寄生虫贾第鞭毛虫体内有病毒颗粒

一、寄生虫蓝氏贾第虫体内有病毒粒子（论文文献综述）

李昕彧^[1]（2020）在《基于贾第素α-12的贾第虫荧光标记方法和PCR检测方法的建立及应用》文中指出贾第鞭毛虫是一种引起宿主腹泻的人畜共患的寄生原虫,其引起的贾第虫病在多地暴发流行。该病的症状有腹泻、脱水、腹痛、恶心、呕吐、体重减轻等。全世界每年有近2.8亿人被感染。除感染人之外,还感染家畜（牛、羊、猪、兔等）、野生动物（狐狸、狼、袋鼠、骆驼等）、和宠物（猫、犬、龙猫等）。该病的流行会给畜牧业造成严重的公共卫生问题和经济损失。因此对贾第虫病进行快速、准确的诊断对畜牧业卫生安全具有重要意义。十二指肠贾第虫寄生在宿主的小肠粘膜上皮,是一种厌氧型原生动物寄生虫。它具有真核生物和原核生物的特性,同时也有自己的生物学特点,因而贾第虫是细胞生物学和生物进化很有意义的研究对象。荧光标记方法可以用于贾第虫的生物学研究,将遗传水平上的相关活动可视化。常用的贾第虫标记荧光素GFP和SNAP标签,在贾第虫的应用上都存在着限制。分选酶A是一种新兴可用于在活细胞中或体外进行蛋白质修饰标记的转肽酶,广泛应用于生物技术领域。本实验室前期研究发现贾第素α-12具有特异性和高表达量,并已应用于建立间接ELISA检测方法中,因此,本实验拟基于贾第素α-12建立一种贾第虫荧光标记方法和PCR检测方法。主要研究内容如下:基于贾第素α-12的贾第虫标记方法的建立,首先进行贾第虫体外贾第素α-12和荧光染料的连接:对SortaseA蛋白进行表达、纯化、浓缩,检测其活性。构建了pET-28-giardin-α-12-LEPTG表达载体,表达纯化后,得到分子量约为36kDa大小的giardin-α-12-LEPTG蛋白。将得到的SortaseA、giardin-α-12-LEPTG和polyG（GGG）-GFP（约26kDa）共孵育,经SDS-PAGE分析鉴定,成功得到了与理论值一致大小分子量约62kDa的giardin-α-12-LEPTGGG-GFP结合蛋白。成功实现了在贾第虫体外贾第素α-12和荧光染料的特异性结合。在贾第虫体内荧光标记方法的实验:成功地重组构建了十二指肠贾第虫病毒载体pC631-giardin-α-12-LEPTG-pac,将其进行体外转录电转染入到十二指肠贾第虫体内,获得具有潮霉素抗性的十二指肠贾第虫目的虫株。扫描电镜观察目的虫株的形态结构良好和生长曲线无变化,成功获得稳定传代20代以上的目的虫株。通过Real-time PCR检测该虫株可高表达giardin-α-12-LEPTG,成功得到了可以稳定表达giardin-α-12-LEPTG的虫株。将目的虫株与SortaseA、polyG-FITC共孵育,成功在激光共聚焦下观察到具有荧光标记的贾第虫。该标记方法也成功印证了贾第素α-12在贾第虫体内的细胞定位。基于贾第素α-12的贾第虫PCR检测方法的建立,根据NCBI中的贾第素α-12基因序列,选择高度保守的基因片段设计合成引物,优化反应条件,选择该PCR方法的退火温度和延伸时间,验证该方法的特异性和敏感性。结果显示该反应最佳的为退火温度62℃,延伸时间30s,特异性好。敏感性验证结果显示最低可检测每克样品中2×101个十二指肠贾第虫包囊。应用已建立的基于贾第素α-12的贾第虫PCR检测方法检测来自长春周边养殖场的羊粪便样品283份,检出十二指肠贾第虫阳性率为13.7%（39/283）,基因型均为聚集体A。综上所述,本研究成功建立了贾第虫的荧光标记方法和PCR检测方法,为了解和认识贾第虫更多生物学相关功能提供了实验思路和技术手段,为进一步对贾第虫的诊断和防控提供了基础。

赵权,蔡亚楠,张媛^[2]（2018）在《寄生性原虫病毒研究进展》文中指出寄生虫病毒是病毒寄生于寄生虫体内,属于超寄生范畴。由于病毒的存在,其寄生的寄生虫会因为携带病毒的原因而改变侵袭力,有的寄生虫会增强感染宿主能力,而有的寄生虫会减弱宿主的感染能力,也有的寄生虫因为病毒的存在而延长感染期。目前对此类现象研究的较少,文章就寄生性原虫病毒的特性,病毒对寄生虫感染力的影响及利用原虫病毒作为载体进行相关的研究等进行了综述。

