刺激,进行成管和迁移实验。结果显示,敲低CD63可以显着抑制FN-EDA促进的内皮细胞的成管长度和迁移数目,再次过表达CD63上述抑制效应解除。4.5在肝纤维化中CD63高表达于肝窦内皮细胞通过免疫组化实验检测小鼠纤维化与正常肝组织中CD63的表达情况。结果显示,与正常肝组织相比,CD63的在纤维化肝组织中表达显着升高,并且主要表达在肝窦部位。利用免疫荧光双染实验检测CD63与内皮细胞标志物CD31共定位情况,结果显示CD63主要表达部位定位在内皮细胞上。第三部分FN-EDA阻断剂Irigenin抑制了小鼠肝纤维化及血管增生研究目的我们前期研究证实了 FN-EDA在肝纤维化中通过整合素激活了 VEGFR2促进了血管增生。Irigenin作为FN-EDA与整合素特异性的阻断剂,体外实验证实了其可以抑制FN-EDA促进的内皮细胞激活。本部分旨在探究FN-EDA 阻滞剂Irigenin作为潜在抗纤维化及血管增生的药物价值。研究方法1.构建阻断FN-EDA与整合素结合的小鼠肝纤维化模型通过向健康的6周龄C57BL/6小鼠腹腔注射四氯化碳的方式构建小鼠肝纤维化模型,从造模的第2周开始,每两天一次,以5mg/kg的剂量,用FN-EDA与整合素的阻断剂Irigenin对小鼠进行灌胃给药。2.Irigenin阻断FN-EDA与整合素后检测小鼠肝纤维化中血管增生的水平取造模6周的小鼠肝脏,用1%OsO4固定制片后,利用透射电子显微镜观察并记录肝窦内皮细胞窗孔结构的大小和数量以及基底膜的厚度;运用Western blot检测阻断FN-EDA与整合素小鼠肝纤维化造模后肝脏VEGFR2磷酸化水平;运用免疫组化检测肝脏组织中CD31的表达水平,并进行统计学分析。3.Irigenin阻断FN-EDA与整合素后检测小鼠肝纤维化的水平取造模6周的小鼠肝脏,石蜡包埋制片后,HE、Masson染色检测肝纤维化水平,免疫组化检测α-SMA的表达水平,并进行统计学分析。4.在不同时间点检测Irigenin阻断FN-EDA与整合素后小鼠肝纤维化及血管增生的情况利用上述造模方法,持续造模10周。每两周收集一批肝脏组织,进行Masson染色以及免疫组化检测α-SMA、CD31的表达,并进行统计学分析。研究结果1.Irigenin抑制了小鼠肝纤维化模型中的肝内血管增生收集造模6周的肝脏组织,利用透射电子显微镜拍摄肝窦内皮细胞的形态学变化。结果显示,与对照组相比,纤维化组中的肝窦内皮细胞窗孔大小和数量明显减少,基底膜显着增厚。给予Irigenin有效地减少肝窦内皮的激活,保留了窗孔结构,减少了基底膜的形成。通过Western blot检测小鼠肝脏VEGFR2磷酸化水平,进行统计分析。结果显示,给予Irigenin显着抑制了纤维化肝组织中的VEGFR2磷酸化水平。通过免疫组化检测CD31的表达,结果显示,Irigenin有效地减少了肝脏CD31的水平。2.Irigenin抑制了小鼠肝纤维化模型中的肝脏纤维化水平收集造模6周的肝脏组织进行HE染色、马松染色以及免疫组化检测α-SMA。结果显示,给予Irigenin显着抑制了纤维化肝组织中炎性细胞的浸润、纤维结缔组织沉积以及α-SMA的表达。3.Irigenin主要在肝纤维化早期抑制了肝脏血管增生以及纤维化水平从造模第二周开始,每两周收集一批上述肝脏组织进行马松染色,以及免疫组化检测α-SMA与CD31,持续10周。结果显示,Irigenin可以有效抑制小鼠体内的血管增生,但其对肝脏纤维化的抑制效果主要发生在纤维化早期,到了纤维化晚期该抑制作用出现减弱。研究结论1.通过对肝纤维化临床标本,小鼠肝纤维化模型的研究,证实了 FN-EDA在肝纤维化中促进了肝内血管的异常增生。2.在肝纤维化中,星状细胞来源的FN-EDA通过旁分泌作用促进了内皮细胞的血管增生功能。FN-EDA可以通过整合素受体,尤其是整合素β1,在CD63的介导下以VEGF非依赖的方式激活VEGFR2,促进内皮细胞活化。3.体内实验证实阻断FN-EDA和整合素结合可以有效地缓解肝纤维化血管增生的进程。
谢海深[5]（2021）在《七叶皂苷钠通过PI3K/AKT/mTOR通路抑制eIF4F复合物进而缓解大鼠肝纤维化》文中提出目的 肝炎-肝硬化-肝癌的连续发展过程为肝癌发展的一般规律,被称为肝癌发展的三部曲。我国作为最大的发展中国家是肝炎感染大国,也是肝癌患者高发国家,当前全世界对于肝癌的治疗方法包括手术切除肿瘤病灶、经B超引导的射频或微波消融术、放射治疗、化学药物治疗和肝脏活体器官移植等,但是治疗效果有限。肝硬化为肝癌发展的重要中间过程,早期干预阻断此过程可大大降低患者发展为肝癌的可能性。肝硬化的发展是一个漫长的连续过程,肝纤维化是肝硬化发展的早期可逆阶段。肝纤维化的主要特征为肝星状细胞激活转分化为肌成纤维细胞,分泌大量的包括胶原蛋白I、胶原蛋白III、α-SMA和纤维连接蛋白等在内的细胞外基质组分,不断沉积在肝小叶间的汇管区。七叶皂苷钠是从传统中药娑罗子中提取的主要成分,已知的功效包括抗炎、消肿、扩张血管和改善微循环等,前期实验证明七叶皂苷钠对原发性肝癌具有明显抑制作用,本研究主要探究七叶皂苷钠对肝纤维化发展的影响作用及机制。方法 本研究主要通过体外和体内实验验证七叶皂苷钠对于肝纤维化发展的影响作用。体内实验将雄性大鼠分为空白对照组、CCl4诱导的模型组和在CCl4诱导的基础上给予七叶皂苷钠处理的治疗组三组。对照组大鼠予以橄榄油腹腔注射处理,模型组和治疗组均通过腹腔注射四氯化碳液诱导实验大鼠肝脏进展为肝纤维化,此处理贯穿于整个8周实验过程。从实验的第3周开始,对治疗组给予适量七叶皂苷钠进行腹腔注射,对照组以及模型组给予腹腔注射等量的医用生理盐水。第8周末时开腹取大鼠肝脏组织,通过免疫组化、HE以及Masson染色检测对照组、模型组和治疗组三组大鼠肝脏纤维化发展程度以及组织中胶原蛋白的表达情况。在体外细胞试验中,通过MTT、克隆形成实验检测七叶皂苷钠处理的HSC-T6细胞的生长增殖活性,通过流式细胞学检测七叶皂苷钠处理的HSC-T6细胞凋亡程度,通过免疫蛋白印迹检测七叶皂苷钠对HSC-T6细胞内eIF4F复合物以及PI3K/AKT/mTOR通路中各蛋白表达影响情况。结果 CCl4诱导大鼠肝纤维化形成明显,HE、Masson及免疫组化染色结果显示,七叶皂苷钠处理使大鼠肝脏细胞外基质中的α-SMA,COL-I和COL-III含量较四氯化碳诱导肝纤维化的模型组明显下降。MTT检测结果显示,七叶皂苷钠使HSC-T6细胞增殖活性显着降低;克隆形成实验显示,七叶皂苷钠使HSC-T6细胞的细胞集落形成数明显减少;流式细胞学检测结果显示,七叶皂苷钠使HSC-T6细胞凋亡数量增加,以早期凋亡数量增加最为明显;免疫蛋白印迹表明,七叶皂苷钠可下调HSC-T6细胞中α-SMA、COL-Ⅰ和COL-Ⅲ等胶原蛋白的表达。七叶皂苷钠处理的大鼠肝组织免疫组化染色和HSC-T6细胞免疫蛋白印迹结果均显示e IF4G,e IF4E蛋白的表达量降低。七叶皂苷钠可下调HSC-T6细胞中PI3K/AKT/mTOR/4EBP1信号通路中各蛋白质的表达水平,降低4EBP1磷酸化水平。结论 七叶皂苷钠通过PI3K/AKT/mTOR通路抑制eIF4F复合物的合成进而缓解大鼠肝纤维化的进展。
张艳艳[6]（2021）在《核自身抗原精子蛋白NASP基因突变对ConA诱导的小鼠肝损伤的影响及其机制研究》文中进行了进一步梳理目的:探讨核自身抗原精子蛋白（NASP）基因突变对刀豆蛋白A（ConA）诱导的小鼠肝损伤的影响及其作用机制。方法:将实验动物分为2组,野生型B6（B6-WT）小鼠为对照组,NASP基因突变型B6（B6-NASPM）小鼠为实验组。首先,通过尾静脉注射致死剂量ConA 25 mg/kg,测定2组小鼠生存率;其次,通过尾静脉注射ConA 12.5mg/kg建立2种肝损伤模型:单次注射8小时诱导的急性肝损伤模型;每周1次、连续注射8周诱导的慢性肝纤维化模型。通过HE染色观察肝组织病理变化、TUNEL染色观察肝细胞凋亡、Masson染色测定胶原纤维沉积及微板法检测血清肝酶水平来比较2组小鼠肝损伤差异;通过QRT-PCR检测TNF-α、IFN-γ、I型胶原蛋白及III型胶原蛋白在肝组织m RNA基因表达水平、ELISA法检测TNF-α、IFN-γ血清蛋白表达水平、免疫组织化学染色检测肝组织α-SMA阳性表达、流式细胞术检测肝组织T淋巴细胞亚群以及Western blot检测肝损伤相关信号通路蛋白表达来探讨NASP基因突变导致肝损伤差异的作用机制。结果:（1）生存率:B6-NASPM组小鼠较B6-WT组小鼠生存率明显下降。（2）在急性肝损伤模型中,2组小鼠肝脏指数无明显差异。