一、小鼠SLC基因真核表达载体的构建及其趋化活性鉴定（论文文献综述）
韩卓[1]（2021）在《维生素C转运蛋白SVCT2受体功能的发现及其介导的JAK2信号传递途径的研究》文中研究指明维生素C（Vitamin C,VitC）是人和动物必需的营养物质。科学界对于VitC功能几乎所有的认识都基于它作为电子供体,即作为天然还原剂的化学性质,主要表现在VitC能够清除细胞代谢过程中产生的活性氧自由基（reactive oxygen species,ROS）,保护重要的生物大分子免于氧化损伤,维持细胞的正常功能。对VitC研究的一次重大突破,在于发现VitC是亚铁离子(ferrous ion,Fe2+)和2-氧戊二酸盐（2-oxoglutarate）依赖型双加氧酶(Fe2+-and 2-oxoglutarate-dependent dioxygenases,Fe2+/2OGDDs)家族关键的“辅因子”,维持Fe2+/2OGDDs在细胞内的活性。进一步研究揭示,VitC能作为辅因子调节Fe2+/2OGDDs家族中与表观修饰有关的酶的催化活性,其中包括DNA羟化酶TET（ten-eleven translocation（TET）family of DNA hydroxylases）和具有Jumonji-C结构域的组蛋白去甲基化酶（Jumonji-C domain-containing histone demethylases）。这一发现直接加速了VitC在干细胞和再生医学领域中的研究,越来越多的证据表明VitC能够通过调控表观修饰酶的活性来提升细胞重编程的效率和质量,也能参与调节干细胞的自我更新和定向分化。有研究曾提出,VitC作为辅因子的生物学功能,本质上依然以VitC固有的还原性为基础,但VitC对表观修饰酶功能调控的特殊性却暗示VitC很可能还存在其他的作用机制,说明我们目前对VitC功能的认识很可能还存在很大空白,大大限制了VitC的应用价值。2014年,本课题组研究发现,VitC通过激活Janus kinase（JAK）2/signal transducer and activator of transcription（STAT）2信号途径,在小鼠胚胎干细胞中诱导Nanog基因的表达。我们曾初步证实,钠离子依赖型VitC转运蛋白2（sodium-dependent vitamin C transporter 2,SVCT2）能够介导VitC对JAK2和STAT2的信号激活,并参与对下游基因的调控,提示VitC与细胞信号转导有关联。在此基础上,本研究以小鼠F9畸胎瘤干细胞系为主要研究对象,首次证明VitC具有“生物信号分子”的作用,完善了对VitC生物学功能的认知。研究可分为两大阶段,第一阶段揭示VitC转运蛋白SVCT2具有JAK2偶联受体的功能;第二阶段研究VitC激活的JAK2信号传递途径具有的调控作用及其对VitC生物学功能的补充。主要的研究内容和结果列举如下:1.发现和探究VitC转运蛋白SVCT2的受体功能。首先,通过蛋白质免疫共沉淀（co-immunoprecipitation,co-IP）和免疫印迹,我们证明SVCT2特异性结合JAK2而不结合JAK1、JAK3和TYK2。然后,通过基序预测和突变体策略,研究SVCT2蛋白序列中介导JAK2结合和激活的关键结构基序。结果显示,位于SVCT2羧基末端的618-621位氨基酸序列以及连接第8～9号跨膜螺旋的胞质侧肽段中的418-422位氨基酸序列是负责结合JAK2的关键基序,介导VitC对JAK2的激活。通过磷酸化位点预测和突变体策略,研究JAK2对SVCT2潜在的磷酸化作用及其对招募STAT2的影响。结果显示,VitC激活的JAK2催化SVCT2羧基端Tyr626发生磷酸化,介导SVCT2对STAT2的招募,进一步诱导JAK2和STAT2的磷酸化。之后,通过双荧光素酶报告（Dual Luciferase Reporter）实验,我们还证明SVCT2响应VitC处理增强STAT2的转录因子活性,且依赖JAK2的激活。综上,本研究证实SVCT2是VitC的“受体样转运蛋白”,具有JAK2偶联受体的典型特征。此外,本研究还证明VitC对JAK2的激活与VitC在细胞内的积累无关。2.研究SVCT2介导的VitC运输和JAK2信号激活之间的关联。通过co-IP和免疫印迹,研究SVCT2介导的VitC运输对JAK2激活的影响。结果显示,抑制SVCT2对VitC的运输作用会抑制SVCT2对JAK2的磷酸化激活。通过高效液相色谱（high performance liquid chromatography）实验,研究SVCT2对JAK2的激活是否反过来影响SVCT2对VitC的运输。结果显示,抑制JAK2的激活也会削弱SVCT2对VitC的运输能力。这部分研究证明,SVCT2介导的VitC运输和JAK2信号激活之间紧密偶联、不可分割,是一个完整的生物学事件。3.研究VitC激活JAK2与清除ROS之间的关系。首先,通过流式细胞术（flow cytometry,FCM）和免疫印迹,研究VitC抑制ROS的作用对激活JAK2的影响。结果显示,VitC对JAK2的激活并不依赖对ROS的抑制。接下来,我们研究VitC激活的JAK2是否反过来影响VitC对ROS水平的调控。结果显示,VitC抑制细胞内ROS的水平且部分依赖JAK2的活性。随后的研究进一步证明,VitC激活的JAK2催化其固有底物脯氨酸脱氢酶激酶1（pyruvate dehydrogenase kinase,PDHK1）发生磷酸化,活化的PDHK1又催化脯氨酸脱氢酶E1α亚基（E1 alpha subunit of pyruvate dehydrogenase,PDHA1）Ser232发生磷酸化,抑制PDHA1的活性,降低细胞氧化代谢效率,进而抑制ROS的产生。4.研究JAK2的激活对VitC表观调控功能的影响。通过免疫荧光、点杂交和免疫印迹,研究VitC激活的JAK2对5hm C水平的调控。结果显示,抑制JAK2的激活会抑制VitC对5hm C水平的促进。通过磷酸化位点预测和突变体策略,我们首次证明TET3是JAK2的激酶底物。VitC和SVCT2激活的JAK2直接催化TET3 Tyr1375发生磷酸化。后续研究证实Tyr1375的磷酸化增强了TET3的酶活性并影响其对靶基因的选择,表明VitC不仅仅以辅因子身份调控TET酶的功能。另外,VitC激活的JAK2催化其固有底物组蛋白H3第41位酪氨酸残基发生磷酸化,而后者有利于开放染色质状态的建立。通过微球菌核酸酶消化实验,我们证明VitC确实能够提高基因组DNA的可接近性,且依赖于JAK2的激活。5.研究JAK2的激活对VitC在细胞多能性和分化调控中的影响。通过碱性磷酸酶染色、表达谱m RNA测序和实时定量PCR,研究VitC激活的JAK2对F9细胞的多能性,以及对多能性和分化相关基因表达的影响。结果显示,在F9细胞中,VitC对细胞多能性没有明显影响,但倾向于促进分化发育相关基因（特别是与神经成熟相关基因）的表达,且依赖于JAK2的激活;只有在JAK2活性被抑制的条件下,VitC更倾向于促进细胞的多能性,并诱导一系列多能性相关基因（但不包括Nanog）的表达。进一步的研究发现,VitC激活的JAK2实际上通过两条作用相反的途径分别调控两类下游基因的表达,即通过依赖STAT2的途径调控少数特定多能性相关基因（比如Nanog）的表达;通过不依赖STAT2的途径调控与分化相关基因的表达。综上,本研究发现VitC转运蛋白SVCT2具有JAK2偶联受体的功能,并证明激活JAK2是VitC发挥调控作用的重要途径。这是对VitC生物学作用突破性的发现,为其生理和药理功能的研究带来新的思考,对VitC在疾病治疗和再生医学等众多领域的应用具有一定的指导意义。
何延华[2]（2020）在《非致细胞病变牛病毒性腹泻病毒抑制Ⅰ型干扰素产生的分子机制探索》文中研究说明牛病毒性腹泻-黏膜病（Bovine viral diarrhea-mucosal disease,BVD-MD）是由牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）感染引起的一种重要的牛传染性疾病,其隐秘性、长时间一过性感染以及持续感染动物形成的病毒存储库使得BVD-MD在全球牛群中肆虐,给世界养牛业造成了巨大的经济损失。NCP（noncytopathic）BVDV感染能够引起牛免疫力下降,继发其它病原微生物感染,其主要原因是NCP BVDV感染不能很好地诱导细胞产生固有免疫应答。Ⅰ型干扰素（type I interferon,IFN-Ⅰ）通路是固有免疫的主要组成部分,在机体控制并清除病原体的过程中扮演关键角色。目前,BVDV免疫抑制及持续感染的分子机制仍然不清楚,为了进一步明确NCP BVDV的致病机理,了解病毒与宿主之间的相互作用关系,本论文对NCP BVDV抑制IFN-Ⅰ产生的分子机制进行探索性研究。目的:（1）通过转录组测序技术获得NCP BVDV感染宿主细胞的m RNA文库,以生物信息学为平台分析NCP BVDV诱导的差异表达基因（Differentially Expressed Genes,DEGs）富集的通路和参与的细胞过程,为理解病毒与宿主之间的相互作用奠定基础（2）构建牛IFN-β（Bo IFN-β）启动子荧光素酶报告系统分析了NCP BVDV及其非结构蛋白对干扰素表达的影响,鉴定NCP BVDV抑制宿主干扰素生成的靶标。