一、RNA干扰在肝病治疗研究中的进展（论文文献综述）
马可[1]（2021）在《TGR5在胆盐引起的肝内胆管结石病肝内胆管纤维化中的作用及机制初探》文中进行了进一步梳理目的:明确TGR5对肝内胆管结石胆管纤维化的影响,并探讨其可能的信号转导分子机制。方法:1、收集20例肝内胆管结石患者和20例非结石良性肝病患者的肝脏标本。使用HE染色、Masson染色评估肝内胆管结石患者与非结石良性肝病患者的肝脏病理学变化和纤维化差异。2、使用免疫荧光、Western blot、RT-qPCR技术检测肝内胆管结石患者与非结石良性肝病患者肝脏TGR5受体的表达。3、构建TGR5过表达慢病毒载体和沉默TGR5慢病毒载体,分别转染人肝内胆管上皮细胞（HIBEC）构建过表达TGR5的HIBEC稳转细胞株和沉默TGR5的HIBEC稳转细胞株。通过RT-qPCR和Western blot技术验证TGR5过表达和沉默效果。4、分别用含100μM和200μM牛磺脱氧胆酸（TDCA）的完全培养基培养HIBEC 12小时和24小时后提取细胞总蛋白,使用Western blot技术检测TDCA对TGR5的激活效果。5、将HIBEC分为以下几组:空白对照组、阳性对照组（TDCA）、TGR5过表达组（TDCA+HIBEC-TGR5）、TGR5沉默组（TDCA+HIBEC-sh-TGR5）。TDCA处理时间根据方法4的实验结果选取100μM处理12小时。使用RT-qPCR和WB技术验证纤维化相关分子转化生长因子β1（TGFβ1）、纤维连接蛋白（FN）和Ⅳ型胶原（Col-Ⅳ）的表达水平以及c AMP反应元件结合蛋白（CREB）的磷酸化的差异。结果:1、HE染色显示:非结石良性肝病患者肝脏组织肝小叶结构完整,肝细胞排列整齐,可见少量炎性因子浸润。肝内胆管结石患者的肝细胞重度变性、坏死,肝窦扩张伴有胆汁淤积;门管区炎细胞浸润,包含中性粒细胞和淋巴细胞等;胆管周围结缔组织增生明显,呈轮辐状。2、Masson染色结果:肝内胆管结石组的蓝染胶原面积占比显着高于非结石良性肝病组（P<0.01）。3、免疫荧光检测肝内胆管结石中TGR5表达结果:肝内胆管结石患者的肝脏中TGR5的表达量显着高于非结石良性肝病患者（P<0.001）。4、RT-qPCR检测肝内胆管结石中TGR5 mRNA表达结果:肝内胆管结石患者的肝脏中TGR5 mRNA的表达显着高于非结石良性肝病患者（P<0.01）。5、WB检测肝内胆管结石中TGR5蛋白水平表达结果:肝内胆管结石患者的肝脏中TGR5蛋白水平的表达显着高于非结石良性肝病患者（P<0.01）。6、TDCA处理HIBEC后TGR5表达显着高于未经TDCA处理的对照组（P<0.05,P<0.01）。在浓度为100μM的TDCA处理12小时处,TGR5受体的表达相对较高。7、RT-qPCR和WB检测结果:TDCA处理HIBEC后增加了TGFβ1、FN和Col-Ⅳ的表达（P<0.05,P<0.01）。与阳性对照组相比,过表达TGR5后进一步增加了TGFβ1、FN和Col-Ⅳ的表达水平（P<0.05,P<0.01,P<0.001）。沉默TGR5后,TGFβ1、FN和Col-Ⅳ的表达水平显着降低（P<0.05,P<0.01,P<0.001）。8、WB检测CREB的磷酸化水平:TDCA增加了CREB的磷酸化水平（P<0.01）。过表达TGR5使CREB磷酸化水平进一步增加（P<0.01）。沉默TGR5后显着降低了CREB的磷酸化水平（P<0.05,P<0.01）。结论:TGR5在肝内胆管结石患者的肝脏中高表达。胆盐通过激活TGR5促进了肝内胆管纤维化,这一过程可能与TGR5促进CREB的磷酸化有关。