B6-NASPM组小鼠较B6-WT组小鼠肝脏病理损伤及肝细胞凋亡严重、血清TNF-α、IFN-γ水平升高明显、肝内TNF-α、IFN-γ的m RNA表达水平无明显变化。流式细胞术结果显示,B6-NASPM组小鼠较B6-WT组小鼠肝内白细胞数量无明显变化,T淋巴细胞比例和数量均下降、T淋巴细胞亚群(CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T、CD4+CD69+T、CD4+CD44hiT、CD4-CD8-T淋巴细胞)数量下降,CD4-CD8-T和CD4+CD44hiT淋巴细胞比例上升。Western blot检测结果显示,B6-NASPM组小鼠较B6-WT组小鼠的STAT1蛋白和p65蛋白的非磷酸化和磷酸化水平均显着提高,JNK蛋白非磷酸化水平升高、磷酸化水平无明显差异。（3）在慢性肝纤维化模型中,2组小鼠肝脏指数无明显差异。B6-NASPM组小鼠较B6-WT组小鼠的肝脏病理损伤及胶原纤维沉积严重、血清ALT和TNF-α水平升高明显、肝内α-SMA阳性表达增多、而肝内Ⅰ型胶原蛋白及Ⅲ型胶原蛋白的m RNA表达水平无明显变化。流式细胞术结果显示,NASPM组小鼠较B6-WT组小鼠肝内CD4+CD44hiT淋巴细胞亚群比例和数量明显下降,其他淋巴细胞亚群及数量均无明显变化。结论:（1）NASP基因突变加重ConA诱导的B6-WT小鼠的急性肝损伤和慢性肝纤维化。（2）NASP基因突变通过增加TNF-α和IFN-γ炎症因子释放、改变肝内T淋巴细胞亚群比例以及上调NF-κB（p65）、JAK-STAT1及JNK信号通路相关蛋白水平加重急性肝损伤。（3）NASP基因突变通过增加TNF-α炎症因子释放、改变肝内T淋巴细胞亚群比例以及促进肝星状细胞的活化加重慢性肝纤维化。
侯伊雪[7]（2020）在《外源线粒体纠正四氯化碳诱导的肝纤维化与治疗机制研究》文中认为肝纤维化可由多种致病因素（病毒、化学毒物、过度肥胖等）引起,是一种组织创伤愈合后发生的组织损伤,主要表现为肝内结缔组织异常增生。随着病情的持续发展,会进一步引起肝硬化,甚至肝癌,严重影响机体健康。肝纤维化过程中肝细胞出现广泛的线粒体损伤,表现为能量生成受阻、氧自由基大量释放、自噬功能改变、线粒体DNA受损等,这是引起肝功能障碍的重要因素。所以本课题尝试从纠正肝脏线粒体受损状态的角度出发,使用功能正常的线粒体替代原本功能缺陷线粒体,以恢复细胞内线粒体活性,改善肝组织功能。本研究使用化学毒物四氯化碳,模拟肝纤维化发展过程（四氯化碳能够攻击细胞膜,引起氧化应激损伤肝细胞,激活细胞外基质大量增生,导致肝纤维化的发生）。治疗药物由同种属健康小鼠肝脏中提取得到高纯度且具有良好活性的线粒体,在实验中把这种同种异体提取得到的线粒体称为外源线粒体。体外实验首先探究了外源线粒体进入肝细胞的方式。实验使用荧光染料标记外源线粒体以追踪其动态位置,发现使用大胞饮抑制剂阿米洛利处理肝细胞后,明显减少了肝细胞摄取外源线粒体的数量,因此判断外源线粒体进入肝细胞的途径可能是通过大胞饮的细胞胞吞方式进行的。接下来,为探究外源线粒体对损伤后的肝细胞的治疗效果,实验使用四氯化碳与肝细胞共孵育8 h诱导细胞损伤模型,向受损肝细胞补充功能正常的外源线粒体后,检测线粒体和细胞功能的恢复情况。结果表明,外源线粒体处理2-4 h且浓度在200-400 μg/mL之间对受损肝细胞具备明显的治疗效果,并且治疗效果存在浓度依赖性-随着线粒体浓度的提高对恢复细胞状态有正向调节作用;同时也发现外源线粒体的加入可以降低其培养液中谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）的水平并升高细胞内三磷酸腺苷（ATP）水平,证明外源线粒体可以减轻肝细胞损伤,恢复肝细胞内线粒体的生理功能。体内实验首先研究了外源线粒体通过尾静脉注射后在机体内部各组织器官的分布情况。通过向健康小鼠长期多次腹腔注射四氯化碳诱导小鼠肝纤维化模型,使用荧光染料标记的外源线粒体注入纤维化小鼠与正常小鼠体内,经2h体内分布后,检测外源线粒体在心、肺、肝、肾、脑中的分布情况。结果发现外源线粒体在肝脏组织中分布最多,且与非损伤正常肝脏相比,纤维化的肝脏中易获取更多外源线粒体。此外,实验还探究了短期单剂量补充外源线粒体后对受损肝脏内线粒体活性的影响。向肝纤维化小鼠体内注射外源线粒体2h后,检测肝脏中线粒体的膜电位与琥珀酸脱氢酶活性。发现与纤维化模型组相比,外源线粒体的加入显着提高了线粒体琥珀酸脱氢酶活性,轻微上调线粒体膜电位。上述结果提示线粒体疗法在减轻肝纤维化、恢复线粒体功能中具有可行性。为进一步探究外源线粒体在肝纤维化疾病中的治疗效果,实验使用外源线粒体对肝纤维化小鼠进行一周的干预性治疗。结果证明在额外补充功能性线粒体后,小鼠的肝脏系数降低,外源线粒体可能缓解了过度纤维沉积引起的肝淤血和肝水肿情况。并且,线粒体治疗后肝表面由粗糙逐渐向光滑转变,肝脏内部实质性细胞坏死减少、组织中炎性浸润降低、纤维化程度下降,肝脏形态得到了恢复。通过检测小鼠血液指标,发现线粒体治疗后,血清中ALT水平下降,说明小鼠肝损伤程度降低。通过检测小鼠肝组织匀浆液中相关指标,发现线粒体治疗后肝脏中超氧化物歧化酶（SOD）水平上升、活性氧（ROS）和羟脯氨酸（HYP）水平下降,说明外源线粒体提高了清除氧自由基的能力、减轻了肝脏纤维化程度。使用天狼星红对胶原纤维沉积进行特征性染色,进一步证明了外源线粒体在减轻肝纤维化进程中的发挥了良性作用。通过电子显微镜观察肝内超微结构,发现外源线粒体治疗后肝内线粒体含量明显增加、肿胀线粒体减少,说明外源线粒体改善了肝细胞内的线粒体的数量与状态。为深入探究外源线粒体在四氯化碳诱导的肝纤维化疾病中的治疗机制。实验通过对比疾病模型小鼠和线粒体治疗小鼠的肝脏中mRNA差异,分析GO与KEGG富集改变以及具体差异表达基因,发现氧化应激与细胞周期相关基因和信号通路在外源线粒体处理前后存在显着差异。因此,我们推测外源线粒体主要通过减轻肝脏氧化应激损伤、抑制肝星状细胞增殖这两个方面在肝纤维化的治疗中发挥作用。
谯明[8]（2020）在《转录—蛋白质组学的芹菜子抗肝纤维化物质基础及机制研究》文中指出目的:筛选芹菜子和芹菜根抗肝纤维化有效部位及单体活性成分;构建芹菜子活性成分-作用靶点网络和蛋白互作网络,初步预测芹菜子活性成分抗肝纤维化作用机制;阐明芹菜素对CCl4诱导的肝纤维化大鼠的影响及作用机制,为后续新药研发提供理论基础。方法:1)采用TGF-β1诱导HSC-LX2细胞活化,建立体外肝纤维化模型。通过检测细胞增殖、凋亡及肝纤维化指标含量比较芹菜子和芹菜根不同提取物及其萃取部位体外抗肝纤维化活性;2)通过检测HSC-LX2细胞增殖、凋亡及肝纤维化指标含量,观察芹菜子60%乙醇提取物的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水部位体外抗肝纤维化活性;采用GC-TOF-MS和UHPLC-MS/MS技术对芹菜子有效成分进行识别分析,共同考察芹菜子抗肝纤维化活性与有效成分之间的相关性;3)采用硅胶柱色谱、Sephadex LH-20、ODS和聚酰胺柱色谱等方法对芹菜子化学成分进行分离纯化,利用1H-NMR和13C-NMR鉴定化合物结构,并对所有单体化合物进行体外抗肝纤维化活性筛选;4)通过TCMSP数据库、文献挖掘和本实验室已有研究获取芹菜子活性成分,Swiss Target Prediction平台和BATMAN-TCM数据库获取成分靶点,Gene Cards和OMIM数据库预测和筛选肝纤维化的作用靶点。采用Cytoscape软件构建活性成分-作用靶点网络,String和Cytoscape软件绘制蛋白互作网络。采用DAVID对靶点进行GO功能富集分析及KEGG通路富集分析,结合相关文献分析芹菜子活性成分抗肝纤维化的作用机制;5)雄性Wistar大鼠适应性饲养1周后随机分为正常组、模型组、阳性对照组(复方鳖甲软肝片,0.60g·kg-1)及芹菜素高剂量组(0.60g·kg-1)、中剂量组(0.30g·kg-1)和低剂量组(0.15g·kg-1),每组15只。除正常组外,其余各组灌胃给予40%CCl4花生油溶液(1m L·kg-1),正常组给予相应体积花生油,每周2次,连续9周。从造模第5周起,给药组分别灌胃给予相应的受试药物,正常组和模型组给予等量溶媒,每天1次,连续5周。给药结束后收集大鼠血清和肝、脾组织,采用全自动生化仪检测大鼠血清ALT、AST、ALB、TP、ALP和LDH水平;试剂盒测定大鼠血清TB、DB、GSH-PX、Hyp、SOD和MDA水平;ELISA法检测大鼠血清中HA、LN、PCIII和IV-C含量;HE和Masson染色观察肝脏病理组织学变化;免疫组化法测定肝组织中TGF-β1和COL-I蛋白的表达;6)采用转录组学和蛋白质组学方法筛选大鼠肝组织中差异表达的基因和蛋白质,对差异表达的基因和蛋白质进行生物信息学分析。