同时,为今后研究病毒抑制Bo IFN-β的作用机理提供便利工具。（3）对NCP BVDV诱导宿主细胞上调表达的牛SIKE1（Bo SIKE1）基因进行功能研究,确定Bo SIKE1与BVDV增殖的关系,为阐明SIKE1在固有免疫应答中作用机制提供依据。方法:（1）首先,利用牛外周血单核细胞分离液分离了牛外周血单核细胞,经流式细胞仪检测单核细胞表面抗原CD14的表达水平,然后用NCP BVDV感染牛单核细胞,在感染不同时期收集样本。在Illumina Hiseq 2500测序平台测序,测序结果利用生物信息学方法分析DEGs,随后对DEGs进行GO和KEGG聚类分析,筛选IFN-Ⅰ信号通路相关的DEGs进行荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,q RT-PCR）验证。（2）其次,利用分子生物学技术克隆牛的IFN-β启动子功能元件序列,构建荧光素酶报告系统,利用荧光素酶报告基因分析方法检测NCP BVDV及其非结构蛋白对poly（I:C）诱导的IFN-β、NF-κB和IRSE的荧光素酶活性,采用蛋白免疫印迹法检测IFN-Ⅰ通路相关分子IRF7、IRF7磷酸化和RIG-I蛋白的表达情况,验证NCP BVDV及非结构蛋白对抑制宿主IFN-Ⅰ产生的影响。（3）最后,克隆及表达Bo SIKE1基因,制备相应的多克隆抗体,通过q RT-PCR和蛋白质免疫印迹法验证过表达和干扰Bo SIKE1对BVDV增殖的影响。采用LC-MS/MS和Co-IP等方法筛选Bo SIKE1的互作蛋白。结果:（1）NCP BVDV感染牛单核细胞后,细胞免疫荧光检测显示成功构建了NCP BVDV体外原代细胞感染模型;对转录组测序分析,在感染2 h后,筛选出DEGs 9959个,其中4968个DEGs上调;在感染24 h后,筛选出DEGs 7977个,其中4184个DEGs表达上调;进一步分析免疫应答途径相关DEGs,对感染2 h与24 h的DEGs进行比较,感染2 h与免疫反应或抗病毒活性相关的DEGs明显高于24 h;利用KEGG聚类分析筛选95个Ⅰ型干扰素信号通路相关的DEGs,利用q RT-PCR证实了筛选的干扰素信号通路、干扰素刺激基因（Interferon（IFN）-stimulated genes,ISGs）和参与固有免疫应答的基因（IRF7、DDX3X、TLR13、DDX 58、MVAS、TLR9、TRAF6、IRF1、IFIT1、STAT1、ISG20、TRIM25、Mx1、NLRX1、CYLD、SIKE1和ZAP70）的差异表达水平与转录组测序结果基本一致。（2）克隆Bo IFN-β的启动子功能元件序列,成功的构建Bo IFN-β基因启动子荧光素酶报告系统;利用抗性基因筛选获得Bo IFNβ3-Luc-MDBK细胞系,用NCP BVDV感染Bo IFNβ3-Luc–MDBK细胞发现NCP BVDV毒株感染可明显抑制poly（I:C）诱导的IFN-β3的转录活性,同时也抑制了下游抗病毒基因的表达;基因合成NCP BVDV的7个非结构蛋白(Npro、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)基因并连接慢病毒载体,酶切鉴定和测序表明重组慢病毒载体构建成功,并且包装的慢病毒感染MDBK后能够表达目的基因;通过荧光素酶报告系统检测NCP BVDV及7个非结构蛋白对Hu IFN-β、Hu NF-κB、Hu IRSE和Bo IFN-β的荧光素酶活性,结果表明,NCP BVDV能够抑制IFN-β的转录表达,其中非结构蛋白Npro和NS4B对IFN-β的转录表达有显着的抑制作用;在HEK293T细胞中过表达NS4B蛋白,可以显着抑制IRF7的表达以及磷酸化水平,对RIG-I的表达没有抑制作用。（3）克隆到Bo SIKE1基因的ORF为642 bp,同源性分析发现,Bo SIKE与羊、猪、人和鼠的氨基酸相似度分别为99%、96.1.0%、94.2%和91.1%;构建原核重组表达质粒p ET22b-Bo SIKE1,转化大肠杆菌并表达了约为25 k Da的目的条带,通过诱导条件优化Bo SIKE1融合蛋白均以包涵体形式表达,纯化Bo SIKE1蛋白并成功制备了兔多克隆抗体,抗体ELISA效价检测抗体滴度达到1:128000以上;通过过表达和干扰验证了Bo SIKE对BVDV增殖的影响,Bo SIKE1过表达后引起BVDV复制增强,干扰Bo SIKE1的表达会引起BVDV复制降低,Bo SIKE具有抑制抗病毒免疫的作用。LC-MS/MS和Co-IP数据显示Bo SIKE1与微管蛋白TUBA1D之间存在直接相互作用。推测SIKE可能介导固有免疫所需的细胞骨架重排,是联系细胞骨架结构与固有免疫信号通路的桥梁。结论:（1）成功构建NCP BVDV感染牛原代免疫细胞模型并获得不同感染时间转录组差异表达谱,筛选了95个IFN-Ⅰ信号通路相关的DEGs。（2）通过干扰素启动子荧光素酶报告系统检测发现,NCP BVDV非结构蛋白Npro和NS4B对IFN-Ⅰ的产生具体抑制作用。（3）Bo SIKE1能够影响NCP BVDV的增殖,Bo SIKE1与TUBA1D之间存在直接相互作用,推测Bo SIKE1蛋白可能是联系细胞骨架结构与固有免疫信号通路的桥梁。
张萍[3]（2020）在《识别髓系白血病Hu3A4-CAR的构建及体内外生物学特性研究》文中进行了进一步梳理研究背景和目的急性白血病是儿童中最常见的癌症类型。尽管该疾病的治疗取得了进展,但仍有约20%的患者死于耐药或复发[1]。在过去的十年中,分子研究已经发现与儿童急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）和急性淋巴细胞白血病（acute lymphocytic leukemia,ALL）相关的遗传标记越来越多,这些标志物可以增强风险分层,改变治疗策略可改善患者预后。ALL常伴有与淋巴细胞发育和细胞周期调控有关的基因突变和染色体易位[2]。现在越来越多的证据表明,表观遗传学改变（包括DNA甲基化差异）会影响白血病的易感性和预后[3]。组蛋白甲基化失调可能影响与肿瘤发生有关的重要细胞过程,例如增殖和分化,从而导致肿瘤[4]。TET2是10-11易位基因家族的成员,催化DNA中的5-甲基胞嘧啶向5-羟甲基胞嘧啶的转化。SET和MYND结构域蛋白2（SMYD2）是一种甲基转移酶,可以调节包括组蛋白在内的几种蛋白质的活性[5]。两种基因的异常表达都被报道与血液肿瘤相关[6,7]。我们前期的实验已经证实了TET2基因m RNA水平的降低和SMYD2基因m RNA水平的升高是儿童ALL的预后不良因素。相比较于ALL,儿童AML相对预后不良,治愈率更低。随着优化化疗方案,开展造血干细胞移植等技术,儿童AML的治疗效果虽有了明显提高,但始终有部分AML患儿无法耐受化疗、复发及原发耐药而治疗失败。白血病干细胞（leukemia stem cells,LSCs）是儿童AML复发或耐药的根源[8]。对复发难治性AML来说,常规化疗已无法彻底杀灭LSCs,迫切需要寻求新的治疗方法。近年来,以CD19为靶标的嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor,CAR）修饰的T细胞在B系肿瘤的应用中已取得令人瞩目的成果,这也给儿童复发难治性AML的治疗带来新的希望,但少有靶点被批准用于AML临床治疗,到目前为止,仅CD123-CAR被美国FDA批准用于复发难治性AML的临床治疗,而其他靶点的CAR仍在进行治疗试验中,现正在研发的AML-CAR靶标包括CD33,CD123,FLT3,Lewis-Y和CLL-1等靶点,但效果大多不良,迫切需要寻找新的靶点。3A4是本课题组前期研制的单抗,它是可识别人CD45亚类的Ig Gκ类抗体。我们之前实验显示,3A4仅识别B系肿瘤细胞、正常B细胞、髓系白血病和其干细胞、na?ve T细胞、少量单核细胞,而不识别红细胞、嗜中性粒细胞、正常记忆T细胞、血小板和大部分造血干细胞,是一个靶向AML的良好靶点。究其原因,CAR的成功率一方面与靶点调变有关系,另一方面,跟识别靶点单源抗体人源化的程度有关。大多数CAR是鼠源的,鼠源CAR对人体有免疫原性,可产生抗sc Fv抗体,CAR被中和导致CAR的功能大大被削弱。为了解决这个问题,我们提出用人源化CAR,可明显降低抗sc Fv抗体的产生,从而保证CAR的杀伤活性;为此,3A4抗体已进行了人源化改造,取名为Hu3A4,人源化程度达到93%（课题组前期研究结果）。Hu3A4可特异性结合髓系和B系LSCs,并对髓系KG1a细胞有较强的靶向杀伤作用,利用Hu3A4单抗构建Hu3A4-CAR,靶向杀伤白血病干细胞和治疗难治性AML具有重要科学意义及临床应用前景。本研究包含如下四个部分:1.识别髓系白血病人源化3A4-CAR（Hu3A4-CAR）慢病毒表达载体的构建;2.Hu3A4-CAR慢病毒包装、浓缩、滴度测定研究和Hu3A4-CAR在T细胞的成功表达及体外扩增;3.Hu3A4-CAR-T对白血病细胞的体外靶向杀伤作用及机制,与Mu3A4-CAR-T靶向杀伤差异的比较研究;4.Hu3A4-CAR-T靶向治疗白血病动物模型的作用及与Mu3A4-CAR-T靶向抗肿瘤差异的比较研究。