李新^[3]（2018）在《TLRs介导的天然免疫应答在贾第虫致病中的作用及机制》文中提出十二指肠贾第虫（Giardia duodenalis）,也称蓝氏贾第虫（Giardia lamblia）,简称贾第虫（Giardia）,是一种重要的寄生性人兽共患原虫,由其引起的贾第虫病被称为“旅行者腹泻”,临床上表现为腹痛、腹泻、呕吐以及婴幼儿发育迟缓等症状,并可引起胆囊炎及肝脏损坏,严重时可导致婴幼儿和免疫缺陷患者的死亡。美国已将贾第虫列入生物恐怖的黑名单,世界范围内城市供水和生活饮用水卫生标准均把贾第虫检测作为必检指标之一。目前临床上常用甲硝唑治疗贾第虫病,而甲硝唑对孕妇和哺乳期的女性毒副作用很大。迄今尚无理想防治贾第虫的办法,究其原因就是对贾第虫的致病机制缺乏详尽的了解,尚未找到药物或疫苗关键靶位。Toll样受体（Toll-like receptors,TLRs）是参与机体先天免疫的一类重要模式识别受体,能够识别病原微生物的保守结构成分,激活机体的先天免疫应答。TLRs能够识别多种病原寄生虫,如弓形虫、隐孢子虫、疟原虫及锥虫等,并发挥重要的抗感染作用。目前为止,关于贾第虫激活宿主TLRs的研究较少,TLRs在贾第虫病致病过程中的作用和机制尚未阐明。本研究将通过对贾第虫病毒对贾第虫形态、生长发育的影响及其分子基础进行分析,对TLRs介导天然免疫应答在贾第虫致病过程中的作用及机制进行研究,以期阐明宿主抗贾第虫天然免疫应答作用机制,为贾第虫病的防治提供理论基础。TLR2受体介导天然免疫应答在贾第虫致病过程中的作用及机制。通过荧光定量方法检测贾第虫对宿主巨噬细胞TLR2的激活,结果表明贾第虫能够激活TLR2;通过Western blot和ELISA方法分别检测贾第虫对宿主巨噬细胞信号通路的激活及细胞因子的分泌,结果表明,贾第虫能够依赖于TLR2激活P38、ERK和AKT信号通路,并且通过TLR2-AKT信号通路显着抑制TNF-α、IL-12p40、IL-6的分泌;通过动物试验研究TLR2在贾第虫感染过程中的作用,结果表明,贾第虫感染宿主后能够通过激活TLR2-AKT信号通路抑制IL-12 p40等细胞因子的分泌,使小鼠肠道内滋养体增加,肠道病变加重,导致更为严重的贾第虫病。TLR3受体介导天然免疫应答在贾第虫致病过程中的作用及机制。首先,我们用贾第虫病毒感染无病毒株贾第虫构建了新的VIG虫株。通过荧光定量方法检测不同虫株贾第虫对宿主巨噬细胞TLR3的激活,结果表明TLR3能够识别携病毒株和VIG株而不能识别无病毒株,进一步分析表明TLR3能识别前两者中的贾第虫病毒ds RNA;通过ELISA方法检测不同虫株贾第虫对宿主巨噬细胞信号通路的激活及细胞因子的分泌,结果表明,携病毒株和VIG株通过激活TLR3信号通路引起的细胞因子分泌显着多于无病毒株,进一步分析表明,贾第虫病毒ds RNA也通过激活TLR3信号通路引起的细胞因子分泌;通过动物试验研究TLR3在不同虫株贾第虫感染过程中的作用,结果表明,携病毒株和VIG株贾第虫相对于无病毒株贾第虫,感染宿主后能够通过激活TLR3信号通路提高TNF-α、IL-6及IL-12 p40的分泌,使小鼠肠道内滋养体减少,肠道病变减轻,导致较轻的贾第虫病。贾第虫病毒对贾第虫形态、生长发育的影响及其分子基础。通过扫描电镜和透射电镜对病毒感染后滋养体形态及超微结构观察,结果表明,病毒感染无病毒滋养体出现尾部结节,结节内包含糖原和病毒样粒子。通过对不同虫株滋养体增殖和体外诱导成囊率进行统计分析,结果表明,携病毒株和VIG株滋养体相对于无病毒株增殖更快,而诱导成囊率更低。通过RNA-seq方法对VIG株和无病毒株贾第虫进行转录组测序分析,结果发现,贾第虫病毒感染后能够通过调控贾第虫滋养体糖代谢信号通路影响贾第虫的增殖和成囊。综上所述,本研究发现贾第虫能够激活宿主TLR2-AKT信号通路,抑制促炎性细胞因子的分泌,导致野生型小鼠较严重的贾第虫病。携病毒株和VIG株激活TLR3信号通路,增加促炎性细胞因子的分泌,引起野生型小鼠较轻的贾第虫病。进一步研究表明TLR3识别的分子是贾第虫病毒ds RNA,而且贾第虫病毒能够通过糖代谢通路影响贾第虫生长发育。以上结果显示贾第虫通过激活宿主TLR2逃避免疫攻击,通过激活宿主TLR3发挥抗贾第虫感染作用,从而揭示了贾第虫致病的新机制。