整合转录组学和蛋白质组学分析结果,对差异m RNA-protein进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,并采用q RT-PCR和Western blot对富集程度高的靶蛋白进行验证,进一步阐明芹菜素抗肝纤维化的作用机制。结果:1)芹菜子60%乙醇提取物和芹菜根95%乙醇提取物及其石油醚部位可有效抑制HSC-LX2细胞活化,降低LN、HA和PCIII的含量,促进细胞凋亡,其中芹菜子60%乙醇提取物石油醚部位体外抗肝纤维化作用最强,故将芹菜子作为后续研究对象;2)芹菜子60%乙醇提取物的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水部位高剂量对HSC-LX2细胞增殖抑制率分别为75.14%、73.52%、54.09%和43.36%,细胞凋亡率分别为37.5%、4.3%、0.7%和0.1%,石油醚部位细胞上清液中肝纤维化指标含量更接近于正常组。石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水部位中共鉴定识别出122个化学成分,石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水部位体外抗肝纤维化活性呈现由强到弱的趋势,与所含芹菜素、芹菜甲素、秦皮乙素及其含量呈正相关;3)从芹菜子中共分离鉴定了9个单体化合物,分别为芹菜素、佛手柑内酯、芹菜苷、芦丁、山柰酚、木犀草素、槲皮素、大叶茜草素和芹菜甲素。芹菜素、芹菜苷、芦丁、山柰酚、槲皮素和芹菜甲素对HSC-LX2细胞增殖抑制率分别为71.32%、30.87%、15.81%、22.02%、48.28%和61.93%;4)筛选得到芹菜子17个活性成分,其中apigenin、aesculetin和3-n-butylphthalide具有较多的作用靶点,可能在芹菜子的药理作用中起到较为核心的作用。芹菜子活性成分作用的69个靶点主要涉及collagen catabolic,inflammatory response和negative regulation of cholesterol storage等生物过程,通过调节TGF-β,NF-κB和PI3K/AKT等信号通路来发挥抗肝纤维化作用;5)与模型组相比,芹菜素各剂量组大鼠血清肝纤维化四项指标HA、LN、PCIII和IV-C含量均显着降低（P<0.05）;血清肝功能指标AST、ALT、ALP、MDA、LDH、Hyp、TP、TB和DB水平显着下降（P<0.05）,ALB、SOD和GSH-PX水平显着升高（P<0.05）;大鼠的肝脾指数明显降低（P<0.05）。病理组织学及免疫组化结果显示,芹菜素低、中、高剂量组大鼠肝纤维化及炎性程度逐渐减轻;6)通过转录组学分析,芹菜素组中有161个基因上调,891个基因下调,涉及的信号通路主要包括Cytokine-cytokine receptor interaction,PPAR signaling pathway,Focal adhesion和Cell adhesion molecules。通过蛋白质组学分析,芹菜素组中正调控蛋白207个,负调控蛋白332个,涉及的信号通路主要包括HIF-1/VEGF/MAPK signaling pathway,Focal adhesion和ECM-receptor interaction。转录组学和蛋白质组学数据整合分析结果显示,芹菜素可能通过HIF-1/MAPK/e NOS/VEGF/PI3K/AKT signaling pathway,Focal adhesion和Regulation of actin cytoskeleton发挥抗肝纤维化作用。q RT-PCR和Western blot验证实验结果显示,大鼠肝组织中TGF-β1、α-SMA、HIF-1α、VEGF、i NOs、FAK和p38 MAPK m RNA和蛋白表达受到抑制,肝组织炎症及纤维化程度明显减轻。结论:1)从芹菜子中分离得到9个化合物,其中佛手柑内酯和大叶茜草素为首次从芹菜子中分离得到,大叶茜草素为首次从该属植物中分离得到。芹菜子有效成分识别分析结合单体化合物体外药效实验,确定了芹菜素、芹菜甲素和秦皮乙素是芹菜子抗肝纤维化的主要活性成分,其中芹菜素生物活性最强;2)网络药理学初步预测了芹菜子活性成分抗肝纤维化主要涉及的生物过程和信号通路,体现了芹菜子“多成分-多靶点-多途径”的作用特点,为进一步开展芹菜子活性成分抗肝纤维化作用的药理学研究提供了新思路和新方法;3)转录组学和蛋白质组学联合分析,从整体水平探讨了芹菜素抗肝纤维化作用机制,建立了“多靶点-多通路”复杂网络关系,从系统层面探析芹菜素抗肝纤维化机制为通过TGF-β、HIF-1、MAPKs、PI3K/AKT、e NOS和VEGF介导的FAK磷酸化途径来改善CCl4诱导的大鼠肝纤维化。
杜佳佳[9]（2020）在《Epac1在肝星状细胞表型转化中的作用及CP-25对其的影响》文中认为肝纤维化是由于长期受到损伤因子刺激后,细胞外基质（extracellular matrix,ECM）过度沉积,导致结缔组织异常增生的过程。肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）是ECM的主要来源。正常情况下,HSC作为储存维生素A的细胞在窦周间隙保持静止,但在损伤情况下,HSC转化为肌成纤维细胞,释放细胞因子,促进ECM的生成,这一过程称之为表型转化。c AMP直接激活的交换蛋白分子（exchange protein activated by c AMP,Epac）参与体内许多重要的信号通路,从而介导生物学效应。Epac1被激活时,Rap1（Ras-related protein-1）从无活性的Rap1-GDP置换为有活性的Rap1-GTP,进而激发下游信号通路发挥作用。然而,Epac1在HSC表型转化中的作用尚不清楚。白芍总苷（total glucosides of paeony,TGP）是从芍药干燥根中提取的有效部位,其主要活性成分为芍药苷（paeoniflorin,Pae）。芍药苷-6’-O-苯磺酸酯（paeoniflorin-6’-O-benzene sulfonate,CP-25）是对Pae进行酯化修饰合成的新的单体衍生物,能有效提高Pae的生物利用度。课题组前期研究表明,在CCl4诱导的肝纤维化小鼠模型中,CP-25具有良好的抗纤维化作用,100 mg/kg的CP-25与同剂量的TGP相比,抗纤维化能力更强。CP-25的抗纤维化作用是否与影响Epac1活性有关?为此,本课题收集肝纤维化患者肝组织标本,观察Epac1表达变化;使用CCl4诱导C57BL/6J小鼠建立肝纤维化模型,观察不同病程整体水平Epac1表达变化;同时,对CCl4诱导的肝纤维化小鼠灌胃给予CP-25,观察CP-25对Epac1的表达及纤维化的调节作用。体外实验选用人肝星状细胞株LX-2,选择性激动或抑制Epac1,观察其对LX-2细胞活化和下游相关通路的影响;以转化生长因子β1（transforming growth factor beta 1,TGF-β1）刺激,建立体外纤维化模型,转染针对Epac1的小干扰RNA,检测细胞活化及下游相关信号通路的变化;另给予不同浓度的CP-25,探讨其可能的作用机制。目的:收集肝纤维化患者肝脏样本,检测α-SMA和Epac1表达变化。CCl4诱导C57BL/6J小鼠建立肝纤维化模型,同时灌胃CP-25,观察Epac1表达变化。体外采用刺激剂和小干扰RNA选择性激动或抑制Epac1,并给予CP-25,观察对LX-2细胞活化及下游相关信号通路的影响。明确Epac1在HSC表型转化中的可能作用,部分阐明CP-25抗肝纤维化的作用机制。方法:选取肝纤维化患者肝组织石蜡切片,免疫荧光法检测α-SMA和Epac1表达变化。采用CCl4诱导C57BL/6J小鼠建立肝纤维化模型,Western blot法检测肝脏胞质、胞膜中Epac1蛋白表达变化,同时免疫荧光双染法检测小鼠肝脏中α-SMA和Epac1的共定位。另外将小鼠分为正常组、模型组、CP-25组（25、50、100 mg/kg）、TGP组（100 mg/kg）,Western blot及免疫组化检测肝组织中α-SMA、III型胶原、Epac1、p-AKT、p-ERK表达变化体外实验中,选择性激动或抑制Epac1后,采用CCK-8法、细胞划痕法观察对LX-2细胞增殖、迁移的影响;Western blot检测α-SMA、III型胶原、I型胶原表达及AKT、ERK通路激活情况,Pull-down检测Rap1-GTP水平。