方法1 识别AML-LSC的Hu3A4-CAR表达载体的构建1.1 二代真核表达载体pc DNA3.1/Hu3A4-4-1BB-3ζ和慢病毒表达载体p Lenti/Hu3A4-4-1BB-3ζ的构建:检索文献,确定二代CAR的基因结构,核实Hu3A4-CAR胞外区、跨膜区和胞内区各个结构的基因序列;通过分子克隆技术进行构建真核表达载体pc DNA3.1/Hu3A4-4-1BB-3ζ和慢病毒表达载体p Lenti/Hu3A4-4-1BB-3ζ。1.2 Hu3A4-CAR真核表达载体和慢病毒表达载体的活性鉴定:采用瞬时转染CHO细胞的方法,用流式细胞术（FCM）法检测验证Hu3A4-CAR基因是否表达,并比较两种载体表达CAR效率的差别,选择出效率高的表达载体用于下一步实验。2 Hu3A4-CAR在T细胞的成功表达2.1慢病毒包装及滴度鉴定:包装质粒Rev,Gag-Pol,Vsvg及表达质粒p Lenti/Hu3A4-4-1BB-3ζ的大量抽提后,选用人胚肾293T细胞作包装细胞,脂质体作用下对包装质粒和表达质粒进行包装,收集携有Hu3A4-CAR慢病毒的上清液并测定慢病毒滴度。2.2 Hu3A4-CAR和Mu3A4-CAR在T细胞的成功表达和体外扩增:Ficoll密度梯度离心法分离人外周血中T细胞,抗人CD3/28磁珠及IL-2活化刺激T细胞、然后用含Hu3A4-CAR基因的慢病毒转导到T细胞中。采用RT-PCR,Western blot、流式细胞术分别鉴定Hu3A4-CAR和Mu3A4-CAR是否表达于T细胞。研究Hu3A4-CAR-T和Mu3A4-CAR-T在体外培养的扩增倍数。3 Hu3A4-CAR-T的体外靶向杀伤作用及与Mu3A4-CAR-T靶向杀伤差异的比较研究:细胞形态学和流式细胞仪结合检测Hu3A4-CAR-T和Mu3A4-CAR-T与3A4+靶细胞的靶向结合情况,并比较在不同效靶比其靶向结合率的变化;采用Calcein-AM释放法检验Hu3A4-CAR-T细胞靶向杀伤KG1a细胞株及新发AML患者体内的白血病细胞的作用,并与Mu3A4-CAR-T靶向杀伤差异进行比较研究;FCM CBA法检测Hu3A4-CAR-T和Mu3A4-CAR-T靶向杀伤靶细胞时分泌细胞因子的水平;Hu3A4-CAR-T和Mu3A4-CAR-T杀伤机制研究:Real-time PCR法验证Hu3A4-CAR-T和Mu3A4-CAR-T靶向杀伤时穿孔素（perforin,PFN）基因和颗粒酶B（granzyme B,GZM-B）表达是否变化。采用Ficoll密度梯度离心法分离健康骨髓中的单个核细胞（bone marrow mononuclear cells,BMMNCs）,将BMMNCs、Hu3A4-CAR-T细胞和Mu3A4-CAR-T细胞充分洗涤,计数并重悬在IMDM培养基中。将5×103个BMMCs分别与具有良好特异性靶向杀伤功能的Hu3A4-CAR-T细胞和Mu3A4-CAR-T细胞以效应细胞:靶细胞=10:1的比例共孵育20小时,然后将细胞悬液转移至含有重组细胞生长因子基于甲基纤维素的半固体培养基Metho Cult SF H4436（加拿大Stem cell公司）,并一式两份铺板。14天后,在光学显微镜下通过形态学观察CFU集落并进行分类计数。4 AML小鼠模型体内Hu3A4-CAR-T抗肿瘤作用及与Mu3A4-CAR-T抗肿瘤差异的研究:实验选用NOD/SCID小鼠,设为模型组、空白对照组、T细胞治疗对照组、Hu3A4-CAR-T细胞治疗组和Mu3A4-CAR-T细胞治疗组,共5组,每组6只;先予浓度10mg/ml的环磷酰胺预处理,每只小鼠200ul连续腹腔注射2天;除PBS组外,其余4组小鼠每只接种2x106KG1a细胞以建立AML的动物模型,在注射KG1a细胞后第一天和第二天,予T细胞、Hu3A4-CAR-T细胞和Mu3A4-CAR-T细胞静脉输注;监测小鼠的体重变化、观察精神状态,有无活动减少、行动迟缓、弓背抬高等发病症状;每1-3周小鼠眶周静脉采血,流式检测Hu3A4-CAR-T和Mu3A4-CAR-T细胞的植入与存留情况,细胞因子的水平;记录小鼠发病和死亡的日期,绘制生存曲线,比较各组小鼠之间生存时间的差别。观察各组小鼠器官的病理与免疫组化的结果。结果1识别AML-LSC的Hu3A4-CAR表达载体的构建1.1真核表达载体pc DNA3.1/Hu3A4-4-1BB-3ζ和慢病毒表达载体p Lenti/Hu3A4-4-1BB-3ζ的构建:我们确定构建二代CAR的基因,Hu3A4-CAR的基本结构:CD8a leader是Hu3A4-CAR的前导序列,Hu3A4-sc Fv是靶向识别区,CD8a hinge是铰链区,CD8a TM是Hu3A4-CAR的跨膜区,4-1BB的胞内共刺激信号转导区和CD3ζ的内信号转导区则串联连构成Hu3A4-CAR的胞内段。我们构建了Hu3A4-CAR的二代真核表达载体pc DNA3.1/Hu3A4-4-1BB-3ζ和慢病毒表达载体p Lenti/Hu3A4-4-1BB-3ζ。测序结果表明,基因序列与设计序列一致,说明载体构建成功,能用于下一步实验。1.2 Hu3A4-CAR真核表达载体及慢病毒表达载体活性鉴定:FCM法证实我们构建的Hu3A4-CAR的真核表达载体及慢病毒表达载体都是有活性的载体,可成功地在CHO细胞表达Hu3A4-CAR重组蛋白。就表达效率来说,慢病毒载体高于真核表达载体（36%vs.24.3%,P=0.046）。2 Hu3A4-CAR和Mu3A4-CAR在T细胞的成功表达2.1 慢病毒包装及滴度鉴定:293T细胞成功包装了含Hu3A4-CAR基因和Mu3A4-CAR基因的慢病毒,采用q RT-PCR测定Hu3A4-CAR和Mu3A4-CAR慢病毒滴度在5 x105数量级以上。2.2 Hu3A4-CAR和Mu3A4-CAR在T细胞的成功表达和体外扩增:RT-PCR、Western blot和流式细胞术鉴定Hu3A4-CAR-T和Mu3A4-CAR-T的表达,3种方法均证明,Hu3A4-CAR和Mu3A4-CAR基因能成功导入且表达于T细胞表面。慢病毒感染体系感染人活化原代T细胞中的感染效率在42%-62%。在CD3/CD28磁珠活化T细胞,1640完全培养基加上IL-2的培养条件下,Hu3A4-CAR-T和Mu3A4-CAR-T细胞在体外能扩增110-200倍,两者之间扩增倍数无统计学差异（平均扩增倍数分别为130倍和135倍,P>0.05）。3 Hu3A4-CAR-T的体外靶向杀伤作用及与Mu3A4-CAR-T靶向杀伤差异的比较研究:Hu3A4-CAR-T和Mu3A4-CAR-T均可靶向识别和结合3A4+的KG1a及Raji细胞,并随着效靶比例的增加,其与靶细胞的结合率也升高。Calcein-AM是一种荧光染料,在活细胞内荧光较为稳定,而在死细胞内荧光不明显,被Calcein-AM标记的靶细胞,分别与Hu3A4-CAR-T、Mu3A4-CAR-T及普通T细胞共孵育24小时。FCM显示与T细胞共孵育24小时的靶细胞,Calcein-AM阳性率为（95.3+0.3%）,在FITC通道可被检测到绿色荧光,而与Hu3A4-CAR-T及Mu3A4-CAR-T共孵育24小时的靶细胞,Calcein-AM阳性细胞分别为（17.2+0.5）%和（12.8+1.4）%,有大部分被CAR-T靶向结合而检测不到绿色荧光,两组间无统计学差异（P=0.079）,但分别与T细胞杀伤对照组有显着差异（P<0.001）,说明与CAR-T靶向结合的靶细胞被杀伤,随着效靶比的逐步升高,杀伤功能有不同程度的增强。Hu3A4-CAR-T及Mu3A4-CAR-T在靶向杀伤的过程中,可以引起IFN-γ分泌升高,效靶比为10:1时,Hu3A4-CAR-T及Mu3A4-CAR-T组分泌IFN-γ分别为69.4pg/ml和51.8pg/ml,两组之间差异无统计学意义（P=0.739）,但分别与T细胞杀伤对照组有显着差异（P<0.05）。用Real-time PCR方法可检测到颗粒酶B m RNA表达水平升高,CT值分别为0.0929和0.0925,差异无统计学意义（P=0.096）,但分别与T细胞杀伤对照组有显着差异（P<0.05）。Hu3A4-CAR-T、Mu3A4-CAR-T与5×103个BMMNCs共孵育后进行集落形成单位（CFU）培养,14天后在倒置显微镜下观察集落形态并计数,未经CAR-T杀伤的造血干/祖细胞（对照组）的集落数为（26.3+0.88）/5x103,而经Mu3A4-CAR-T和Hu3A4-CAR-T共孵育杀伤的造血干/祖细胞组的集落数分别为（27+1.15）/5x103和（23+1.15）/5x103,与对照组相比,CFU集落数差异无显着意义（P>0.05）。说明两种3A4-CAR-T细胞（人源化、鼠源）对骨髓造血干/祖细胞无明显影响。4 Hu3A4-CAR-T白血病小鼠模型体内抗肿瘤作用及与Mu3A4-CAR-T抗肿瘤差异的研究:设模型组、PBS空白对照组、T细胞治疗对照组、Hu3A4-CAR-T细胞治疗组和Mu3A4-CAR-T细胞治疗组共5组,每组小鼠6只。