宋远[2]（2021）在《穿心莲内酯对酒精性肝损伤保护作用的研究》文中提出背景酒精性肝损伤是由于酒精所致肝细胞功能受损的动态病理过程,随着其病理变化过程的加重,酒精性肝损伤可逐渐形成酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝硬化,甚至肝细胞癌等酒精性肝病,进而导致较为严重的临床结局。目前,酒精性肝损伤发生发展过程的分子机制尚不完全清楚,也无明确的治疗靶点。从流行病学角度看,由过量饮酒所致酒精性肝病的患病率存在明显的地域差异,目前尚无全国性统计数据,如有研究报道辽宁省部分城市酒精性肝病的患病率为6.10%,高于浙江省的4.34%。目前临床上治疗酒精性肝损伤的药物主要包括:糖皮质激素、抗氧化剂、营养补充剂、中药以及天然活性成分、抗体类药物等,药物治疗费用不一,且疗效报道也存在争议。目前明确酒精性肝损伤的病理进程和分子机制以及探索有效的治疗药物仍是需要解决的问题。穿心莲内酯是临床常用的具有抗炎、抗病毒、免疫调节等功效的中药成分,近年来的研究报道,穿心莲内酯还可能具有保肝利胆、保护心脑血管等作用,提示药物作用可能存在某些新功效值得开发,可以产生“老药新用”的生物学效应。作者通过前期课题研究基础以及临床观察发现,穿心莲内酯可能对肝脏酶学指标的改善具有较好的效果,但其具体的作用靶点尚未被明确阐述。因此,本研究首先利用文献计量学描述穿心莲内酯与肝损伤的研究现状,同时收集并分析了某三甲医院应用穿心莲内酯的病例现状,研究探讨穿心莲内酯在临床中的应用情况;其次,本研究构建了酒精性肝损伤细胞模型和动物模型,从体外和体内两个层面对酒精性肝损伤发生发展的过程和具体的发病机制进行了实验研究,利用穿心莲内酯进行干预,探讨其对酒精性肝损伤的保护作用,从而为阐明酒精性肝损伤的发病机制和探寻新的临床治疗药物提供理论依据和实验数据。目的:（1）通过文献计量学以及分析某三甲医院应用穿心莲内酯成品药物开展临床治疗的病例情况,明确穿心莲内酯的研究热点和临床适应症以及可能的药理作用机制,为深入探寻穿心莲内酯药物在酒精性肝损伤中的应用提供研究路径。（2）分别构建酒精性肝损伤细胞模型和动物模型,应用穿心莲内酯进行干预,探讨穿心莲内酯对酒精性肝损伤保护作用的可能机制。方法:（1）以CNKI、GNBR,Drugbank,Hetionet数据库为数据来源,检索主题词为“穿心莲内酯”和“肝损伤”或“Andrographolide”和“Liver Injury”,检索时间范围为2000年1月1日-2020年12月31日,文献类型为期刊文献,提取其中的发表年份、引证关系及关键词等信息,通过自行编制的计算机代码进行可视化分析。（2）回顾性分析吉林省某三甲医院2015年1月至2019年12月期间住院治疗,且在院期间应用穿心莲内酯注射液的患者,通过方差分析、卡方检验、秩和检验等方法比较分析患者入院和出院时的血常规、肝功、肾功、血糖、血脂和血离子水平的变化情况。（3）选择健康成年雄性C57BL/6J小鼠,麻醉后,用75%酒精全身消毒放入超净工作台中,解剖小鼠,取出肝脏,制备小鼠原代肝细胞悬液并进行培养。经酒精染毒,同时应用低、中、高剂量（0.05、0.1、0.2mmol/L）穿心莲内酯进行干预,采用ELISA法检测细胞培养液中炎症相关因子的含量,q RT-PCR和Western Blot方法检测细胞内炎症相关信号通路基因和蛋白的表达变化情况。（4）选择8周龄雄性C57BL/6J小鼠,体重16-20g,随机分为空白对照组、模型组、阳性对照组、穿心莲内酯低、中、高剂量组,共六组,每组15只。