进一步检测转染Epac1 si RNA,对LX-2细胞中α-SMA、III型胶原蛋白、下游信号通路及Rap1-GTP水平的影响。体外给予CP-25,Western blot观察LX-2细胞中α-SMA、III型胶原及AKT、ERK通路激活情况,Pull-down检测Rap1-GTP水平变化。结果:1. 肝纤维化患者HSC中Epac1的表达情况免疫荧光双染实验结果表明,在肝纤维化患者肝脏中活化的HSC标志物α-SMA的表达明显多于肝内胆管结石患者,同时,在肝纤维化患者肝脏中Epac1的表达也明显高于肝内胆管结石患者。2. 肝纤维化小鼠肝脏中Epac1和?-SMA表达变化免疫荧光双染实验结果表明,CCl4造模8周后,小鼠肝脏α-SMA表达多于正常组小鼠,且肝脏中Epac1表达也增多。3. 不同病程肝纤维化小鼠肝脏中Epac1表达变化Western blot结果显示,在CCl4诱导的肝纤维化小鼠肝脏组织中,从造模4周开始,胞质中Epac1蛋白的表达明显降低,而胞膜中Epac1的表达明显升高。4. 选择性激动或抑制Epac1对细胞活化及下游信号通路的影响CCK-8、划痕实验结果显示,与对照组相比,非选择性激动Epac（8-p CPT）或选择性抑制Epac2（ESI-05）均可明显促进LX-2细胞的增殖和迁移;与8-p CPT组比较,选择性抑制Epac1（CE3F4）可以明显抑制LX-2细胞的增殖和迁移。Western blot实验结果表明,与对照组相比,8-p CPT或ESI-05增加LX-2细胞中?-SMA、I、III型胶原、p-ERK、p-AKT的表达;与8-p CPT组比较,CE3F4可降低LX-2细胞中?-SMA、I、III型胶原、p-ERK、p-AKT的表达。Pull-down实验结果显示,8-p CPT或ESI-05增加LX-2细胞中Rap1-GTP的表达;与8-p CPT组比较,CE3F4可降低Rap1-GTP的表达。5. 转染Epac1 si RNA对LX-2细胞中纤维化指标及下游通路相关蛋白表达的影响Western blot实验结果提示,与对照组比较,TGF-?1刺激后LX-2中?-SMA、III型胶原、p-ERK、p-AKT的表达明显升高;与TGF-?1刺激组相比,干扰Epac1的表达可明显降低细胞中?-SMA、III型胶原、p-ERK、p-AKT的表达。Pull down实验结果显示,与对照组比较,TGF-?1明显增加LX-2细胞中Rap1-GTP的水平;与TGF-?1刺激组相比,干扰Epac1明显抑制细胞中Rap1-GTP水平。6. CP-25对诱导的肝纤维化小鼠的影响HE、Masson染色结果显示,与肝纤维化模型组相比,CP-25可以降低胶原沉积,减轻肝纤维化程度。Western blot结果表明,与肝纤维化模型组相比,CP-25可以降低?-SMA、III型胶原的表达。免疫组化和Western blot结果表明,CP-25可以降低Epac1的表达。7. CP-25对LX-2细胞纤维化指标及下游信号通路相关蛋白表达的影响Western blot结果表明,与TGF-?1刺激组相比,CP-25 10-7～10-5 mol/L可以抑制LX-2细胞中?-SMA、III型胶原、p-ERK、p-AKT的产生。Pull down结果显示,与TGF-?1刺激组比较,CP-25 10-5 mol/L明显抑制LX-2细胞中Rap1-GTP的水平。结论:1.肝纤维化患者及肝纤维化小鼠肝组织中HSC激活增多发生表型转化,且HSC中Epac1的表达增加。肝纤维化过程中,Epac1的细胞分布发生变化,提示Epac1可能与肝纤维化发生发展有关。2.选择性激动Epac1可以促进LX-2细胞的增殖和迁移,增加?-SMA、III型胶原、I型胶原的表达,升高Rap1-GTP的水平,增加p-ERK、p-AKT的表达。提示选择性激动Epac1可能通过促进Rap1的活化,进而激活ERK、AKT通路参与HSC表型转化。3.体外向LX-2细胞转染Epac1 si RNA可以降低?-SMA、III型胶原的表达,降低Rap1-GTP的水平,降低p-ERK、p-AKT的表达。提示低表达Epac1可能通过抑制HSC下游Rap1的活化,随后抑制ERK、AKT信号的激活,发挥抑制HSC活化和胶原合成的作用。4.CP-25灌胃给药可减轻肝纤维化程度,降低Epac1的表达。体外给予CP-25,可抑制LX-2细胞中?-SMA、III型胶原的生成、降低Rap1-GTP的水平及p-AKT、p-ERK的表达。提示CP-25可能通过降低Epac1及下游Rap1的活化,进而抑制AKT、ERK信号的激活来发挥抗肝纤维化作用。
谢诗怡[10]（2020）在《八宝丹对胆汁淤积小鼠肝脏的保护作用及机制研究》文中指出研究背景胆汁淤积指肝内外各种原因造成胆汁形成和（或）排泄障碍,反流入血液的所引起一系列临床症状及肝损伤的临床综合症,可进展为肝纤维化、肝硬化甚至肝衰竭。根据胆汁淤积的发生部位可将其分为肝内和肝外胆汁淤积两大类,肝内胆汁淤积疾病主要有病毒性肝炎、酒精或非酒精性脂肪性肝炎、药物性肝损伤、妊娠肝内胆汁淤积、各种病因导致肝硬化、原发性胆汁性肝硬化/原发性硬化性胆管炎、原发性硬化性胆管炎及合并自身免疫性肝炎、药物性胆管病等;肝外胆汁淤积主要疾病和病因有胆管结石、先天性肝外胆管闭锁、胆总管/Oddi括约肌狭窄、胆管寄生虫病、胆总管囊肿、胆管及周围组织肿瘤压迫、胰腺癌、胰腺囊肿和慢性胰腺炎等。胆汁淤积使引起毒性胆汁代谢物质蓄积于肝内,出现胆汁淤积性病变,在多种细胞因子持续刺激下,肝实质细胞进一步受损,可发展为肝组织纤维化。肝纤维化主要病理改变为肝组织内细胞外基质的过度沉积,炎症反应是其重要机制之,在炎症因子作用下,纤维化介质与肝星状细胞膜上受体结合,实现肝星状细胞活化、增殖、转型,促进胶原、糖蛋白的合成,从而重构细胞外基质,导致肝纤维化,各种纤维化介质对细胞外基质的代谢有重要的调节作用,尤其是转化生长因子β1（transforming growth factor β1,TGF—β1）、肿瘤坏死因子-α、血小板源生长因子以及IL-6等,在促进细胞的增殖、迁移和转化过程中起重要作用,同时激活的肝星状细胞释放活性氧类物质而反过来继续激活肝星状细胞以促进纤维化的发展。TGF—β1被认为是最强的促肝纤维化因子,在促肝纤维化中占关键地位,其纤维化作用为对细胞外基质的形成产生一定的刺激作用,降低细胞外基质蛋白酶的活化,胶原酶的活性,减少其降解,使成纤维细胞发生趋化作用,从而促进诱发组织器官逐渐发生纤维化,目前研究认为,TGF—β1主要通过TGF/Smad信号转导通路来发挥促纤维化的作用。Smads蛋白是目前所知的唯一TGF-β受体的胞内激酶底物,是TGF-β信号跨细胞膜传入细胞核内的关键下游蛋白,调节核内靶基因的转录,从而发挥TGF-β1的生物效应。八宝丹是我国治疗肝胆系疾病的重要中成药,具有清利湿热,活血解毒,去黄止痛的功效,近年来已有多项研究发现,八宝丹可保护肝脏细胞,降低血清肝功能、肝纤维化指标水平,改善黄疽,且不良反应较少,在临床上广泛应用于防治传染性病毒性肝炎、肝硬化等肝胆系疾病。进一步研究发现八宝丹可以改善肝纤维化大鼠的炎症反应及变性坏死,逆转肝纤维化,其抗纤维化机制尚未明确,是否通过影响转化生长因子β1实现肝纤维的逆转尚未有研究。Masson染色法利用胶原纤维含有碱性氨基酸,能与酸性染料进行结合而着色的特点对胶原纤维着色,光镜下胶原纤维呈亮蓝色或绿色,已有学者发现在Masson染色的作用下,慢性肝炎患者肝组织汇管区周围的Ⅰ型胶原蛋白比HE染色可更清晰的显示,进一步准确展示出慢性肝炎发展至肝纤维化的进程,可直观判定肝纤维化程度与范围。目前认为,肝脏纤维化主要与Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维有关,运用苦味酸-天狼星红染色法（Picric Sirius red,PSR）,在偏振光法显微镜下能够在一张切片上对不同类型的胶原纤维定性及定量诊断,明确胶原纤维的种类及分布,可早期及时诊断肝组织纤维化病理状态,如:Ⅰ型胶原表现为橘黄色或红色,镜下可见其纤维排列紧密,具有很强的双折光性;Ⅲ型胶原纤维为绿色的细纤维,为疏松网状结构,具有较弱的双折光性。作为常用的两种方法,其在评价肝脏纤维化方面的比较尚未见报道。