除PBS组注射PBS外,其余4组小鼠我们成功地通过尾静脉接种了KG1a细胞2x106个/只,接种KG1a细胞后第一天和第二天,T细胞治疗组的小鼠予成功静脉输注了T细胞,Hu3A4-CAR-T细胞治疗组和Mu3A4-CAR-T细胞治疗组的小鼠分别成功地静脉注射了Hu3A4-CAR-T细胞和Mu3A4-CAR-T细胞;Hu3A4-CAR-T治疗组中的1只小鼠D2天予尾静脉注射Hu3A4-CAR-T后半小时死亡,其余小鼠继续进行实验。采用流式细胞仪检测两种3A4-CAR-T细胞在小鼠体内的存留,结果显示,在D11天Mu3A4-CAR-T细胞治疗组所有小鼠外周血中可以检测到Mu3A4-CAR-T细胞（0.005%-0.052%）,Hu3A4-CAR-T细胞治疗组的5只小鼠也都能检测到Hu3A4-CAR-T细胞（0.002%-0.127%）,遗憾的是,在D25天,Mu3A4-CAR-T细胞治疗组所有小鼠外周血中Mu3A4-CAR-T细胞水平<0.001%,而Hu3A4-CAR-T细胞治疗组只剩下2只小鼠能检测到Hu3A4-CAR-T（分别为0.003%和0.013%）,D41天这2只小鼠也没再检测到Hu3A4-CAR-T。至观察期（140天）结束,空白对照组NOD/SCID小鼠均存活;造模组小鼠和T细胞治疗对照组小鼠全部发病死亡,中位生存时间分别是54（44-94）天和59（52-140）天;Mu3A4-CAR-T治疗组有3只小鼠发病死亡,至观察期结束3只小鼠仍存活,中位生存时间为98（68-140）天;Hu3A4-CAR-T治疗组有3只小鼠存活至观察期结束,中位生存时间为89（2-140）天;各组小鼠间的生存时间差异具有统计学意义（P<0.05）。病理结果显示,发病小鼠的脑膜组织有肿瘤细胞浸润,免疫组化染色也证实了肿瘤细胞浸润了脑膜,这可能是导致小鼠出现后肢瘫痪的原因。而其他心、肺、肝、脾、肾、肠、胰腺等组织未见肿瘤细胞浸润。结论1.本研究通过分子克隆的方法成功地构建了以3A4为靶点的人源化真核表达载体pc DNA3.1/Hu3A4-4-1BB-3ζ和慢病毒表达载体p Lenti/Hu3A4-4-1BB-3ζ。两者能成功转染CHO细胞,慢病毒载体感染的效率要高于真核表达载体。2.慢病毒载体成功感染了293T细胞,包装成功的Hu3A4-CAR慢病毒和Mu3A4-CAR慢病毒能顺利感染T细胞,并在细胞水平、蛋白水平和分子水平得以证实。3.Hu3A4-CAR-T和Mu3A4-CAR-T细胞在体外能培养成功。CD3/CD28磁珠活化联合IL-2的体外培养可以使Hu3A4-CAR-T和Mu3A4-CAR-T细胞在2周的时间在体外扩增110-200倍。4. Hu3A4-CAR-T可靶向结合3A4+靶细胞,随效靶比例的升高,其与靶细胞的结合率也增加。Hu3A4-CAR-T和Mu3A4-CAR-T可靶向杀伤3A4+细胞株和新发AML患者体内的白血病细胞,但对3A4-的Nalm-6细胞无杀伤功能。在靶向杀伤过程中,鼠源和人源化3A4-CAR-T均伴随IFN-γ水平上升;同鼠源一样,人源化3A4-CAR-T可通过颗粒胞吐途径介导的溶细胞功能发挥杀伤活性。两种3A4-CAR-T细胞（人源化、鼠源）对骨髓造血干/祖细胞无明显影响。5. Hu3A4-CAR-T细胞及Mu3A4-CAR-T细胞在移植肿瘤动物体内均可以发挥抗肿瘤作用。
肖航[4]（2018）在《猪血管紧张素转化酶2（ACE2）的克隆表达及在LPS致猪小肠上皮细胞炎性损伤中的作用》文中认为血管紧张素转移酶2（Angiotensin converting enzyme 2,ACE2）研究主要集中在啮齿类动物和人类,其他动物,如牛、羊、猪等方面的资料较少或没有。其在不同组织器官中良好的抗炎抗损伤作用也被广泛认可,但在肠道中的作用尚不清楚。本研究以猪为研究对象,应用现代分子生物学等技术建立猪ACE2原核和真核表达体系,制备ACE2多克隆抗体,并获得ACE2活性蛋白,采用LPS建立猪上皮细胞（IPEC-J2）炎性损伤模型,对ACE2的抗炎作用进行了初步探讨。研究包括以下三方面:1.猪ACE2基因的原核表达、多克隆抗体制备及在猪体内的表达分布本章研究以苏姜猪为研究对象,通过原核表达获得猪特异的ACE2重组蛋白,通过改变IPTG刺激终浓度和时间以探究目的蛋白最佳表达条件,经Ni2+-NTA亲和层析和KC1染色切胶两种方法纯化重组pET-32a-ACE2融合蛋白包涵体后,将其作为免疫抗原制备多克隆抗体,并对其进行免疫原性及特异性验证,免疫组化法确定ACE2在猪各组织中的细胞学定位。结果:1)本研究利用PCR技术成功扩增了猪ACE2基因编码区序列,大小2418bp,编码805个氨基酸。同源性显示该猪ACE2基因具有较高保守性,与山羊遗传距离最近。生物信息学显示该ACE2蛋白为Ⅰ型跨膜蛋白,亲水性较好,1-17aa之间存在一个蛋白信号肽;2)构建了 pET-28a-ACE2和pET-32a-ACE22种ACE2蛋白原核表达载体,转化DH5α、BL21表达感受态后,当IPTG浓度为1mmol/L,诱导时间为10h,采用pET-32a-ACE2原核表达载体时,ACE2蛋白在E.coli BL21（DE3）中表达量最高,且以包涵体形式存在。表达产物的分子质量约为1OOkDa,与预期目的蛋白分子质量相符;3)选用的Ni2+-NTA亲和层析和KC1染色切胶两种方法纯化重组pET-32a-ACE2融合蛋白包涵体,均能得到可溶性的重组蛋白,但KCl染色切胶法纯化获得的可溶性重组蛋白浓度及纯度都更佳,纯化的蛋白经Western blot鉴定具有良好的抗原性;4)利用纯化的ACE2重组蛋白免疫Wastar大鼠,成功制备了鼠抗猪源ACE2多克隆抗体,间接ELISA法鉴定抗体效价为1:3200,Western blot鉴定该抗体具有良好的专一性及免疫反应特异性;5)免疫组化结果表明,ACE2在猪各组织器官中均有表达,尤其在胃底的黏膜上皮层、小肠的肌层、浆膜层、绒毛上皮层,大肠中的肠腺中高表达。2.真核表达载体pcDNA.3.1（+）-ACE2的构建、转染表达及其酶活性鉴定本章旨在构建稳定的真核表达细胞系,获得具有ACE2酶活性的活性蛋白,为后续研究奠定基础。研究采用猪十二指肠进行如下实验:1)RT-PCR扩增出猪ACE2全长序列,单、双酶切鉴定正确后与真核表达载体pcDNA3.1（+）连接,转染至CHO细胞,经G418初步筛选后再经单克隆进一步筛选,使重组质粒能在CHO细胞中稳定表达;2)Western blot及免疫荧光法检验ACE2基因在蛋白质水平上的表达;3)比色法定量测定细胞中ACE2酶活性。结果:1)体外成功构建了 ACE2真核表达载体pcDNA3.1（+）-ACE2;2)Western-blot检测显示在CHO细胞中成功筛选出7株pcDNA3.1（+）-ACE2细胞株。免疫荧光进一步证实ACE2确实过表达在CHO细胞中;3)比色法结果表明CHO细胞中提取的ACE2蛋白具有酶活性,活性大小为7.42 nmol FAP/min。本研究成功构建了 pcDNA3.1（+）-ACE2真核表达质粒,并筛选出7株pcDNA3.1（+）-ACE2稳定细胞株,证实CHO细胞中表达的ACE2具有较好的酶活性,提取获得了一定量的ACE2活性蛋白,为后续探究ACE2的生物学作用奠定基础。3.ACE2在LPS致猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）炎症损伤中的作用研究以LPS致猪IPEC-J2细胞炎性损伤,对ACE2的抗炎作用进行了探讨。进行如下实验:1)免疫荧光法确定ACE2在IPEC-J2细胞中的表达;2)用不同浓度LPS诱导IPEC-J2细胞炎性损伤,通过检测细胞活力、炎性细胞因子释放以及细胞线粒体的膜电位变化确定最佳诱导时间;3)Western Blot法检测不同浓度LPS（1ng/mL、10 ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL、10000ng/mL）刺激 IPEC-J2 细胞 4h 后 ACE2、ACE、AT1R和MasR的表达水平;RIA以及ELISA法分别检测细胞上清中Ang II和Ang1-7的含量。结果:1)ACE2蛋白在IPEC-J2细胞上有表达,主要定位在细胞膜上;2)不同浓度LPS处理细胞4h后,IPEC-J2细胞出现典型的炎症损伤,表现细胞活力下降,促炎因子TNF-α、IL-6、IL-8的含量均明显增高,细胞线粒体膜电位明显下降;3)LPS处理细胞4h后,ACE2、MasR表达水平以及Ang1-7含量随细胞损伤程度的增加而下降,而ACE、AT1R、Ang II的表达水平则呈现相反趋势,且ACE/ACE2表达水平的比值呈现先下降后上升的趋势。这些结果提示在不同浓度LPS处理IPEC-J2细胞4h后均可诱导细胞炎症损伤,ACE2/Ang1-7/MasR和ACE/AngⅡ/AT1R两条轴均被激活。在低浓度LPS刺激时,ACE2/Ang1-7/MasR轴起主要作用,ACE2通过降解AngⅡ介导Ang1-7/MasR发挥抗炎性损伤作用;在高浓度LPS刺激时,ACE/AngⅡ/AT1R通路的促炎作用占优势。