于利利^[4]（2018）在《贾第虫α-15-贾第素蛋白免疫荧光定位及两种虫株表达差异研究》文中认为十二指肠贾第鞭毛虫（Giardia duodenalis）属于全球范围内的寄生虫。在亚洲、非洲、拉丁美洲每年大约2亿人感染贾第虫,并且表现出一定的临床症状。因为具有人畜共患性,现已列入全世界危害人类健康的10种主要寄生虫病之一。贾第虫主要是通过排出具有感染性的包囊,使得其他宿主经消化道引起感染,能引起腹泻、头晕、体重减轻。宿主范围广泛,感染人、猴子等灵长类,牛、羊、猪等家畜,鸽子、鹦鹉等鸟类,犬、猫等伴侣动物、狐狸、老虎等野生动物在内的多种脊椎动物,此外,贾第虫还可感染鱼、两栖动物、爬行动物、啮齿动物。经国内外报道,随着旅游业的发展,贾第虫也成为了旅行者腹泻的常见致病原。因此,作为重要的人畜共患病原体,贾第虫在受到越来越高的关注。细胞骨架是真核生物特有的特征之一,贾第虫作为最原始的真核生物,多种多样的细胞骨架蛋白是令人震惊的,贾第素就属于贾第虫中含量丰富的骨架蛋白,与贾第虫的吸附、入侵及感染有着密不可分的关系。同时,它也成为了人们研究真核生物的模型。贾第虫分为携病毒株和无病毒株滋养体,贾第虫病毒是专性存在于贾第虫体内的一种双链RNA病毒,贾第虫病毒能感染无病毒株,虽然国内外对于贾第虫的流行病学调查研究很多,但是对贾第虫病毒的研究却不多,其感染过程及对无病毒株的影响都研究甚少,具体机理都不清楚。贾第虫病毒具有感染性,感染5×105不会影响虫体的正常状态。因此,近年来,贾第虫病毒作为载体的用途越来越广泛。贾第虫病毒及他的外转录体都具有感染性。衣壳蛋白是主要的表达蛋白。贾第虫病毒感染无病毒株滋养体,引起虫体蛋白质的变化以及其他物质的变化都还不清楚。α贾第素作为贾第虫重要的骨架成分,在与贾第虫病毒之间应该会有某种关系。本研究根据GenBank中α-15-giardin序列设计引物,培养贾第虫至满瓶,进行收集虫体及提取了总RNA,反转录得到cDNA。以cDNA为模板扩增α-15-giardin基因,成功构建了大肠杆菌重组表达质粒pGEX-4T-α-15,将其转化到感受态细胞BL21。经IPTG诱导进行pGEX-4T-α-15融合蛋白的原核表达。通过SDS-PAGE实验分析其表达形式,利用切胶法获得较纯的融合蛋白。将纯化的蛋白进行免疫小鼠,制备了多克隆抗体,对α-15-贾第素蛋白在贾第虫中进行定位,然后在携病毒株与无病毒株滋养体进行α-15-贾第素蛋白的荧光相对定量PCR检测,以及将携病毒株和无病毒株滋养体进行总蛋白的提取,用制备的多抗作为一抗进行Western Blot试验。通过免疫小鼠,获得了效价高达1:51200、特异性高的免疫血清。荧光定位试验结果发现其位于贾第虫的细胞质,靠近细胞质膜的部位多一些,腹吸盘的位置几乎没有分布。荧光相对定量PCR试验结果为α-15-贾第素蛋白在携病毒株滋养体中mRNA表达量是无病毒株的滋养体表达量的8-10倍。Western Blot试验结果与mRNA表达结果一致,α-15-贾第素蛋白在携病毒株滋养体中蛋白表达量高于无病毒株的滋养体表达量。此研究对于α-15-贾第素蛋白在贾第虫体内的作用及贾第虫病毒与贾第素之间的关系、对贾第虫新药靶点的开发和贾第虫的诊断预防具有重要意义。

宫鹏涛^[5]（2016）在《贾第虫病毒microRNA克隆及功能研究》文中研究指明贾第虫是一个原始的真核生物,同时也是一个重要的人兽共患病病原,具有重要的进化生物学研究价值,贾第虫作为模式生物仍然有很多问题需要解决。贾第虫病毒是由一个线形的末端开放的7.0 Kb ds RNA和100 KDa的衣壳蛋白组成。microRNA是由内含子或编码基因间隔区的RNA基因编码的,长度大小为18-24个碱基的小分子RNA,能通过与靶m RNA特异性的碱基配对引起靶m RNA的降解或抑制其翻译,从而对基因进行转录后的表达调控。但对于贾第虫病毒是否存在microRNA尚不清楚。本研究通过Solexa高通量测序及生物信息学分析结合VMIR软件预测,初步确定5条贾第虫病毒候选非编码小RNA,利用RT-PCR、Northern杂交、Dicer酶切割、荧光定量PCR等方法验证贾第虫病毒一条小RNA为贾第虫病毒的microRNA,命名为GLV microRNA1,其大小为22nt,尤为重要的是其位于pol蛋白编码区,这也是目前所发现的第一条原虫病毒的microRNA。荧光原位杂交试验显示贾第虫病毒GLV microRNA1确实存在,且定位在细胞质中,符合经典的microRNA定位。贾第虫病毒microRNA功能研究通过knock-down GLV MicroRNA1,荧光定量PCR检测发现抑制GLV microRNA1后,贾第虫病毒拷贝数增长30%左右,表明GLV microRNA1能有效控制贾第虫病毒的拷贝数。流式细胞术和激光共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜也显示,转染GLV microRNA1组贾第虫滋养体的数量及亮度均明显下降,而转染反义GLV microRNA1组贾第虫滋养体的数量及亮度均明显上升。但GLV microRNA1对贾第虫形态和生长曲线等尚未发现有明显的影响。双荧光素酶报告试验测定表明GLV microRNA1的靶标gag-pol的3’UTR发挥重要作用,同时其作用方式为切割靶序列。GLV microRNA1是目前发现的第一条位于基因的编码区域的microRNA。该发现可能进一步拓宽了人们对非编码RNA的生成方式认知,即m RNA可能需要在编码小RNA和翻译蛋白质之间有一个平衡,这种平衡可能是基因表达调控的一种新方式。