空白对照组小鼠给予生理盐水灌胃,模型组小鼠给予市售高度白酒灌胃12w,阳性对照组小鼠给予高度白酒灌胃,同时给予水飞蓟宾灌胃,剂量为0.1g/kg·BW·d-1,穿心莲内酯低、中、高剂量组除给予高度白酒灌胃,同时分别给予穿心莲内酯0.05、0.1、0.2g/kg·BW·d-1灌胃。成模后,检测各组小鼠血清转氨酶、肝脏组织脂质代谢、抗氧化等各项生化指标的变化情况,同时利用q RT-PCR、Western Blot等方法检测小鼠肝组织中炎症相关信号通路基因和蛋白的表达情况。结果:（1）本研究利用文献计量学方法,以“穿心莲内酯”和“肝损伤”或“Andrographolide”和“Liver Injury”为主题词,搜集2000年以来,发表在CNKI、GNBR、Drugbank和Hetionet数据库的全部期刊文献,结果表明,在CNKI数据库中穿心莲内酯与肝损伤相关的研究共34篇,年度发文数量逐渐上升,结合外文数据库研究结果发现,穿心莲内酯与肝损伤研究的作用机制与抗炎信号通路有关。（2）本研究纳入了2015年1月至2019年12月在某三甲医院住院治疗期间应用过穿心莲内酯注射液患者的病历资料,共207例,通过比较用药前后患者血常规、肝功能、肾功能、血糖、血脂及离子水平的变化情况发现,穿心莲内酯对患者血常规指标中白细胞、单核细胞、中性粒细胞、淋巴细胞以及肝功能指标中谷草转氨酶、前白蛋白等的改善具有明显效果,而用药前后患者的肾功能、血脂及离子水平无明显变化,提示穿心莲内酯具有一定的抗炎和保护肝脏的作用。（3）酒精对体外培养的小鼠原代肝细胞具有一定的毒性作用,且呈现明显的剂量依赖性。酒精对体外培养的小鼠原代肝细胞24h毒性作用的IC50值约为400 mmol/L,且酒精可导致小鼠原代肝细胞内的炎症反应相关因子IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、NF-κB、TNF-α和CYP2E1的表达水平显着升高,而经不同浓度的穿心莲内酯干预表现对肝脏细胞的保护作用,尤以高剂量（0.2mmol/L）组作用效果最为显着。（4）本研究成功建立了小鼠酒精性肝损伤动物模型,给予8周龄雄性C57BL/6J小鼠4mg/d·kg·BW高度白酒一周后过渡至6mg/d·kg·BW灌胃共12w后,可诱导小鼠出现肝脏重量和肝脏指数增加,血清转氨酶相关指标AST、ALT和γ-GT的水平显着升高（P<0.05）;肝脏组织氧化应激指标MDA显着升高、SOD和GSH显着下降（P<0.05）;肝组织内总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）以及ROS蓄积,表明经高度白酒灌胃12w后,小鼠出现明显的肝组织损伤。（5）穿心莲内酯对小鼠酒精性肝损伤具有明显的保护作用。分别给予酒精模型组小鼠不同浓度（0.05、0.1、0.2g/kg·BW）的穿心莲内酯,结果发现,高剂量穿心莲内酯（0.2g/kg·BW）组可显着降低小鼠的肝脏重量和肝脏指数,差异具有统计学意义（P<0.05）;且高剂量穿心莲内酯组小鼠血清转氨酶AST、ALT和γ-GT水平显着低于酒精模型组,而与空白对照组和阳性对照组无明显统计学差异;穿心莲内酯中、高剂量组小鼠肝组织中脂质过氧化指标MDA水平显着低于酒精模型组,差异具有统计学意义（P<0.05）,抗氧化指标SOD和GSH水平在高剂量穿心莲内酯组显着高于模型组,与阳性对照组无明显差异;穿心莲内酯可在一定程度上有效降低酒精诱导的肝组织脂质紊乱,且以高剂量组,即0.2g/kg·BW穿心莲内酯的保护效果最为明显,高剂量组穿心莲内酯组小鼠肝组织中TC和TG水平与阳性对照组相比,无统计学差异（P>0.05）;与模型组相比,穿心莲内酯各剂量组小鼠肝脏ROS均明显下降,特别是中、高剂量组下降更加明显,差异具有统计学意义（P<0.05）,以高剂量组效果最为明显。