马飞,孙文欣,林晨,张叔人,郭素娟,徐兵河[5]（2008）在《SLC基因修饰对肿瘤细胞疫苗免疫效果的初步研究》文中提出目的:构建次级淋巴组织趋化因子（secondary lymphoid-tissue chemokine,SLC）基因修饰的趋化型恶性黑色素瘤疫苗,并初步研究其免疫效果。方法:SLC基因转染小鼠黑色素瘤细胞B16,并用适当条件的丝裂霉素处理,制备趋化型肿瘤细胞疫苗。在体外,利用趋化小室法检测趋化型疫苗培养上清对小鼠脾淋巴细胞的趋化活性。在体内,用趋化型疫苗免疫小鼠,检测脾淋巴细胞的CTL活性,并观察疫苗免疫对B16移植瘤生长的影响。结果:筛选获得了SLC基因转染的小鼠黑色素瘤B16细胞,以100μg/mL丝裂霉素处理1.5h,制备趋化型肿瘤细胞疫苗。趋化型疫苗在体外培养48h后,其培养上清对淋巴细胞具有明显的趋化活性。与野生型疫苗相比,用趋化型疫苗免疫后,小鼠脾淋巴细胞的CTL活性更强,小鼠免疫后再次接种B16细胞,肿瘤的生长受到更明显的抑制。结论:成功构建了SLC基因修饰的趋化型黑色素瘤疫苗,并在体内外初步检测到该疫苗对抗肿瘤免疫的影响和对移植瘤生长的抑制,该疫苗有可能被应用于恶性黑色素瘤的免疫治疗。
贺宇飞,张桂梅,王小红,张慧,袁野,李东,冯作化[6]（2006）在《SLC真核表达质粒的剂量-趋化效应及抑瘤效应研究》文中研究说明目的:观察次级淋巴组织趋化因子（SLC）真核表达质粒剂量-趋化效应关系及不同剂量体内应用时对小鼠H22肝癌的治疗作用。方法:构建了小鼠SLC真核表达质粒（pSLC）,体外转染检测pSLC在体外的剂量-趋化效应关系,体内不同剂量的pSLC质粒局部注射检测其表达情况及体内的剂量-趋化效应关系,并观察不同剂量的pSLC对小鼠H22肝癌治疗的剂效关系。结果:当剂量在0·5μg以下时,pSLC在体外转染的趋化效应与转染剂量呈正相关,但在0·75μg时明显下降;pSLC体内局部注射时,在所检测的200μg剂量以内,随注射质粒剂量的增加,其表达的mRNA水平逐渐增加,相应地,对淋巴细胞的趋化作用亦逐渐增强,pSLC对肿瘤的抑制作用亦随其剂量的增加而明显增强（P<0·001）。结论:体内局部转染表达pSLC,能够有效趋化聚集免疫细胞,对肿瘤产生免疫治疗效应。通过提高转染表达效果,可增加SLC趋化作用,增强肿瘤免疫治疗效应。
刘容枝[7]（2006）在《趋化抗原基因疫苗的研究》文中研究表明DNA疫苗一直是肿瘤疫苗研究领域的热点。然而，DNA疫苗的潜力有待进一步提高。在本研究中，我们联合应用次级淋巴组织趋化性细胞因子（SLC）和IgG Fc的佐剂效应来提高DNA疫苗的潜力。以HPV 16的E7抗原为模型抗原，以pShuttIe-CMV为真核表达载体，在E7基因的5’端连接SLC，在其3’端连接Fc基因，构建了嵌合体DNA疫苗pSLC-E7-Fc，同时，构建了pE7-Fc、pSLC-E7、pE7、pSLC、pFc和pCMV六种对照质粒。 利用RT-PCR和Western Blotting，证实了包括pSLC-E7-Fc在内的六种质粒都能被真核细胞有效表达。 以E7阳性的免疫原性好的C3细胞和免疫原性差的TC-1细胞为模型，进行了pSLC-E7-Fc疫苗的肿瘤预防与治疗实验。结果表明，在C3肿瘤治疗实验中（初始治疗时肿瘤大小为6mm×6mm），pSLC-E7-Fc免疫使100％的小鼠肿瘤完全消退，并长期生存；而其他组最高的肿瘤完全消退率未超过50％。在TC-1肿瘤预防实验中，pSLC-E7-Fc免疫使100％的小鼠不长瘤，而所有对照质粒免疫的小鼠全部成瘤；用三倍剂量的TC-1细胞对不长瘤的小鼠进行再攻击，仍不出瘤，而对照组出瘤率为100％。在皮下接种TC-1细胞15天后开始免疫治疗，pSLC-E7-Fc疫苗使72％的小鼠肿瘤完全消退，并长期存活。而pE7-Fc免疫仅使28％的小鼠肿瘤完全消退，其他对照组肿瘤持续生长，小鼠全部死亡。当皮下接种TC-1细胞30天后开始免疫，pE7-Fc免疫组平均生存期为71天，而pSLC-E7-Fc免疫组平均生存期延长至91天（p＜0.01）。在TC-1肺转移治疗实验中，与pE7-Fc相比，pSLC-E7-Fc免疫显着减少了肺肿瘤结节数（p＜0.01）。以上结果说明，与对照相比，pSLC-E7-Fc能更有效地预防和治疗E7阳性的C3和TC-1肿瘤。 为分析pSLC-E7-Fc疫苗抗肿瘤效应的机制，进行了体外淋巴细胞增殖实验、CTL活性检测、抗体滴度检测以及体内CD4和CD8淋巴细胞删除实验。结果表明，与对照质粒相比，pSLC-E7-Fc免疫的小鼠显示了最高的E7特异的淋巴细胞增殖能力、CTL活性和抗体应答，这说明pSLC-E7-Fc可诱导有效的抗原特异性的细胞和体液免疫应答。而且，免疫前体内删除和免疫后体外删除CD4或CD8淋巴细胞表明，CD8淋巴细胞是pSLC-E7-Fc抗肿瘤效应的主要参与者。
侯丽,马金龙,王来城,张捷,焦玉莲,马春燕,崔彬,赵跃然[8]（2005）在《真核表达载体pVAX1-mSLC的构建及在COS-7细胞中的表达》文中研究指明目的:构建小鼠次级淋巴组织趋化因子（mSLC）高效真核细胞表达载体pVAX1-mSLC。方法:用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切重组克隆pMD-mSLC,胶回收约410bp的SLC基因片段,以亚克隆法构建于真核表达载体pVAX1的相应酶切位点。转化后进行菌落PCR分析和HinDⅢ酶切鉴定。阳性克隆提取质粒,体外电穿孔法转染COS-7细胞,用Westernblot检测转染细胞中mSLC的瞬时表达。结果:菌落PCR和HinDⅢ酶切鉴定证实,mSLC基因片段正确插入到真核表达载体pVAX1中。Westernblot检测表明,以重组质粒pVAX1-mSLC转染的COS-7细胞能表达mSLC,表达产物的相对分子量同预期的结果相一致。结论:成功地构建小鼠SLC基因的真核表达质粒pVAX1-mSLC,用它转染COS-7细胞后,能瞬时表达mSLC,为下一步mSLC的肿瘤基因治疗研究奠定了基础。
马飞,孙文欣,张叔人,刘蓉枝,付明,梁肖,张雪艳,林晨[9]（2005）在《次级淋巴组织趋化因子基因转染对小鼠黑色素瘤细胞生物学特性的影响》文中认为目的研究次级淋巴组织趋化因子（SLC）基因转染对小鼠恶性黑色素瘤细胞生物学特性的影响。方法采用脂质体法将小鼠SLC基因转染至小鼠恶性黑色素瘤细胞中,并通过G418筛选出转基因细胞克隆。体外检测SLC基因转染恶性黑色素瘤细胞的增殖,并通过趋化小室法检测细胞培养基上清液中SLC的趋化活性。检测野生型和基因转染的恶性黑色素瘤细胞在体内的致瘤性,并病理检测肿瘤组织中免疫细胞的浸润。结果SLC基因转染的恶性黑色素瘤细胞和野生型恶性黑色素瘤细胞在体外的增殖没有明显差别。分泌于细胞培养基上清液中的SLC表现出了趋化活性。SLC基因转染并没有降低细胞的致瘤性,但是移植瘤的生长明显慢于野生型恶性黑色素瘤细胞移植瘤的生长,并且病理证实SLC基因转染的肿瘤细胞移植瘤内呈现明显的淋巴细胞浸润。结论SLC基因转染在小鼠黑色素瘤能诱导抗肿瘤免疫,有可能被应用于恶性肿瘤的免疫治疗。
侯丽,赵跃然,王来城,焦玉莲,张捷,马春燕,崔彬[10]（2005）在《重组共表达载体pSLC-IRES-IL-2的构建及在COS-7细胞中的表达》文中提出目的:构建共表达质粒pSLC-IRES-IL-2,并在COS-7细胞中表达。方法:根据人SLC和IL-2cDNA的序列分别设计、合成引物,构建以内部核糖体进入位点（IRES）相连的SLC和IL-2基因的真核表达质粒pSLC-IRES-IL-2,用电穿孔法以共表达质粒转染COS-7细胞。用Westernblot检测SLC和IL-2的表达。结果:Westernblot检测表明,以重组共表达质粒pSLC-IRES-IL-2转染的COS-7细胞能表达SLC和IL-2,表达产物的Mr同预期的结果相一致。结论:成功地构建SLC和IL-2基因的共表达质粒,以其转染COS-7细胞后,能分泌性表达SLC和IL-2,为肿瘤基因治疗的研究提供一定途径。
二、小鼠SLC基因真核表达载体的构建及其趋化活性鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、小鼠SLC基因真核表达载体的构建及其趋化活性鉴定（论文提纲范文）
（1）维生素C转运蛋白SVCT2受体功能的发现及其介导的JAK2信号传递途径的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 维生素C性质及其生物学功能的研究进展 |
| 1.1.1 维生素C的发现、生物合成及利用 |
| 1.1.2 维生素C的运输及机体稳态调节 |
| 1.1.3 维生素C的抗氧化性 |
| 1.1.4 维生素C是二价铁离子和α-氧戊二酸盐依赖性双加氧酶家族蛋白的关键辅因子 |
| 1.1.5 维生素C促进细胞重编程 |
| 1.1.6 维生素C是一个低甲基化诱导因子 |
| 1.1.7 维生素C的潜在抗癌机制 |
| 1.1.8 维生素C与其他疾病的关系及潜在治疗作用 |
| 1.1.9 维生素C在调控细胞信号通路方面的初探索 |
| 1.1.10 维生素C已知的生物学功能具有两面性 |
| 1.2 钠离子依赖型维生素C转运蛋白SVCTs的研究进展 |
| 1.2.1 SVCTs的结构、定位和运输作用 |