信彩岩^[6]（2016）在《斯氏艾美耳球虫dsRNA病毒全基因组序列测定及其转染载体的构建》文中研究说明兔球虫病是由艾美耳属的多种球虫所引起的严重危害养兔业的一种寄生性原虫病。在国内目前已报道的17种兔球虫中,斯氏艾美耳球虫（Eimeria stiedai）的致病力最强且危害最大,寄生于兔胆管上皮细胞,可引起严重的肝球虫病。当前对于兔球虫病的控制主要是依靠化学药物,然而随着球虫耐药性和药物残留等问题的出现,使抗球虫药物难以从根本上解决球虫的威胁。究其原因是缺乏对兔球虫细胞和分子生物学特性的了解。斯氏艾美耳球虫病毒的发现为兔球虫分子生物学特性的研究提供了新的方向。原虫病毒是ds RNA病毒（Double-stranded RNA viruses）,属于全病毒科,在许多寄生性原虫内发现了病毒的存在,例如,贾第虫、阴道毛滴虫、利什曼原虫及艾美耳属球虫。研究表明,利什曼原虫病毒可以通过激活宿主的TRL3信号通路,促进利什曼原虫的持久性感染。另外,还有一些研究表明,ds RNA病毒能够增加原虫的致病性。此外,病毒RNA介导的转染载体已经在蓝氏贾第虫中实现了基因表达调控和蛋白功能的研究。虽然,病毒样粒子已在斯氏艾美耳球虫中发现,但尚无关于斯氏艾美耳球虫病毒的全基因组序列和分类的报道。本研究首次对斯氏艾美耳球虫病毒基因组序列进行了克隆、测序及分析,并构建了斯氏艾美耳球虫病毒转染载体。本研究为了解兔球虫的分子生物学特性提供了新思路。斯氏艾美耳球虫病毒全长c DNA的克隆及序列分析:根据已知病毒的保守序列设计简并引物,通过RT-PCR及SMART RACE技术成功获得了斯氏艾美耳球虫病毒基因组的全长序列。测序结果显示,病毒基因组全长为6219 bp,包含两个开放阅读框,且在两个开放阅读框的交界处存在四个碱基的转换片段（AUGA）。ORF1长为2400 bp,编码病毒衣壳蛋白（799个氨基酸）;ORF2长为3303 bp,编码病毒RNA依赖的RNA聚合酶（1100个氨基酸）。BLASTp分析发现斯氏艾美耳球虫病毒与E.tenella RNA virus 1（Et RV1）的氨基酸序列同源性最高。斯氏艾美耳球虫病毒基因组具有全病毒科的典型特征,可认定为全病毒科的一个新种。斯氏艾美耳球虫病毒序列的生物信息学分析:将获得的Es RV基因组序列和Totiviridae病毒科的病毒序列进行多重序列比对后,构建进化树。进化树分析显示,Es RV、Et RV1及Eb RV1形成一个独立的分支,而与其它的原虫病毒距离较远,因此应将Eimeriaviruses划分为Totiviridae家族的一个新属。密码子偏好性分析表明真菌病毒比原虫病毒具有更高的宿主适应性,而原虫病毒中的GLV和Et RV1的宿主适应性远超其它原虫病毒。通过Cp G岛和启动子区域预测,显示在coat和Rd Rp编码框上游具有独立启动子。Rd Rp蛋白结构预测显示,具有palm,fingers和thumb结构域。斯氏艾美耳球虫不同发育阶段病毒蛋白的表达研究:从感染斯氏艾美耳球虫不同时期的兔肝脏中收集斯氏艾美耳球虫裂殖子、配子体及未孢子化卵囊,体外进行孢子化孵育后,收集斯氏艾美耳球虫孢子化卵囊,分别提取m RNA和蛋白样品。对提取的样品进行RT-PCR和Western blot分析。结果显示,Rd Rp蛋白在斯氏艾美耳球虫的四个不同发育阶段均可以表达;而coat蛋白仅在斯氏艾美耳球虫卵囊形成及孢子化阶段的虫体内表达。斯氏艾美耳球虫病毒载体的构建:以斯氏艾美耳球虫病毒基因组序列为基础,参照相关病毒载体的构建策略,将绿色荧光蛋白（GFP）作为报告基因替换斯氏艾美耳球虫病毒部分序列,构建斯氏艾美耳球虫病毒载体。通过电穿孔技术将构建的斯氏艾美耳球虫病毒载体转入未孢子化的斯氏艾美耳球虫卵囊内。通过激光共聚焦扫描、流式细胞术和Western blot检测,研究表明报告基因GFP在斯氏艾美耳球虫传代的第二代和第三代虫体中均得到表达。综上所述,本研究对了解斯氏艾美耳球虫病毒的基础特征及研发斯氏艾美耳球虫的基因操作工具,具有重要的意义,同时斯氏艾美耳球虫病毒载体的构建为研究球虫细胞和分子生物学特性奠定了重要基础。