故本研究以ANIT诱导小鼠建立胆汁淤积性肝病模型,应用上述两种不同的染色方法观察胶原沉积情况,初步比较苦味酸-天狼猩红染色法和Masson染色法两种方法在评价肝纤维化中的应用价值,并以八宝丹治疗,探讨其对胆汁淤积症小鼠的保护作用,通过免疫组织化学、RT-PCR研究TGF/Smad在小鼠肝组织中的表达情况,探讨八宝丹对TGF/Smad信号转导通路的影响,阐明其作用机制。目的观察八宝丹对胆汁淤积小鼠肝脏的保护作用及探讨其可能机制,为八宝丹治疗胆汁淤积性肝病提供理论依据。方法将15只昆明种雄性小鼠随机分为3组:空白对照组、胆汁淤积组、八宝丹治疗组,每组5只。除空白对照组小鼠外,其余两组小鼠均一次性予灌胃1%α—萘异硫氰酸酯（α-Naphthyl isothiocyanate,ANIT）橄榄油溶液,按照 100mg/Kg剂量建立胆汁淤积模型。空白对照组每日予生理盐水灌胃1次,胆汁淤积组每日予生理盐水灌胃1次,八宝丹治疗组每日予八宝丹生理盐水混悬液灌胃1次。给药10d后麻醉后取血及肝组织。检测各组小鼠血清中总胆汁酸（total bile acids,TBA）、总胆红素（total bilirubin,TBil）、直接胆红素（direct bilirubin,DBil）、谷氨酸氨基转移酶（alanine transaminase,ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate transaminase,AST）、碱性怜酸酶（alkaline phosphatase,ALP）、谷氨酰转肽酶（丫-glutamyl transpeptidase,GGT）、白蛋白（albumin,ALB）、透明质酸（hyaluronic acid,HA）,层粘连蛋白（laminin,LN）,Ⅲ型前胶原（type Ⅲ procollagen,PC-Ⅲ）,Ⅳ型胶原（type Ⅳ collagen,C-Ⅳ）水平。肝组织采用苏木素-伊红染色（Hematoxylin and eosin,HE染色）、Masoon染色、苦味酸-天狼星红染色法观察其病理形态学改变;免疫组织化学法检测肝组织TGF-β1、Smad3蛋白表达;RT-PCR 检测肝组织 TGF-β1、Smad3 mRNA 表达。结果血清学指标（1）肝功能指标:空白对照组、胆汁淤积组、八宝丹治疗组相比:ALT（42.44±4.93vs400.33±65.49 vs 144.16±38.66）、AST（171.09±22.30 vs 656.95±118.17 vs 315.81±75.65）、TBIL（6.31±0.91 vs 53.12±7.51vs 19.42±1.81）、DBIL（4.54±0.86 vs 48.49±7.08 vs 14.26±2.07）、ALP（158.82±39.18 vs 953.64±282.86 vs 535.99±131.42）、GGT（29.58±3.49 vs 159.49±24.78 vs 81.53±13.59）、TBA（39.01±3.05vs 339.47±167.73 vs 238.28±103.87）,各组间差异有统计学意义,P<0.01;ALB（30.77±2.24 vs 22.47±2.03 vs 25.14±2.38）,空白对照组与胆汁淤积组之间有统计学差异P<0.01,八宝丹治疗组与胆汁淤积组之间无统计学差异,P>0.01。（2）肝纤维化指标:空白对照组、胆汁淤积组、八宝丹治疗组相比:HA（302.16±45.95vs 644.21±71.69 vs 443.79±47.06）、LN（135.13±49.31vs417.55±37.76 vs224.33±48.61）、PC-Ⅲ（12.15±1.87vs 24.94±2.02vs 16.15±1.03）、C-Ⅳ（37.12±2.00 vs74.98±4.34vs 54.92±4.44）,各组间差异有统计学意义,P<0.01。肝脏组织学（1）HE染色:空白对照组肝组织结构基本正常,肝细胞呈整齐排列;胆汁淤积组肝细胞大面积坏死,肝小叶结构大多破坏。八宝丹治疗组肝细胞形态结构较清晰,肝损伤明显改善,肝坏死面积减少。（2）Masoon染色:空白对照组可见少量胶原纤维。胆汁淤积组肝组织内大量蓝色胶原纤维沉积,已形成假小叶。八宝丹治疗组胶原纤维介于空白对照组及胆汁淤积组之间。空白对照组、胆汁淤积组、八宝丹治疗组纤维化面积（6.18±0.98vs39.37±3.89vs25.65±2.24）,各组间差异有统计学意义,P<0.01。（3）苦味酸-天狼星红染色:空白对照组小鼠肝组织少量Ⅰ、Ⅲ型胶原显色。胆汁淤积组:肝组织中可见明显增多的橘红色Ⅰ型胶原粗纤维,形成小叶间分隔,Ⅲ型胶原增多。八宝丹治疗组主要为绿色细丝纤维的Ⅲ型胶原增多,Ⅰ型胶原较胆汁淤积组少。空白对照组、胆汁淤积组、八宝丹治疗组纤维化面积（5.56±0.61vs38.21±3.28vs20.65±2.01）,各组间差异有统计学意义,P<0.01。免疫组化结果显示TGF—β1、Smad3蛋白在空白对照组肝组织中基本无阳性表达,胆汁淤积组表达显着增强,八宝丹治疗组阳性颗粒明显减少,染色程度减轻。空白对照组、胆汁淤积组、八宝丹治疗组相比:TGF—β1蛋白（0.95±0.21 vs6.52±1.01vs4.17±0.72）;Smad3 蛋白（1.05±0.52vs6.89±1.29vs4.85±0.93）,各组间差异有统计学意义（P<0.01）。RT-PCR结果显示TGF—β1、Smad3 mRNA在空白对照组肝组织表达较少,胆汁淤积组表达显着增多,八宝丹治疗组表达升高。空白对照组、胆汁淤积组、八宝丹治疗组相比:TGF—β1 mRNA（0.44±0.05vs1.00±0.06vs0.66±0.02）;Smad3 mRNA（0.63±0.04vs0.93±0.05vs0.79±0.03）,各组间差异有统计学意义（P<0.01）。结论1.八宝丹可以降低ANIT诱导的胆汁淤积肝病小鼠血清中肝功能（TBA、TBil、DBil、ALT、AST、ALP、GGT）、肝纤维化指标（HA、LN、PC-Ⅲ C-Ⅳ）水平,减轻肝细胞病变及坏死,对胆汁淤积症有积极的治疗作用;减少肝胶原纤维沉积,预防肝纤维化。2.八宝丹可显着抑制的TGF—β1、Smad3 mRNA及蛋白的表达,抑制TGF-β1/Smad信号通路激活,与八宝丹的护肝作用有关。3.采用组织学染色法与HE染色评价肝纤维化程度,可同时明确当前肝脏损伤情况及肝纤维化程度。对比Masson染色法,苦味酸-天狼猩红染色对胶原纤维有更好的特异性,结果明显,利于分型,是一种较好的胶原纤维染色方法,具有更大的优势。
二、细胞因子对细胞外基质在肝内沉积的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、细胞因子对细胞外基质在肝内沉积的影响（论文提纲范文）
（1）基于肝窦内皮细胞微尺度生物力学性质研究芪术颗粒抗肝纤维化机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 中医药学治疗肝纤维化的研究进展 |
| 综述二 现代医学对肝纤维化的研究进展 |
| 综述三 益气活血法对肝窦内皮细胞细胞生物学影响的研究 |
| 参考文献 |
| 第二部分 基于益气活血法治疗肝纤维化临床疗效的Meta分析 |
| 前言 |
| 资料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 实验研究 |
| 前言 |
| 实验一 芪术颗粒对肝纤维化模型大鼠的影响研究 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 结论 |
| 实验二 大鼠肝窦内皮细胞的原代分离与提取 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 实验三 芪术颗粒含药血清对肝窦内皮细胞胞内一氧化氮合成酶、一氧化氮的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 结论 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验四 芪术颗粒含药血清对肝窦内皮细胞微尺度生物力学性质影响的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 结论 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 创新性 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 附件 |
| 中医药科技查新报告书 |