| 1.2.2 SVCT1和SVCT2 表达和功能的调控 |
| 1.2.3 SVCT2 在调控细胞分化和细胞功能成熟中的作用 |
| 1.3 非受体型酪氨酸激酶JAK2 的研究进展 |
| 1.3.1 JAK激酶家族蛋白的结构和功能简介 |
| 1.3.2 JAK2 激酶活性的调控 |
| 1.3.3 非经典细胞核内JAK2 信号转导途径研究进展 |
| 第二章 维生素C转运蛋白SVCT2 受体功能的探究 |
| 2.1 材料、试剂与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器与耗材 |
| 2.1.4 主要试剂配方 |
| 2.1.5 主要分析软件和数据库 |
| 2.1.6 细胞培养 |
| 2.1.7 真核表达载体构建 |
| 2.1.8 细胞转染 |
| 2.1.9 免疫印迹 |
| 2.1.10 蛋白质免疫(共)沉淀(Immunoprecipitation (IP)/co-Immunoprecipitation (co-IP)) |
| 2.1.11 总RNA提取、反转录和实时定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR) |
| 2.1.12 双荧光素酶报告实验(Dual Luciferase Reporter Assay,DLR) |
| 2.1.13 细胞内VitC含量测定 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 SVCT2 响应VitC处理特异性激活JAK2和STAT2 |
| 2.2.2 SVCT2 羧基端和连接第 8~9 号跨膜螺旋间的胞质侧肽段介导与JAK2 的互作 |
| 2.2.3 SVCT2 羧基端和连接第 8~9 号跨膜螺旋间的胞质侧肽段介导对JAK2 的磷酸化激活 |
| 2.2.4 VitC对 JAK2 的激活与VitC的胞内积累无关且呈现振荡性 |
| 2.2.5 VitC诱导SVCT2 Tyr~(626)发生磷酸化且依赖JAK2 的激活 |
| 2.2.6 SVCT2 Tyr626的磷酸化介导对 STAT2 的招募 |
| 2.2.7 SVCT2 响应VitC处理增强STAT2 的转录因子活性 |
| 2.2.8 SVCT2对JAK2 的激活依赖对VitC的运输 |
| 2.2.9 SVCT2对VitC的充分运输依赖JAK2 的激活 |
| 2.2.10 DHA和 GLUT1/3 不能激活JAK2/STAT2 信号通路 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 VitC激活的JAK2 信号途径调节细胞内ROS的水平 |
| 3.1 材料、试剂与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器与耗材 |
| 3.1.4 主要试剂配方 |
| 3.1.5 主要分析软件和数据库 |
| 3.1.6 细胞培养 |
| 3.1.7 细胞转染 |
| 3.1.8 免疫印迹 |
| 3.1.9 细胞内ROS含量测定 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 VitC对 JAK2 的激活与对 ROS的抑制无关 |
| 3.2.2 VitC抑制ROS的水平且部分依赖JAK2 的激活 |
| 3.2.3 激活JAK2 有助于SVCT2对ROS的抑制 |
| 3.2.4 VitC诱导PDHK1和PDHA1 的磷酸化且依赖JAK2 的活性 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论 |
| 第四章 VitC激活的JAK2 信号途径参与细胞表观调控 |
| 4.1 材料、试剂与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器与耗材 |
| 4.1.4 主要试剂配方 |
| 4.1.5 主要分析软件和数据库 |
| 4.1.6 细胞培养 |
| 4.1.7 真核表达载体构建 |
| 4.1.8 细胞转染 |
| 4.1.9 免疫印迹 |
| 4.1.10 IP/co-IP |
| 4.1.11 5mC和5hmC免疫荧光染色(immunofluorescence,IF)实验 |
| 4.1.12 点杂交(dot blot,DB)实验 |
| 4.1.13 微球菌核酸酶消化实验 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 VitC诱导F9 细胞基因组5hm C的积累且部分依赖JAK2 的激活 |
| 4.2.2 VitC激活的JAK2 催化 TET3 Tyr~(1375)发生磷酸化 |
| 4.2.3 Tyr~(1375)的磷酸化提高TET3 的酶活性 |
| 4.2.4 VitC诱导组蛋白H3 Tyr~(41)的磷酸化且依赖JAK2 的激活 |
| 4.2.5 VitC提高F9 细胞DNA的可接近性且依赖JAK2 的激活 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 结论 |
| 第五章 VitC激活的JAK2 信号途径参与细胞多能性和分化调控 |
| 5.1 材料、试剂与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器与耗材 |
| 5.1.4 主要试剂配方 |
| 5.1.5 主要分析软件和数据库 |
| 5.1.6 细胞培养 |
| 5.1.7 细胞转染 |
| 5.1.8 免疫印迹 |
| 5.1.9 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)染色实验 |
| 5.1.10 总RNA提取、反转录和RT-q PCR |
| 5.1.11 表达谱m RNA测序及数据分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 VitC和 JAK2 抑制剂处理下F9 细胞表达谱m RNA测序分析 |
| 5.2.2 VitC在 JAK2 活性抑制的条件下促进F9 细胞的多能性 |
| 5.2.3 激活JAK2 不利于VitC促进F9 细胞的多能性 |
| 5.2.4 VitC诱导多能性相关基因Nanog、Esrrb、Prdm14和Prdm16 的表达且依赖JAK2 的激活 |
| 5.2.5 VitC诱导神经成熟相关基因的表达且严格依赖JAK2 的激活 |
| 5.2.6 VitC激活的JAK2 分别通过依赖 STAT2 和不依赖 STAT2 的途径诱导多能性相关基因和分化相关基因的表达 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 研究有待改进之处 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）非致细胞病变牛病毒性腹泻病毒抑制Ⅰ型干扰素产生的分子机制探索（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1 研究的目的和意义 |
| 2 国内外研究进展 |
| 2.1 牛病毒性腹泻病毒-黏膜病(BVDV-MD) |
| 2.1.1 BVDV流行病学 |
| 2.1.2 BVDV分子生物学特征 |
| 2.1.3 BVDV基因组及其编码蛋白 |
| 2.1.4 BVDV感染机制 |
| 2.1.5 BVDV持续性感染 |
| 2.1.6 BVDV免疫逃避 |
| 2.2 RNA-Seq技术筛选病毒相关宿主基因 |
| 2.2.1 RNA-Seq技术的发展 |
| 2.2.2 RNA-Seq技术的应用 |
| 2.2.3 单细胞测序技术(Sc RNA-Seq) |
| 2.3 抗病毒固有免疫 |
| 2.3.1 TLRs及其介导的信号通路 |
| 2.3.2 RLRs及其介导的信号通路 |
| 2.4 Ⅰ型干扰素(IFN-I) |
| 2.4.1 JAK-STAT通路 |
| 2.4.2 ISGs的抗病毒作用 |
| 2.5 病毒逃避Ⅰ型干扰素信号通路 |
| 2.5.1 病毒抑制Ⅰ型干扰素上游信号通路 |
| 2.5.2 病毒抑制Ⅰ型干扰素下游信号通路 |
| 2.6 IFN信号的复杂性和宿主趋向性 |
| 3 研究内容 |
| 3.1 NCP BVDV感染牛单核细胞模型的建立及转录组测序分析 |
| 3.2 牛IFN-β启动子报告载体的构建及NCP BVDV对干扰素信号通路的影响 |
| 3.3 牛SIKE1 蛋白对NCP BVDV复制的影响及互作蛋白筛选 |
| 4 技术路线 |
| 第二章 试验研究 |
| 试验一 NCP BVDV感染牛单核细胞模型的建立及转录组测序分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病毒分离株和实验动物 |
| 1.1.2 重要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 牛外周血单核细胞的分离及鉴定 |