且高剂量穿心莲内酯组小鼠肝组织ROS水平与阳性对照组无明显差异（P>0.05）。（6）从各组小鼠肝组织病理学（HE染色）结果可以看出,空白对照组和阳性对照组小鼠肝细胞大小一致,肝细胞索以小叶中央动脉为中心呈辐射状排列;胞核大呈圆形,胞浆均匀红染;胆小管细胞结构完整,未见病变。与空白对照组小鼠相比,模型组小鼠肝组织结构紊乱,肝小叶和肝索结构消失,其中有大量脂肪空泡和炎细胞浸润,肝细胞胞浆稀疏,呈纤维化状态。与模型组相比,穿心莲内酯各剂量组小鼠肝组织形态有所改善,尤以高剂量（0.2g/kg·BW）组小鼠表现最为明显,肝组织接近阳性对照组结构,其脂肪空泡、炎细胞浸润和纤维化状态均有明显改善。（7）穿心莲内酯对各组小鼠肝组织NF-κB、TNF-α和CYP2E1蛋白水平的表达均有明显影响,从免疫组化结果看,模型组小鼠肝组织中有大量NF-κB和TNF-α的原位表达。与模型组相比,随着干预剂量的增高,穿心莲内酯各剂量组NF-κB和TNF-α的蓄积逐渐减少,且呈现明显的剂量依赖性,穿心莲内酯高剂量组小鼠肝组织NF-κB和TNF-α的表达量已接近空白对照组和阳性对照组水平。从Western Blot结果看,模型组小鼠肝组织中NF-κB、TNF-α和CYP2E1表达水平均显着升高（P<0.05）,而经穿心莲内酯干预后,NF-κB、TNF-α和CYP2E1的表达水平均有所下降,差异具有统计学意义（P<0.05）。穿心莲内酯各剂量组NF-κB、TNF-α和CYP2E1的表达水平与阳性对照组无明显差异（P>0.05）。结论:（1）通过文献计量学分析得出,穿心莲内酯与肝损伤相关研究可能的信号通路主要是炎症信号分子,如NF-κB p100、NF-κB p105、TNF-α等。（2）通过对穿心莲内酯的临床应用现状分析得出,穿心莲内酯是目前临床上常用的抗炎药物,对改善肝脏功能具有一定的作用。（3）酒精对体外培养的小鼠原代肝细胞具有一定的毒性作用,呈现明显的剂量依赖性,穿心莲内酯高剂量组（0.2 mmol/L）对酒精所致原代肝细胞损伤具有明显的保护作用。（4）本研究成功建立了小鼠酒精性肝损伤动物模型,即给予4mg/d·kg·BW高度白酒一周后过渡至6mg/d·kg·BW灌胃共12w,可诱导小鼠出现血清转氨酶升高、肝脏脂质过氧化、ROS生成等肝脏功能受损及组织病理改变。（5）穿心莲内酯高剂量组（0.2g/kg·BW）可有效降低小鼠酒精性肝损伤时的血清转氨酶水平、氧化应激水平、肝脏脂质水平以及ROS生成。（6）穿心莲内酯对酒精性肝损伤的保护作用机制可能是通过抑制CYP2E1/ROS/NF-κB信号通路相关蛋白的表达实现的。
郑瑞鹏[3]（2020）在《基于微生物组学的慢性肝病临床特点及粪菌移植延缓肝硬化大鼠疾病进程的机制研究》文中研究表明慢性肝病是一种由病毒、酒精或药物等不同致病因素引起肝损伤的进行性疾病。慢性肝病的持续性进展,可导致进行性肝脏损伤、炎症和修复的恶性循环,患者通常会经历肝炎、肝纤维化和肝硬化等过程,如疾病不能被有效控制,最终可发展为肝癌。早期的肝炎主要是以肝脏局部炎症反应导致肝细胞受损为特征,炎症的持续存在则可进一步引发慢性肝炎、肝纤维化甚至肝硬化的发生,患者一旦进入肝硬化阶段将导致肝脏的不可逆性损伤,最终形成肝癌。