武斌^[7]（2016）在《柔嫩艾美耳球虫病毒全基因组序列测定及转染载体的构建》文中研究表明鸡球虫病是由艾美耳属球虫寄生在鸡肠道引起的全球性原虫病,每年在世界范围内因鸡球虫病造成的经济损失可达8亿美元。目前对鸡球虫病的防治主要依赖化学药物,但近年来,鸡球虫耐药性的不断增强以及人们对药物残留危害的逐步重视,使化学药物的应用受到极大限制。此外弱毒活疫苗存在毒力返强及扩大感染的风险,同时鸡球虫病原组成种类繁多,活疫苗生产和监测等环节复杂,使其预防效果也不尽理想。近年来基因工程鸡球虫疫苗成为研究热点,然而并未在实际生产中得到应用。造成这些问题的根本原因是对鸡球虫的生物学特性不明确,因此进行鸡球虫分子生物学研究、应用有效的基因工程技术对鸡球虫进行基因操作已成为现代鸡球虫病防治的重要研究方向。寄生性原虫双链RNA病毒（ds RNA viruses）已经在阴道毛滴虫、蓝氏贾第虫、利什曼原虫等寄生性原虫中发现。本研究在长春地区病鸡盲肠分离得到的柔嫩艾美耳球虫虫株中（Et611株）经试验发现,存在一种双链RNA病毒类似颗粒（直径约30纳米）,并首次测定该病毒基因组序列,在此基础上又构建了柔嫩艾美耳球虫病毒转染载体。本研究内容为鸡球虫分子生物学特征研究提供了新的思路。柔嫩艾美耳球虫病毒全基因组测序通过三步测序法进行柔嫩艾美耳球虫病毒基因组测序,测定了新发现的ds RNA病毒基因组序列。测序结果显示,病毒基因组全长6006bp,包含两个开放阅读框（ORF1长度为2367bp,ORF2长度为3216bp）,同时在两个开放阅读框的交界处存在五碱基长度的转换片段（UGA/UG）。BLASTp分析显示,柔嫩艾美耳球虫病毒与布氏艾美耳球虫病毒氨基酸序列最为接近。该病毒具有全病毒科的各项特征,可认定该病毒为全病毒科的一个新种。本研究测定的柔嫩艾美耳球虫病毒基因组是该病毒基因组的首次测定,依据国际病毒分类委员会的病毒命名规则,将此病毒暂命名为E.tenella RNA virus 1（Et RV1）。柔嫩艾美耳球虫病毒蛋白不同时期的表达通过对感染柔嫩艾美耳球虫的鸡盲肠上皮组织（速殖子）、未孢子化卵囊、孢子化卵囊的m RNA和蛋白样品分别进行RT-PCR和Western Blotting分析。结果显示Rd Rp蛋白在球虫的三个不同时期内,都获得了表达;而coat蛋白仅在球虫孢子化过程中表达。柔嫩艾美耳球虫病毒分子进化分析为了进一步对该病毒进行研究,对测得的Et RV1基因组序列和Totiviridae病毒科的全部病毒序列进行多重序列比对和进化树构建。分析结果表明,柔嫩艾美耳球虫病毒和布氏艾美耳球虫病毒与真菌病毒同聚类于Victorivirus属,而与其它的原虫病毒距离较远,不在同一分支上,因此艾美耳球虫病毒应划分为一个新亚属（Eimeriaviruses subgenus）。球虫病毒与宿主呈现整体协同进化关系。通过启动子区域预测,强烈显示Rd Rp编码框上游具有独立启动子。柔嫩艾美耳球虫病毒转染载体构建在柔嫩艾美耳球虫病毒序列的测定及病毒蛋白表达时期的研究的基础上,构建了柔嫩艾美耳球虫病毒载体。将绿色荧光蛋白（e GFP）和红色荧光蛋白（RFP）作为报告基因连缀于病毒序列中。使用电穿孔技术将含有报告基因的双链RNA载体转入柔嫩艾美耳球虫未孢子化卵囊。经流式细胞术分选纯化可发荧光的柔嫩艾美耳球虫,并接种雏鸡,进行体内增殖传代。通过流式细胞术、免疫印记和激光共聚焦扫描试验,结果表明报告基因GFP、RFP和RFP-GFP在柔嫩艾美耳球虫传代的第二代到第四代虫体中均得以表达。柔嫩艾美耳球虫表达荧光蛋白的总体比例稳定于60%左右。柔嫩艾美耳球虫病毒转染载体的构建为柔嫩艾美耳球虫分子生物学研究奠定了基础。