| 1.2.2 免疫荧光实验(IFA) |
| 1.2.3 NCP BVDV-LC病毒TCID50测定 |
| 1.2.4 BVDV感染牛外周血单核细胞 |
| 1.2.5 RNA提取 |
| 1.2.6 建库及测序 |
| 1.2.7 生物信息学分析 |
| 1.2.8 qRT-PCR验证差异表达基因 |
| 1.2.9 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 流式细胞术鉴定牛单核细胞 |
| 2.2 NCP BVDV感染牛外周血单核细胞免疫荧光检测 |
| 2.3 差异表达基因(DEGs)的筛选 |
| 2.4 GO聚类分析 |
| 2.5 KEGG分析 |
| 2.6 Ⅰ型干扰素信号通路相关DEGs分析 |
| 2.7 qRT-PCR验证部分DEGs |
| 3 讨论 |
| 3.1 牛外周血单核细胞的分离及鉴定 |
| 3.2 NCP BVDV感染牛单核细胞DEGs分析 |
| 4 小结 |
| 试验二 牛IFN-β启动子报告载体的构建及NCP BVDV对干扰素信号通路的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞和毒株 |
| 1.1.2 重要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 质粒 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 牛Ⅰ型干扰素IFN-β启动子报告载体的构建和分析 |
| 1.2.2 BoIRF7和Bo DDX58 真核表达载体的构建及对干扰素启动子活性的影响 |
| 1.2.3 NCP BVDV对干扰素信号通路的影响 |
| 1.2.4 NCP BVDV非结构蛋白慢病毒载体构建及对干扰素信号通路的影响 |
| 1.2.5 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 牛Ⅰ型干扰素IFNβ的启动子报告载体构建及活性分析 |
| 2.1.1 牛IFN-β启动子序列的克隆 |
| 2.1.2 BoIFN-β启动子报告载体的构建 |
| 2.1.3 BoIFNβ3-Luc-MDBK细胞的制备 |
| 2.1.4 BoIFNβ3-Luc MDBK细胞对BVDV复制的影响 |
| 2.1.5 ploy(I:C)对BoIFNβ3-Luc转录活性的影响 |
| 2.2 BoIRF7和Bo DDX58 真核载体构建及对BoIFNβ3 启动子活性的影响 |
| 2.2.1 BoIRF7和Bo DDX58 真核载体构建 |
| 2.2.2 BoIRF7和Bo DDX58对BoIFNβ3-Luc转录活性的影响 |
| 2.3 NCP BVDV在 MDBK细胞对干扰素信号通路的影响 |
| 2.3.1 NCP BVDV在 MDBK细胞上对干扰素通路相关分子转录的影响 |
| 2.3.2 NCP BVDV感染对BoIFNβ3-Luc转录活性的影响 |
| 2.4 NCP BVDV非结构蛋白对干扰素信号通路的影响 |
| 2.4.1 NCP BVDV非结构蛋白真核表达载体构建 |
| 2.4.2 NCP BVDV非结构蛋白慢病毒的包装及感染MDBK细胞 |
| 2.4.3 NCP BVDV非结构蛋白对Hu IFN-β、Hu NF-κB、Hu-IRSE、BoIFN-β转录活性的影响 |
| 2.4.4 NCP BVDV非结构蛋白NS4B对 poly(I:C)诱导的IFN-Ⅰ通路蛋白表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 细胞转染效率 |
| 3.2 病毒抑制IFN-Ⅰ信号通路的机制 |
| 3.3 BVDV非结构蛋白对IFN-Ⅰ通路的影响 |
| 4 小结 |
| 试验三 牛SIKE1 蛋白对NCP BVDV复制的影响及互作蛋白筛选 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 试验动物、细胞和毒株 |
| 1.1.2 重要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 质粒 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 BoSIKE1 基因的克隆及表达载体构建 |
| 1.2.2 BoSIKE1 基因的原核表达及多克隆抗体制备 |
| 1.2.3 NCP BVDV病毒感染MDBK细胞后对BoSIKE1 表达的影响 |
| 1.2.4 BoSIKE1 过表达和干扰对NCP BVDV复制的影响 |
| 1.2.5 LC-MS/MS蛋白质组分析 |
| 1.2.6 BoSIKE1 与互作蛋白的Co-IP实验 |
| 1.2.7 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 BoSIKE1 基因的克隆及同源性分析 |
| 2.2 BoSIKE1 基因的原核表达及多克隆抗体制备 |
| 2.2.1 BoSIKE1 基因的原核表达 |
| 2.2.2 BoSIKE1 抗体的制备与鉴定 |
| 2.3 BVDV病毒感染宿主细胞后对BoSIKE1 表达的影响 |
| 2.4 BoSIKE1 过表达和干扰细胞的构建 |
| 2.5 BoSIKE1 过表达和干扰对BVDV复制的影响 |
| 2.6 LC-MS/MS蛋白质组分析 |
| 2.7 BoSIKE1与TUBA1D蛋白互作验证 |
| 3 讨论 |
| 3.1 BoSIKE对 NCP BVDV复制的影响 |
| 3.2 BoSIKE1 互作蛋白的鉴定及分析 |
| 4 小结 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
| 石河子大学博士研究生学位论文导师评阅表 |
（3）识别髓系白血病Hu3A4-CAR的构建及体内外生物学特性研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 识别髓系白血病Hu3A4-CAR慢病毒表达载体的构建 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 Hu3A4-CAR在 T细胞的成功表达 |
| 第一章 慢病毒包装及滴度鉴定 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二章 Hu3A4-CAR和 Mu3A4-CAR在 T细胞的成功表达和体外扩增 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 Hu3A4-CAR-T的体外靶向杀伤作用及与Mu3A4-CAR-T靶向杀伤差异的比较研究 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第四部分 Hu3A4-CAR-T体内抗肿瘤作用及与Mu3A4-CAR-T抗肿瘤差异的研究 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 嵌合抗原受体（CAR）-T 细胞治疗急性髓性白血病（AML）的临床研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
（4）猪血管紧张素转化酶2（ACE2）的克隆表达及在LPS致猪小肠上皮细胞炎性损伤中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号及缩略语说明 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 血管紧张素转化酶2 (ACE2)及其研究概况 |
| 1 血管紧张素转化酶2 (ACE2)的基因组成研究 |
| 1.1 ACE2首次发现在人医临床 |
| 1.2 不同研究对象ACE2基因组成的研究 |
| 1.3 ACE2广泛存在于各种动物及人体,但其编码基因存在种间差异 |
| 2 ACE2的催化功能及其代谢产物 |
| 2.1 ACE2的催化功能 |
| 2.2 ACE2催化作用的抑制剂 |
| 2.3 ACE2催化作用的代谢产物 |
| 3 ACE2的分布及组织细胞定位 |
| 3.1 ACE2在组织器官中的表达分布 |
| 3.2 ACE2的细胞学定位 |
| 3.3 ACE2的生物学功能 |
| 第二章 肾素-血管紧张素系统(RAS)在胃肠道炎症损伤中的研究 |
| 1 RAS系统两条通路 |
| 2 经典ACE-AngⅡ-AT1R通路在胃肠道上分布及其作用 |
| 2.1 经典RAS通路概述 |
| 2.2 ACE-AngⅡ-AT1R通路在胃肠道中的表达分布 |
| 2.3 ACE-AngⅡ-AT1R在胃肠道中的作用及机制 |
| 3 RAS的新通路ACE2-Ang1-7-Mas在胃肠道上的分布及作用 |
| 3.1 ACE2-Ang1-7-Mas概述 |
| 3.2 ACE2在胃肠道中的分布定位 |
| 3.3 ACE2的胃保护功能 |