其中肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）是肝癌的最常见类型。我国是肝病高发国家,据统计,2019年全世界一半以上的肝癌病例发生在中国,且80%的新增病例处于晚期癌症阶段。临床上主要采用手术切除或肝移植等外科手段对肝癌进行治疗,但肝癌患者的五年生存率极低,给社会公共卫生体系和患者身体健康带来了沉重的负担。因此,发现并干预慢性肝病的早期阶段,如肝炎和肝硬化的进程,对于延缓其进展并阻止肝癌的发生发展尤为重要。肠道菌群在机体的免疫调节、代谢平衡以及营养摄入等方面都发挥着重要的作用,被称为是一个被遗忘的代谢“器官”。肝脏通过门静脉、胆道与肠道连接,向肠道输送胆汁酸等生物活性物质维持机体需要,而肠道中的微生物及其代谢产物也会沿着门静脉逆行至肝脏进而对肝脏造成损伤,此通路被称为肠-肝轴。近年来随着高通量测序技术的发展,越来越多的临床研究表明肠道菌群紊乱在酒精性脂肪肝（Alcoholic liver disease,ALD）、非酒精性脂肪肝（Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）、肝硬化以及肝癌等多种慢性肝病的发生发展中发挥着重要作用。目前的研究多聚焦于肠道菌群与某种特定的肝病之间的关联性,但肠道菌群结构分布与慢性肝病的发生发展的关系有待于深入研究。肠道菌群失衡可导致有害菌增多,产生大量的细菌脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）,LPS通过与Toll-like Receptor 4（TLR4）受体结合,激活免疫细胞内MyD88-NF-κB通路,最终促进IL-6、IL-1β和TNF-α等促炎性细胞因子的基因转录与合成分泌,从而加重炎症反应。益生菌可改善肠道菌群失衡并能延缓慢性肝病的发生和发展,从而降低肝病的恶化和死亡率。但益生菌不能在肠道中长期定殖,且不同菌株间功能差异巨大,对肝病的治疗作用仍具有较大争议。粪菌移植（Fecal microbiota transplantation,FMT）是一种将健康人的肠道菌群整体移植到患者胃肠道内,对肠道菌群进行重塑的方法,已广泛应用于难辨梭状芽孢杆菌感染、炎症性肠病、顽固性便秘以及肠道免疫缺陷等疾病。目前应用FMT治疗慢性肝病的研究较少,其原因与慢性肝病的肠道菌群结构特点未被彻底揭示相关。此外,FMT治疗慢性肝病的作用机制也并不明确。为了解多种慢性肝病患者肠道菌群的组成特点,进而探讨FMT对慢性肝病的治疗作用机制。本研究拟使用高通量测序技术（16S rRNA）检测肝炎、肝硬化、HCC患者以及健康人的肠道菌群,解析不同病因和不同阶段慢性肝病的肠道菌群结构和组成,探讨肠道菌群与慢性肝病疾病进展之间的关系。同时通过构建肝硬化大鼠模型,以FMT对肝硬化大鼠进行干预,并联合微生物组学和代谢组学技术探讨FMT对肝硬化大鼠的治疗作用及机制,为临床上慢性肝病的诊治技术开辟新的领域。一、慢性肝病肠道菌群结构多样性研究方法:（1）以肝炎、肝硬化、HCC患者以及健康个体为研究对象,使用16S rRNA高通量测序技术检测肠道菌群的结构和组成,分析慢性肝病不同阶段肠道菌群的变化;（2）根据HCC患者是否存在肝硬化,分为肝硬化肝癌（LC-HCC:52例）和非肝硬化性肝癌（NLC-HCC:23例）两组,通过与单纯肝硬化组对比,分析肝硬化的并发对HCC患者肠道菌群的影响;（3）根据疾病诱因将HCC分为乙肝病毒诱发的HCC组（HBV-HCC:35例）、丙肝病毒诱发的HCC组（HCV-HCC:25例）和酒精性HCC组（ALD-HCC:15例）,探讨不同病因对HCC患者肠道菌群结构和组成的影响。