田甜^[8]（2013）在《贾第虫组织蛋白酶B基因干扰对虫体生长和贾第虫病毒mRNA的影响》文中研究指明贾第虫是一种单细胞真核微生物，其感染引起人兽共患贾第虫病，该病呈世界性分布。贾第虫主要寄生于包括人在内的哺乳动物、鸟类以及两栖类等动物。近年来，贾第虫被认为是一种机会致病性原虫。贾第虫病毒为专性寄生在贾第虫体内的dsRNA病毒，由它改造后的载体系统已成功应用于基因表达和基因结构与功能分析等领域。微型核酶分子质量小，易于设计合成，可应用于体外和体内对目的RNA的切割，被认为是基因干扰的工具之一。本课题组已利用iTRAQ技术，比较分析犬贾第虫携病毒株滋养体与无病毒株滋养体的差异蛋白，找到了差异蛋白-组织蛋白酶B。本研究在此基础上研究组织蛋白酶B对贾第虫虫体生长和贾第虫病毒mRNA的影响。本研究应用RNAdraw软件对贾第虫组织蛋白酶B基因序列二级结构进行模拟分析，按照微型核酶设计原则，选取合适的核酶切割位点，设计微型核酶，构建含贾第虫组织蛋白酶B基因短反义序列和长反义序列的微型核酶嵌合型犬贾第虫病毒重组质粒。本研究将微型核酶嵌合型犬贾第虫病毒重组质粒线性化后体外转录为mRNA，然后用微型核酶体外切割组织蛋白酶B基因转录体，采用荧光定量PCR检测体外切割效率。结果表明，设计合成的针对于组织蛋白酶B基因的微型核酶CRzS和CRzL对组织蛋白酶B基因转录体切割效率显着，分别达到75.42%和83.14%，而PCB对组织蛋白酶B基因的mRNA的影响较小，RT-PCR效率仅降低了23.0%，GRzL的切割效率为0.02%。表明犬贾第虫病毒介导的微型核酶可有效切割贾第虫组织蛋白酶B基因转录体，为体内切割试验奠定了基础。本研究通过体外转录体电穿孔的方法将核酶嵌合型犬贾第虫病毒载体CRzS和CRzL分别导入贾第虫体内，通过微型核酶来特异切割贾第虫虫体内组织蛋白酶B基因mRNA，采用荧光定量PCR方法检测体内切割效率。结果表明，微型核酶CRzS和CRzL在体内对组织蛋白酶B基因mRNA切割效率分别可达到为73.5%和88.5%。本研究首次通过体外转录体电穿孔的方法将核酶嵌合型犬贾第虫病毒载体CRzS和CRzL分别导入贾第虫体内，通过微型核酶来特异切割贾第虫虫体内组织蛋白酶B基因mRNA后，经虫体计数观测虫体的生长情况及应用荧光定量PCR方法检测贾第虫病毒衣壳蛋白基因mRNA和RDRP酶基因mRNA变化。结果表明，组织蛋白酶B基因干扰后，转染微型核酶CRzS、CRzL的滋养体生长速率降低，显着低于对照组，经SPSS13.0统计软件的方差分析指出，差异显着（p<0.05）。表明贾第虫组织蛋白酶B是虫体生长相关因子。通过分别对转染后1d,7d,14d,21d的贾第虫病毒进行了定量分析，对照组犬贾第虫病毒RDRP酶基因mRNA和衣壳蛋白基因mRNA基本保持不变，微型核酶CRzL、CRzS组的RDRP酶基因mRNA持续减少，与对照组相比减少达91%，82%。微型核酶CRzL、CRzS组的衣壳蛋白基因mRNA也持续减少，与对照组相比减少达94%，82%。表明贾第虫CB蛋白是贾第虫病毒复制相关分子。