| 3.4 ACE2在肠道氨基酸转运中的作用 |
| 3.5 ACE2与肠道微生物之间的关系 |
| 3.6 ACE2与肠道炎症之间的关系 |
| 4 结束语 |
| 参考文献 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第三章 猪血管紧张素转化酶2 (ACE2)基因的原核表达、多克隆抗体制备及其在猪体内的表达分布 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 质粒和菌液 |
| 1.4 主要溶液的配制 |
| 1.5 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 猪ACE2基因的PCR扩增结果 |
| 2.2 猪ACE2基因克隆表达结果 |
| 2.3 猪ACE2基因阳性质粒的测序结果 |
| 2.4 猪ACE2基因组成的生物信息学分析 |
| 2.5 原核表达ACE2基因重组质粒的构建与鉴定 |
| 2.6 鼠抗ACE2多克隆抗体的鉴定及效价测定 |
| 2.7 Western Blot检测鼠抗ACE2血清特异性 |
| 2.8 免疫组化检测ACE2在猪各组织中表达情况 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 真核表达载体pcDNA.3.1(+)-ACE2的构建、转染表达及其酶活性鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试剂与器材 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 目的基因ACE2的PCR扩增结果 |
| 2.2 单克隆菌落PCR、单双酶切及测序结果 |
| 2.3 pcDNA3.1(+)-ACE2真核表达质粒在CHO细胞中的表达 |
| 2.4 pcDNA3.1(+)-ACE2真核表达细胞系中ACE2酶活的测定结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 血管紧张素转化酶2 (ACE2)在LPS致猪小肠上皮(IPEC-J2)细胞炎症损伤中的作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试剂与器材 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 数据处理 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 ACE2在IPEC-J2细胞上的表达定位 |
| 2.2 LPS致IPEC-J2细胞炎性损伤模型的建立 |
| 2.3 细胞上清中促炎因子IL-6、IL-8含量的测定结果 |
| 2.4 线粒体膜电位检测结果 |
| 2.5 Western B1ot检测IPEC-J2细胞中ACE2、MasR的表达变化 |
| 2.6 Western Blot检测IPEC-J2细胞中ACE、AT1R的表达变化 |
| 2.7 ACE蛋白/ACE2蛋白比值分析 |
| 2.8 不同浓度LPS处理4h后,细胞上清中AngⅡ、Ang1-7的含量 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 攻读硕士学位期间发表论文与学术交流活动 |
| 致谢 |
| 附录 |
（5）SLC基因修饰对肿瘤细胞疫苗免疫效果的初步研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 趋化型肿瘤细胞疫苗的筛选和构建 |
| 1.3 趋化型肿瘤细胞疫苗对淋巴细胞体外趋化活性的测定 |
| 1.4 肿瘤细胞疫苗免疫小鼠脾细胞CTL活性的测定 |
| 1.5 肿瘤细胞疫苗免疫后对小鼠移植瘤生长的观察 |
| 1.6 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 SLC基因转染的趋化型肿瘤细胞疫苗的构建 |
| 2.2 趋化型肿瘤细胞疫苗对淋巴细胞的体外趋化作用 |
| 2.3 趋化型肿瘤细胞疫苗免疫对脾细胞CTL活性的影响 |
| 2.4 趋化型肿瘤细胞疫苗免疫对肿瘤生长的抑制作用 |
| 3 讨论 |
（6）SLC真核表达质粒的剂量-趋化效应及抑瘤效应研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要试剂 |
| 1.1.2 动物和细胞 |
| 1.1.3 质粒 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 RT-PCR 总RNA用TRIzol试剂提取, 按说明书进行。 |
| 1.2.2 SLC真核表达载体构建 |
| 1.2.3 细胞转染 |
| 1.2.4 体外趋化实验 |
| 1.2.5 体内趋化实验 |
| 1.2.6 动物抑瘤实验 |
| 2 结果 |
| 2.1 SLC真核表达质粒的鉴定 |
| 2.2 pSLC体外转染的剂量-趋化效应关系 |
| 2.3 pSLC体内对淋巴细胞的趋化作用 |
| 2.4 pSLC对小鼠H22肝癌的治疗作用 |
| 3 讨论 |
（7）趋化抗原基因疫苗的研究（论文提纲范文）
| 英文缩写 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 |
| 前言 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 致谢 |
| 附录 |
（8）真核表达载体pVAX1-mSLC的构建及在COS-7细胞中的表达（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 目的基因DNA的序列测定 |
| 1.2.2 重组表达载体pVAX1-mSLC的构建 |
| 1.2.3 重组质粒的筛选与鉴定 |
| 1.2.4 重组质粒转染COS-7细胞[6,7] |
| 1.2.5 免疫印迹（Western blot) |
| 2 结果 |
| 2.1 目的基因DNA的序列分析 |
| 2.2 pVAX1-m SLC重组体的鉴定结果 |
| 2.3 重组蛋白在COS-7细胞中表达鉴定结果 |
| 3 讨论 |
（9）次级淋巴组织趋化因子基因转染对小鼠黑色素瘤细胞生物学特性的影响（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 SLC基因转染的小鼠黑色素瘤细胞株的建立 |
| 1.3 转基因细胞的RT-PCR鉴定 |
| 1.4 肿瘤细胞体外生长曲线的测定 |
| 1.5 肿瘤细胞培养基上清趋化活性的测定 |
| 1.5.1 小鼠脾淋巴细胞的制备 |
| 1.5.2 趋化小室法检测趋化活性 |
| 1.6 肿瘤细胞体内致瘤性的观察 |
| 1.7 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 肿瘤细胞的转染与筛选 |
| 2.2 RT-PCR的鉴定结果 |
| 2.3 肿瘤细胞体外生长曲线的测定结果 |
| 2.4 肿瘤细胞培养基上清液趋化活性的测定结果 |
| 2.5 肿瘤细胞体内致瘤性及荷瘤小鼠存活期的结果 |
| 2.6 肿瘤局部病理学检查 |
| 3 讨论 |
四、小鼠SLC基因真核表达载体的构建及其趋化活性鉴定（论文参考文献）
- [1]维生素C转运蛋白SVCT2受体功能的发现及其介导的JAK2信号传递途径的研究[D]. 韩卓. 西北农林科技大学, 2021
- [2]非致细胞病变牛病毒性腹泻病毒抑制Ⅰ型干扰素产生的分子机制探索[D]. 何延华. 石河子大学, 2020
- [3]识别髓系白血病Hu3A4-CAR的构建及体内外生物学特性研究[D]. 张萍. 浙江大学, 2020(01)
- [4]猪血管紧张素转化酶2（ACE2）的克隆表达及在LPS致猪小肠上皮细胞炎性损伤中的作用[D]. 肖航. 南京农业大学, 2018(07)
- [5]SLC基因修饰对肿瘤细胞疫苗免疫效果的初步研究[J]. 马飞,孙文欣,林晨,张叔人,郭素娟,徐兵河. 中华肿瘤防治杂志, 2008(05)
- [6]SLC真核表达质粒的剂量-趋化效应及抑瘤效应研究[J]. 贺宇飞,张桂梅,王小红,张慧,袁野,李东,冯作化. 中国免疫学杂志, 2006(05)
- [7]趋化抗原基因疫苗的研究[D]. 刘容枝. 中国协和医科大学, 2006(11)
- [8]真核表达载体pVAX1-mSLC的构建及在COS-7细胞中的表达[J]. 侯丽,马金龙,王来城,张捷,焦玉莲,马春燕,崔彬,赵跃然. 山东大学学报(医学版), 2005(09)
- [9]次级淋巴组织趋化因子基因转染对小鼠黑色素瘤细胞生物学特性的影响[J]. 马飞,孙文欣,张叔人,刘蓉枝,付明,梁肖,张雪艳,林晨. 免疫学杂志, 2005(05)
- [10]重组共表达载体pSLC-IRES-IL-2的构建及在COS-7细胞中的表达[J]. 侯丽,赵跃然,王来城,焦玉莲,张捷,马春燕,崔彬. 细胞与分子免疫学杂志, 2005(05)