结果:（1）与健康组、肝炎组和HCC组相比,肝硬化组肠道菌群的多样性明显降低,疣微菌门和变形菌门的丰度明显增高（p﹤0.05）,软壁菌门丰度显着降低（p﹤0.001）;在属水平上,叶杆菌属、鞘氨醇单胞菌属、肠球菌属和Erysipelatoclostridium菌属等菌属的丰度显着增高（p﹤0.05）,而青枯菌属、Catenibacterium菌属和Lachnospira菌属等菌属的丰度显着降低（p﹤0.05）。与健康组和肝炎组相比,尽管HCC组肠道菌群的多样性无明显变化（p﹥0.05）,但梭杆菌门的丰度显着增高（p﹤0.05）,同时劳特氏菌属、Clostridiates菌属以及Sarcina菌属等菌属的丰度显着增加（p﹤0.05）。这表明,在四组中,肝硬化组患者肠道菌群失调最为严重,尽管HCC组肠道菌群多样性无显着变化,但菌群种类的比例变化可能与HCC的发生相关。（2）与肝硬化组相比,LC-HCC组肠道菌群多样性无显着变化,而NLC-HCC组肠道菌群多样性显着增加（p﹤0.05）。菌属水平分析结果显示:与肝硬化相比,LC-HCC组中双歧杆菌菌属、阿克曼菌属等有益菌属以及考拉杆菌属等产短链脂肪酸菌属丰度显着降低（p﹤0.05）,拟杆菌属、脱硫弧菌属等产LPS菌属丰度显着增高（p﹤0.05）。结果提示肠道菌群中有益菌的减少以及有害菌的增多可能是肝硬化进展为HCC的原因之一。（3）在HBV-HCC组、HCV-HCC组和ALD-HCC组之间,α多样性和β多样性分析结果表明三组之间没有显着差异（p﹥0.05）。尽管在三组中发现了肠球菌属等18个差异性菌属,但在门水平上没有统计学差异（p﹥0.05）。由此可见,HCC患者肠道菌群的结构组成与其不同病因无显着关联性。二、FMT对肝硬化大鼠的治疗作用及机制研究方法:使用CCL4和CCL4联合酒精的方法分别构建了两种肝硬化大鼠模型,并每天给予健康大鼠的粪便菌液进行干预治疗。（1）连续造模12周后,比较分析各组大鼠的生活状态、体重、腹水形成时间、生存时间和死亡率;并应用全自动生化分析仪和HE染色技术对各组大鼠的肝功能指标以及肝脏的纤维化程度进行检测,探讨FMT对肝硬化大鼠的治疗作用。（2）ELISA检测各组大鼠血清中IL-6、IL-1β、和TNF-α炎症因子以及血浆中内毒素的含量;对各组大鼠血液、肠系膜淋巴结和肝脏组织中细菌含量以及肠道黏膜屏障的完整性进行检测;RT-PCR和Western-blot分别检测肝脏组织中TLR4-MyD88-NF-κB通路中相关信号分子的基因和蛋白的表达水平,初步探讨FMT对肝硬化大鼠的治疗机制。结果:（1）与肝硬化组相比,FMT治疗组大鼠的生活状态得到有效改善,体重增加,腹水形成时间和生存时间明显延长,死亡率显着降低（p﹤0.01）;血清中ALT、AST和GGT等肝功能指标均显着改善（p﹤0.05,p﹤0.01）,而白蛋白指标则明显增高（p﹤0.05）;肝组织表面的结节数量减少,肝组织中假小叶结构减少,结缔组织增生程度减轻。以上结果表明,FMT可有效改善肝硬化大鼠的生活状态,恢复肝功能并延缓肝硬化的发展进程。（2）ELISA结果显示,FMT治疗组大鼠血清中IL-6、TNF-α和IL-1β促炎性细胞因子以及内毒素的含量均显着降低（p﹤0.05）;血液、肠系膜淋巴结和肝组织中的细菌菌落数均显着减少（p﹤0.05）,肠道黏膜的结构和屏障功能得到有效改善;大鼠肝组织中TLR4-MyD88-NF-κB通路的相关分子基因和蛋白的表达水平均显着降低。