（2）miR-876调控POSTN促进肝癌进展和纤维化的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 HCC中抑癌miR-876从TCGA数据库的筛选鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 miR-876在HCC细胞及组织中低表达 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 miR-876 的异常表达和HCC进展及纤维化相关 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 miR-876 抑制HCC的 EMT及纤维化 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 miR-876 靶向调控POSTN |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 miR-876 通过POSTN抑制HCC的 EMT及纤维化 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.2 结果 |
| 7.3 讨论 |
| 7.4 小结 |
| 第八章 POSTN高表达和HCC组织EMT及肝硬化相关 |
| 8.1 材料与方法 |
| 8.2 结果 |
| 8.3 讨论 |
| 8.4 小结 |
| 第九章 miR-876及POSTN的异常表达和HCC预后相关 |
| 9.1 材料与方法 |
| 9.2 结果 |
| 9.3 讨论 |
| 9.4 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 骨膜蛋白(POSTN)的结构功能及其在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（3）基于核受体探讨人参皂苷25-OCH3-PPD和M4调控肝纤维化的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词语注释表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 肝纤维化的形成 |
| 1.2 肝纤维化的诱因 |
| 1.2.1 酒精性肝损伤 |
| 1.2.2 非酒精性脂肪性肝损伤 |
| 1.2.3 病毒性肝炎 |
| 1.3 多种病理机制参与肝纤维化进程 |
| 1.3.1 肝内巨噬细胞活化影响肝纤维化进程 |
| 1.3.2 氧化应激加速肝纤维化进程 |
| 1.3.3 肝脏炎症加速肝纤维化进程 |
| 1.4 调控肝纤维化的信号转导途径 |
| 1.4.1 FXR在肝纤维化进程中的作用 |
| 1.4.2 LXRs在肝纤维化进程中的作用 |
| 1.4.3 TGF-β信号通路在肝纤维化进程中的作用 |
| 1.4.4 P2X7r-NLRP3信号通路在肝纤维化进程中的作用 |
| 1.4.5 PI3K-Akt信号通路在肝纤维化进程中的作用 |
| 1.5 .肝纤维化治疗药物研究 |
| 1.5.1 中药治疗肝纤维化 |
| 1.5.2 西药治疗肝纤维化 |
| 1.6 人参的肝保护作用 |
| 1.7 本课题研究思路 |
| 第二章 人参皂苷25-OCH_3-PPD促进LXRs的活性改善P2X7r介导的NLRP3炎症小体在肝纤维化进程中的作用 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 动物给药方案 |
| 2.2.4 细胞培养与药物处理 |
| 2.2.5 血清生化分析 |
| 2.2.6 组织石蜡包埋 |
| 2.2.7 H&E染色 |
| 2.2.8 Masson三色胶原染色 |
| 2.2.9 Sirius Red染色 |
| 2.2.10 免疫荧光染色 |
| 2.2.11 免疫组织化学染色 |
| 2.2.12 TUNEL检测 |
| 2.2.13 蛋白印迹实验 |
| 2.2.14 RT-PCR实验分析 |
| 2.2.15 统计学处理 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 25-OCH_3-PPD改善TAA诱导的肝损伤 |
| 2.3.2 25-OCH_3-PPD减弱与肝星状细胞激活相关的促纤维化细胞因子的转录 |
| 2.3.3 25-OCH_3-PPD可降低肝组织中炎症因子水平 |
| 2.3.4 25-OCH_3-PPD抑制P2X7r调节NLRP3炎症小体 |
| 2.3.5 25-OCH_3-PPD调节PI3K/Akt磷酸化改善TAA诱导的肝纤维化 |
| 2.3.6 25-OCH_3-PPD调节LKB1/AMPK-SIRT1信号通路改善TAA诱导的肝纤维化 |
| 2.3.7 25-OCH_3-PPD促进LXRs和FXR活性改善TAA诱导的肝纤维化 |
| 2.3.8 25-OCH_3-PPD阻断TAA诱导的小鼠肝细胞凋亡 |
| 2.3.9 25-OCH_3-PPD通过调节P2X7r-NLRP3抑制肝星状细胞的活化 |
| 2.3.10 25-OCH_3-PPD调节活化的肝星状细胞中LXRs与磷酸化PI3K/Akt的表达 |
| 2.3.11 抑制活化的HSCs中炎症因子表达是25-OCH_3-PPD改善肝纤维的关键 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 20S-原人参三醇通过调FXR-P2X7r信号通路改善肝纤维化进程的研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 实验仪器 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 动物给药方案 |
| 3.2.4 细胞存活率 |
| 3.2.5 细胞培养与药物处理 |
| 3.2.6 血清生化分析 |
| 3.2.7 组织石蜡包埋 |
| 3.2.8 H&E染色 |
| 3.2.9 免疫荧光染色 |
| 3.2.10 蛋白印迹实验 |
| 3.2.11 RT-PCR实验分析 |
| 3.2.12 统计学处理 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 M4能够抑制肝星状细胞的活性与增殖 |
| 3.3.2 M4调节活化HSC中ECM的平衡 |
| 3.3.3 M4增加活化的HSC中FXR的表达并与P2X7r抑制有关 |
| 3.3.4 M4抑制活化的HSC中促炎细胞因子的表达 |
| 3.3.5 FXR是M4阻断P2X7r进一步改善肝纤维化和炎症的重要靶点 |
| 3.3.6 M4改善TAA诱导小鼠肝损伤 |
| 3.3.7 M4对TAA诱导小鼠肝纤维化的改善作用 |
| 3.3.8 M4通过FXR/P2X7r信号通路改善TAA诱导的肝纤维化 |
| 3.3.9 M4降低TAA诱导的小鼠肝纤维化肝脏中促炎细胞因子水平 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 1 发表论文目录 |
| 致谢 |
（4）纤维连接蛋白额外结构域A促进肝纤维化及血管异常增生的作用与机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 引言 |
| 第一部分 星状细胞上的FN-EDA促进了肝纤维化及血管异常增生 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 肝纤维化中FN-EDA通过整合素激活VEGFR2促进血管异常增生 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 FN-EDA阻断剂Irigenin抑制了小鼠肝纤维化及血管增生 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 血管异常增生在肝纤维化发生、发展和治疗中的作用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文 1 |
| 外文论文 2 |
（5）七叶皂苷钠通过PI3K/AKT/mTOR通路抑制eIF4F复合物进而缓解大鼠肝纤维化（论文提纲范文）