李凌丹^[9]（2012）在《犬贾第虫不同虫株及发育阶段的比较蛋白质组学研究》文中指出贾第虫病（giardiosis, giardiasis）是由贾第虫引起的一种以腹泻为主要症状的肠道疾病。呈世界性分布，已被列为危害人类健康的10种主要寄生虫病之一。目前，尚无防治本病的特效方法，究其原因是对其细胞以及分子生物学特性缺乏详尽的了解。贾第虫的生活史包括包囊期和滋养体期。在体外，其以包囊形式存在，对外界抵抗力强。目前，国内外的研究学者主要从结构基因组学进行贾第虫成囊机制的研究，发现了许多与成囊相关的基因，但是成囊机制尚不清楚，而专性寄生于贾第虫体内病毒的发现使其变得更加复杂。研究发现：病毒感染可以引起虫体亚细胞结构的改变，大量病毒感染甚至会终止虫体的生长。目前，贾第虫病毒的研究主要集中于病毒载体的构建及其应用于贾第虫基因功能的研究，而病毒生活周期的研究相对较少。贾第虫病毒生活周期的研究为贾第虫分子生物学，细胞生物学以及贾第虫病毒与宿主的关系研究提供了新的方向。蛋白质组学是目前研究寄生虫的生长、发育、开发疫苗和药物的有利工具。比较蛋白质组学是蛋白质组学的重要研究策略。它用现代先进技术比较不同生物体在不同时刻或不同状态的蛋白质表达的变化，对于了解疾病的进展和发病机理意义重大。近年来现代技术的发展使广大学者更加热衷于比较蛋白质组学研究。 iTRAQ （isobaric tag for relative and absolutequantitation）技术是一种新的、功能强大的可以同时对四种样品进行绝对和相对定量研究的方法，以其良好的精确性和重复性而普遍被广大学者接受。因此，本研究利用iTRAQ方法对犬贾第虫不同虫株及发育阶段进行比较蛋白质组学。犬贾第虫携病毒株滋养体和无病毒株滋养体的比较蛋白质组学研究。本研究利用iTRAQ方法共鉴定出蛋白质311个，其中差异倍数大于1.2倍以上的蛋白质共58个，已知贾第虫蛋白质为37个。以犬贾第虫无病毒株滋养体为对照，犬贾第虫携病毒株滋养体中表达量上调的为15种，表达量下调的为22种。这些差异性的蛋白质包括细胞骨架蛋白，酶类，转录因子等。随后利用RT-qPCR方法检测了可能与病毒周期相关的差异蛋白α-11贾第素，激酶和转录延伸因子的mRNA水平，并利用病毒载体介导的核酶分别抑制其在犬贾第虫携病毒株滋养体中的表达。结果发现三种差异蛋白mRNA水平的差异与蛋白质水平相似；基因表达被抑制后，犬贾第虫病毒的拷贝数显着减少（P<0.01），但是其减少形式各不相同。当α-11贾第素蛋白表达被抑制后，犬贾第虫病毒水平以不规则形式下降；转录延伸因子表达被抑制后，犬贾第虫病毒以持续性下降的形式存在；激酶表达被抑制后，犬贾第虫病毒的拷贝数在转染后第2天就下降了95%，并持续处于低下水平。表明这三种蛋白参与了贾第虫病毒的生活周期，其病毒感染机制可能与呼肠孤病毒相似，即首先与具有膜联蛋白性质的α-11贾第素连接形成复合体，然后在激酶的作用下进入虫体，并且在转录延伸因子的作用下复制。同时发现，这三种蛋白表达被抑制后犬贾第虫滋养体的生长速率也明显降低（P<0.05）。由此可见，该三种蛋白是犬贾第虫病毒生活周期以及犬贾第虫滋养体生长的关键因子。犬贾第虫携病毒株滋养体和包囊的比较蛋白质组学研究。利用iTRAQ方法共获得蛋白质143种，其中已知贾第虫蛋白质63种，差异倍数大于1倍的蛋白质为16种，已知贾第虫蛋白为7种。在包囊中表达量上调的为3种，表达量下调的为4种。这些蛋白中鸟氨酸氨甲酰转移酶，β-微管蛋白的表达与先前报道结果一致，在犬贾第虫包囊中表达量都上调。然而α-微管蛋白却相反，在包囊中表达量下降。精氨酸亚基在本研究中未出现差异性表达。另外，也发现了新的差异蛋白，如三磷酸甘油醛脱氢酶（gap1），表面可变蛋白等。利用RT-qPCR方法检测了其中4种差异蛋白（鸟氨酸氨甲酰转移酶、α-微管蛋白、gap1、表面可变蛋白）的mRNA水平，结果其差异水平与蛋白质水平相一致。同时利用病毒载体介导的核酶抑制了gap1基因在犬贾第虫携病毒株滋养体中的表达，并对滋养体的生长以及体外诱导成囊过程进行观察。结果滋养体的生长速率显着低于对照组（P<0.05），同时虫体形态变圆。但是其体外诱导成囊率以及包囊蛋白2的免疫定位并没有显着差异。结果表明gap1是犬贾第虫生长的关键性因子，并对保持犬贾第虫滋养体的形态至关重要。本研究为贾第虫的成囊机制研究、新的药物靶点、以及贾第虫病的诊断与防治奠定基础。综上所述，成功的获得了犬贾第虫携病毒株滋养体和无病毒株滋养体，以及犬贾第虫携病毒滋养体和包囊的差异蛋白表达谱，同时筛选到了与滋养体的生长以及病毒生活周期相关的关键性蛋白。

曲晗^[10]（2012）在《斯氏艾美耳球虫病毒的鉴定及特性研究》文中研究说明兔球虫病是由艾美耳属球虫引起的寄生性原虫病。能感染家兔的球虫共有17种，其中斯氏艾美耳球虫（Eimeria stiedai）是寄生在胆管上皮细胞内，因其致病性最强及寄生部位的特殊性，而引起了学者的普遍关注。其分子生物学和细胞生物学特性了解不够清楚，导致尚无有效的防治方法。球虫病毒的发现为球虫的特性研究提供了新的方向。斯氏艾美耳球虫病毒样粒子早在1989年就有报道[1]，但在当时并未受到重视，只是观察到了病毒样粒子存在，并未对其进行进一步的研究，也并未在分类学上有正式的归属。目前在国内此方面的研究尚属空白。本试验对斯氏艾美耳球虫卵囊内病毒样粒子进行研究，为球虫病的有效防治及斯氏艾美耳球虫的细胞和分子生物学特性等方面的探究提供新的思路。携病毒斯氏艾美耳球虫虫株的分离筛选：本研究采用临床收集兔球虫卵囊经人工感染幼兔，从肝脏中分离纯化得到一株斯氏艾美耳球虫球虫株。通过光学显微境观察其卵囊平均大小为21.5μm×19.2μm，壁光滑，无卵囊残体有四个孢子囊，均呈长椭圆形。进一步经RT-PCR鉴定，说明该球虫虫株为斯氏艾美耳球虫虫株。通过提取其孢子化卵囊的总核酸进行琼脂糖电泳分析，发现除该球虫基因组外还存在一条6.5kb的核酸带，初步鉴定该虫株为携病毒斯氏艾美耳球虫虫株。斯氏艾美耳球虫病毒的鉴定本试验通过对其进行核酸酶的敏感性试验及高盐（0.3M NaCl）保护性试验证明该病毒的遗传物质为双链RNA（dsRNA）。通过采用α-32P-UTP掺入法检测到斯氏艾美耳球虫病毒样颗粒具有RNA依赖性RNA聚合酶（RDRP）活性。通过对该球虫孢子化卵囊粗提液进行蔗糖密度梯度离心及电镜观察到斯氏艾美耳球虫病毒样粒子呈球形，二十面体对称结构，无囊膜，直径为35nm。斯氏艾美耳球虫病毒基因组部分cDNA序列测定本试验通过DNA酶消化DNA及利用高盐保护原理在高盐缓冲液中用RNaseA对单链RNA进行消化以达到纯化dsRNA的目的。以纯化后的dsRNA为模板，锚定随机引物为引物进行反转录，以该锚定序列为引物，进行单引物PCR。将PCR回收产物连接到pMD-18T载体上进行测序。测序结果经BLAST X在线比对，结果显示有763bp与鹑鸡疱疹病毒2型（Gallid herpesvirus2）编码衣壳蛋白的基因同源率为40.8%，推测为斯氏艾美耳球虫病毒基因组中编码衣壳的核酸序列。

二、寄生虫蓝氏贾第虫体内有病毒粒子（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、寄生虫蓝氏贾第虫体内有病毒粒子（论文提纲范文）

（1）基于贾第素α-12的贾第虫荧光标记方法和PCR检测方法的建立及应用（论文提纲范文）

（2）寄生性原虫病毒研究进展（论文提纲范文）

（3）TLRs介导的天然免疫应答在贾第虫致病中的作用及机制（论文提纲范文）

（4）贾第虫α-15-贾第素蛋白免疫荧光定位及两种虫株表达差异研究（论文提纲范文）

（5）贾第虫病毒microRNA克隆及功能研究（论文提纲范文）

（6）斯氏艾美耳球虫dsRNA病毒全基因组序列测定及其转染载体的构建（论文提纲范文）

（7）柔嫩艾美耳球虫病毒全基因组序列测定及转染载体的构建（论文提纲范文）

（8）贾第虫组织蛋白酶B基因干扰对虫体生长和贾第虫病毒mRNA的影响（论文提纲范文）

（9）犬贾第虫不同虫株及发育阶段的比较蛋白质组学研究（论文提纲范文）

（10）斯氏艾美耳球虫病毒的鉴定及特性研究（论文提纲范文）

四、寄生虫蓝氏贾第虫体内有病毒粒子（论文参考文献）

• [1]基于贾第素α-12的贾第虫荧光标记方法和PCR检测方法的建立及应用[D]. 李昕彧. 吉林大学, 2020(08)
• [2]寄生性原虫病毒研究进展[J]. 赵权,蔡亚楠,张媛. 吉林农业大学学报, 2018(04)
• [3]TLRs介导的天然免疫应答在贾第虫致病中的作用及机制[D]. 李新. 吉林大学, 2018(12)
• [4]贾第虫α-15-贾第素蛋白免疫荧光定位及两种虫株表达差异研究[D]. 于利利. 东北农业大学, 2018(02)
• [5]贾第虫病毒microRNA克隆及功能研究[D]. 宫鹏涛. 吉林大学, 2016(03)
• [6]斯氏艾美耳球虫dsRNA病毒全基因组序列测定及其转染载体的构建[D]. 信彩岩. 吉林大学, 2016(03)
• [7]柔嫩艾美耳球虫病毒全基因组序列测定及转染载体的构建[D]. 武斌. 吉林大学, 2016(08)
• [8]贾第虫组织蛋白酶B基因干扰对虫体生长和贾第虫病毒mRNA的影响[D]. 田甜. 吉林大学, 2013(12)
• [9]犬贾第虫不同虫株及发育阶段的比较蛋白质组学研究[D]. 李凌丹. 吉林大学, 2012(03)
• [10]斯氏艾美耳球虫病毒的鉴定及特性研究[D]. 曲晗. 吉林大学, 2012(09)

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