| 缩略词表(Abbreviation) |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 6.参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 肝纤维化的影响因素及肝星状细胞的激活 |
| 参考文献 |
（6）核自身抗原精子蛋白NASP基因突变对ConA诱导的小鼠肝损伤的影响及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 文献综述 肝纤维化免疫机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间撰写的论文 |
（7）外源线粒体纠正四氯化碳诱导的肝纤维化与治疗机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 肝纤维化疾病背景 |
| 1.1.1 肝纤维化的疾病表型 |
| 1.1.2 临床肝纤维化诊断方式 |
| 1.1.3 肝纤维化微环境变化 |
| 1.2 肝纤维化的治疗方法 |
| 1.2.1 病因治疗 |
| 1.2.2 保护肝功能 |
| 1.2.3 抗氧化、抑制炎症反应 |
| 1.2.4 抑制肝星状细胞活化与增殖 |
| 1.2.5 降解细胞外基质 |
| 1.3 结论 |
| 第二章 前言 |
| 2.1 研究背景及实验依据 |
| 2.2 研究内容 |
| 2.2.1 外源线粒体在CCl_4诱导的肝细胞损伤中的治疗效果研究 |
| 2.2.2 外源线粒体在CCl_4诱导的肝纤维化小鼠中组织分布研究 |
| 2.2.3 外源线粒体在CCl_4诱导的肝纤维化小鼠中的药效学分析 |
| 2.3 创新点 |
| 第三章 外源线粒体在CCl_4诱导的肝细胞损伤中的治疗效果研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 主要设备 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 实验细胞与动物 |
| 3.2 溶液的配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 肝细胞的培养、传代与冻存 |
| 3.3.2 荧光线粒体的制备 |
| 3.3.3 肝细胞摄取线粒体机制研究 |
| 3.3.4 外源线粒体对损伤后肝细胞细胞活力的影响 |
| 3.3.5 外源线粒体对损伤后肝细胞ALT、AST与ATP活性的影响 |
| 3.3.6 统计学分析 |
| 3.4 实验结果与讨论 |
| 3.4.1 线粒体的表征 |
| 3.4.2 肝细胞摄取外源线粒体的机制 |
| 3.4.3 外源线粒体提高细胞活性 |
| 3.4.4 外源线粒体修复肝细胞损伤 |
| 3.4.5 外源线粒体增加细胞的能量代谢 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 外源线粒体在CCl_4诱导的肝纤维化小鼠中组织分布研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 主要设备 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 实验动物 |
| 4.2 溶液的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 建立肝纤维化动物模型 |
| 4.3.2 模型评价 |
| 4.3.3 外源线粒体在小鼠各组织的分布情况 |
| 4.3.4 不同组织的细胞中获取外源线粒体数量的差别 |
| 4.3.5 外源线粒体对肝细胞内线粒体活性的影响 |
| 4.3.6 统计学分析 |
| 4.4 实验结果与讨论 |
| 4.4.1 肝纤维化小鼠模型的建立 |
| 4.4.2 模型评价 |
| 4.4.3 外源线粒体在小鼠各组织的分布情况 |
| 4.4.4 不同组织的细胞内获取外源线粒体数量的差别 |
| 4.4.5 外源线粒体提高肝细胞内线粒体活性 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 外源线粒体在CCl_4诱导的肝纤维化小鼠中的药效学分析 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 主要设备 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 数据库介绍 |
| 5.1.4 实验动物 |
| 5.2 溶液的配制 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 动物分组及给药 |
| 5.3.2 样本的获取与称重 |
| 5.3.3 血清ALT和AST测定 |
| 5.3.4 肝组织SOD、ROS与HYP测定 |
| 5.3.5 肝组织HE染色 |
| 5.3.6 肝组织天狼星红染色 |
| 5.3.7 肝组织透射电镜观察 |
| 5.3.8 转录组学分析 |
| 5.3.9 统计学分析 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 脏器系数改变 |
| 5.4.2 肝脏形态学变化 |
| 5.4.3 外源线粒体减轻肝脏损伤 |
| 5.4.4 外源线粒体激活肝脏抗氧化能力 |
| 5.4.5 外源线粒体抑制肝脏胶原纤维蛋白合成 |
| 5.4.6 外源线粒体减少肝内胶原沉积 |
| 5.4.7 肝内线粒体状态观察 |
| 5.4.8 转录组学-表达差异分析 |
| 5.4.9 转录组学-GO富集分析 |
| 5.4.10 转录组学-KEGG富集分析 |
| 5.4.11 转录组学-基因调控网络 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 结语 |
| 参考文献 |
| 缩略词说明 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文 |
（8）转录—蛋白质组学的芹菜子抗肝纤维化物质基础及机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 芹菜子和芹菜根抗肝纤维化物质基础研究 |
| 实验一 芹菜子和芹菜根不同提取物及萃取部位体外抗肝纤维化活性筛选 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 仪器与试药 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 实验二 基于GC-TOF-MS和 UHPLC-MS/MS的芹菜子化学成分及抗肝纤维化活性相关性研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 仪器与试药 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 实验三 芹菜子单体化合物的分离纯化及其体外抗肝纤维化活性 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 仪器与试药 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 基于网络药理学的芹菜子活性成分抗肝纤维化作用机制预测 |
| 1 研究内容与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 芹菜素对CCl_4诱导的肝纤维化大鼠的保护作用 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 仪器与试药 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四部分 基于转录组学和蛋白质组学的芹菜素抗肝纤维化作用机制研究 |
| 实验一 基于转录组学的芹菜素抗肝纤维化作用机制研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 仪器与试药 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 数据分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 实验二 基于蛋白质组学的芹菜素抗肝纤维化作用机制研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 仪器与试药 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 数据分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 实验三 转录组学和蛋白质组学联合分析及验证实验 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 仪器与试药 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 数据分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 芹菜化学成分及药理作用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（9）Epac1在肝星状细胞表型转化中的作用及CP-25对其的影响（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 肝纤维化患者组织样本 |
| 2.2 实验动物 |
| 2.3 细胞株 |
| 2.4 药物与试剂 |
| 2.5 仪器与设备 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 免疫荧光双染法检测α-SMA、Epac1在肝纤维化患者组织标本中的表达 |
| 3.2 CCl_4诱导的小鼠肝纤维化模型的建立与分组 |
| 3.2.1 肝脏组织病理学检查 |
| 3.2.1.1 HE染色 |
| 3.2.1.2 Masson染色 |
| 3.2.2 Western blot法检测Epac1、a-SMA、Ⅲ型胶原、p-AKT、p-ERK表达变化 |
| 3.2.2.1 肝组织总蛋白及胞质胞膜蛋白的提取 |
| 3.2.2.2 蛋白定量 |
| 3.2.2.3 Western blot操作步骤 |
| 3.3 选择性激动或抑制Epac1对细胞增殖和迁移的影响 |
| 3.3.1 LX-2细胞的培养 |
| 3.3.2 CCK-8法检测选择性激动或抑制Epac1对细胞增殖的影响 |
| 3.3.3 划痕法检测选择性激动或抑制Epac1对细胞迁移的影响 |
| 3.4 选择性激动或抑制Epac1对LX-2细胞纤维化指标及下游通路相关蛋白表达的影响 |
| 3.4.1 LX-2总蛋白的提取和定量 |
| 3.4.2 Western blot法检测选择性激动或抑制Epac1对LX-2细胞α-SMA、Ⅲ型胶原、I型胶原、p-AKT、p-ERK蛋白表达的影响 |
| 3.4.3 Pull-down法检测选择性激动或抑制Epac1对LX-2细胞Rap1-GTP水平的影响 |
| 3.5 转染Epac1siRNA对 LX-2细胞中纤维化指标及下游信号通路相关蛋白表达的影响 |
| 3.5.1 Epac1 siRNA的筛选和转染效率验证 |
| 3.5.2 实验分组 |
| 3.5.3 Western blot法检测转染Epac1 siRNA对 LX-2 细胞中α-SMA、Ⅲ型胶原、p-AKT、p-ERK蛋白表达的影响 |
| 3.5.4 Pull-down法检测转染Epac1siRNA对 LX-2 细胞中Rap1-GTP水平的影响 |
| 3.6 CP-25对肝纤维化小鼠纤维化指标、Epac1及下游信号通路相关蛋白表达的影响 |
| 3.6.1 HE及 Masson染色检测CP-25对肝纤维化小鼠肝脏病理的影响 |
| 3.6.2 Western blot法检测CP-25对肝纤维化小鼠纤维化指标、Epac1及下游信号通路相关蛋白表达的影响 |
| 3.6.3 免疫组化法检测CP-25对肝纤维化小鼠肝脏中Epac1蛋白表达的影响 |
| 3.7 CP-25对LX-2细胞中纤维化指标及下游信号通路相关蛋白表达的影响 |
| 3.7.1 CP-25对LX-2细胞中α-SMA、Ⅲ型胶原、p-AKT、p-ERK蛋白表达的影响 |
| 3.7.2 CP-25对LX-2细胞中Rap1-GTP水平的影响 |
| 3.8 统计学处理 |
| 4 结果 |
| 4.1 α-SMA、Epac1在肝纤维化患者组织标本中的表达情况 |
| 4.2 造模不同病程肝纤维化小鼠肝脏Epac1表达情况 |
| 4.2.1 造模不同病程肝纤维化小鼠肝脏的病理学变化 |
| 4.2.2 α-SMA、Epac1在肝纤维化小鼠肝脏中的共表达情况 |
| 4.2.3 Epac1在不同病程肝纤维化小鼠肝脏中的表达情况 |
| 4.3 选择性激动或抑制Epac1对LX-2细胞增殖和迁移的影响 |
| 4.4 选择性激动或抑制Epac1对纤维化指标及下游信号通路相关蛋白表达的影响 |
| 4.4.1 选择性激动或抑制Epac1对LX-2细胞活化、胶原合成能力的影响 |
| 4.4.2 选择性激动或抑制Epac1对LX-2细胞Rap1-GTP水平及ERK、AKT信号激活的影响 |
| 4.5 转染Epac1 siRNA对LX-2细胞中纤维化指标及下游信号通路相关蛋白表达的影响 |
| 4.5.1 Epac1 siRNA筛选与转染效率验证 |
| 4.5.2 转染Epac1 siRNA对LX-2细胞活化、胶原合成能力的影响 |
| 4.5.3 转染Epac1 siRNA对LX-2细胞Rap1-GTP水平及ERK、AKT信号激活的影响 |
| 4.6 CP-25对CCl_4诱导的肝纤维化小鼠的影响 |
| 4.6.1 CP-25对肝纤维化小鼠肝脏病理学的影响 |
| 4.6.2 CP-25对肝纤维化小鼠肝组织a-SMA 和Ⅲ型胶原表达的影响 |
| 4.6.3 CP-25 对肝纤维化小鼠Epac1 蛋白表达的影响 |
| 4.6.4 CP-25对肝纤维化小鼠肝脏 ERK、AKT 通路的影响 |
| 4.7 CP-25对TGF-β1刺激的LX-2细胞中纤维化指标及下游信号通路相关蛋白表达的影响 |
| 4.7.1 CP-25对TGF-β1刺激的LX-2细胞活化、胶原合成能力的影响 |
| 4.7.2 CP-25对TGF-β1刺激的LX-2细胞Rap1-GTP水平的影响 |
| 4.7.3 CP-25对TGF-β1刺激的LX-2细胞ERK、AKT信号激活的影响 |
| 5 讨论 |
| 5.1 Epac1及其调控的信号在肝星状细胞表型转化过程中发挥重要作用 |
| 5.2 CP-25可能通过降低Epac1活性及其信号发挥抗肝纤维化作用 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 个人简历 |
| 致谢 |
| 综述:Epac信号分子在纤维化疾病中作用研究进展 |
| 参考文献 |
（10）八宝丹对胆汁淤积小鼠肝脏的保护作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略表 |
| 在读期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
四、细胞因子对细胞外基质在肝内沉积的影响（论文参考文献）
- [1]基于肝窦内皮细胞微尺度生物力学性质研究芪术颗粒抗肝纤维化机制[D]. 张强. 中国中医科学院, 2021(02)
- [2]miR-876调控POSTN促进肝癌进展和纤维化的机制研究[D]. 陈凯. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [3]基于核受体探讨人参皂苷25-OCH3-PPD和M4调控肝纤维化的作用机制研究[D]. 宋健. 延边大学, 2021(02)
- [4]纤维连接蛋白额外结构域A促进肝纤维化及血管异常增生的作用与机制研究[D]. 苏骁男. 山东大学, 2021(11)
- [5]七叶皂苷钠通过PI3K/AKT/mTOR通路抑制eIF4F复合物进而缓解大鼠肝纤维化[D]. 谢海深. 安徽医科大学, 2021(01)
- [6]核自身抗原精子蛋白NASP基因突变对ConA诱导的小鼠肝损伤的影响及其机制研究[D]. 张艳艳. 潍坊医学院, 2021(02)
- [7]外源线粒体纠正四氯化碳诱导的肝纤维化与治疗机制研究[D]. 侯伊雪. 西南大学, 2020(01)
- [8]转录—蛋白质组学的芹菜子抗肝纤维化物质基础及机制研究[D]. 谯明. 新疆医科大学, 2020(03)
- [9]Epac1在肝星状细胞表型转化中的作用及CP-25对其的影响[D]. 杜佳佳. 安徽医科大学, 2020
- [10]八宝丹对胆汁淤积小鼠肝脏的保护作用及机制研究[D]. 谢诗怡. 南方医科大学, 2020(01)