以上结果表明,FMT可有效改善肝硬化大鼠的肠道黏膜结构和屏障功能,减少细菌移位;FMT可通过下调TLR4-MyD88-NF-κB通路的相关分子基因和蛋白的表达水平,减轻肝硬化大鼠的炎症水平。三、FMT对肝硬化大鼠的肠道菌群组成与代谢的影响方法:（1）应用16S rRNA高通量测序技术对各组大鼠的肠道菌群进行检测,分析比较各组大鼠肠道菌群的结构和组成,探讨FMT能否有效改善肝硬化大鼠肠道菌群的紊乱;（2）使用UPLC-Q/TOF-MS技术对各组大鼠血浆中差异性代谢物进行鉴别和分析,探讨FMT能否通过调节肝硬化大鼠的代谢模式进而发挥保护作用。结果:（1）肝硬化大鼠肠道菌群中乳杆菌科等有益菌属的丰度显着降低,而梭菌科和毛螺旋菌科等有害菌属的丰度显着增高,菌群结构和多样性紊乱;FMT治疗后,乳杆菌科等有益菌属的丰度增高,梭菌科和毛螺旋菌科等有害菌属的丰度降低,说明FMT可在一定程度上改善菌群结构,维持肠道微生态的平衡,进而通过肠-肝轴延缓肝硬化的进程。（2）肝硬化大鼠血浆中鞘氨醇和LysoPC（18:1（9Z））的含量显着降低,而视黄醇、8,9-环氧二十碳三烯酸、9-顺式视黄醛和花生四烯酸等代谢物的含量显着增高;FMT可调节花生四烯酸和视黄醇代谢通路。以上结果表明,FMT的治疗机制可能是通过改善肝硬化大鼠的肠道菌群的紊乱和调节花生四烯酸和视黄醇的代谢通路,进而延缓肝硬化的发展进程。结论:1.慢性肝病的发生与肠道菌群的紊乱密切相关,肝细胞癌（HCC）患者肠道菌群的紊乱与其是否并发肝硬化密切相关,而HCC患者肠道菌群的结构组成与其不同病因（如HBV感染、HCV感染或过度饮酒）无显着关联性。肝硬化进展为HCC可能与双歧杆菌菌属、阿克曼菌属等有益菌属及考拉杆菌属等产短链脂肪酸菌属丰度的降低,且与拟杆菌属、脱硫弧菌属等产LPS的菌属丰度的增高有关。2.粪菌移植（FMT）可有效改善肝硬化大鼠的肠道黏膜结构和屏障功能,减少细菌移位,进而延缓肝硬化发展进程;FMT的作用机制可能与下调TLR4-MyD88-NF-κB通路的相关分子基因和蛋白的表达水平,抑制促炎性细胞因子产生有关;FMT可通过调节花生四烯酸和视黄醇等代谢通路,改变大鼠的代谢模式,进而延缓肝硬化大鼠的疾病进程。创新性:1.本研究表征了我国吉林省肝炎、肝硬化和肝细胞癌（HCC）等慢性肝病患者的肠道菌群结构,发现HCC肠道菌群的紊乱与其是否并发肝硬化密切相关,而HCC患者肠道菌群的结构组成与其不同病因无显着关联性。2.本研究通过构建肝硬化大鼠模型验证了TLR4-MyD88-NF-κB通路相关信号分子在肝硬化发生发展中的作用。发现粪菌移植（FMT）可通过抑制TLR4-MyD88-NF-κB通路的相关分子基因和蛋白的表达水平,改善肝硬化大鼠的相关症状。3.本研究联合微生物组学和代谢组学技术阐释了FMT对肝硬化大鼠的治疗机制,发现FMT可通过调整肝硬化大鼠的肠道菌群结构并通过调节花生四烯酸和视黄醇代谢紊乱,延缓肝硬化的发展进程。
段佳林[4]（2020）在《太白楤木总皂苷及其单体成分对脑卒中的作用及机制研究》文中研究指明脑卒中是威胁人类健康的三大疾病之一,是我国成年人致死和致残的首要原因,且呈年轻化趋势,其中缺血性脑卒中占60-80%。目前,治疗缺血性脑卒中主要采用溶栓法进行血管再通,但严格的时间窗限制使中国患者受益率只有2.4%。超时间窗溶栓虽能取得一定的治疗效果,但有可能引起再灌注损伤,即脑缺血/再灌注损伤（Cerebral ischemia-reperfusion injury,CI/RI）。缺血中心区细胞已坏死无法逆转,但周边脑区即缺血半暗带细胞还可以挽回,因此,保护缺血半暗带组织和细胞,阻止脑损伤进一步发展,对于治疗脑卒中具有重要意义。太白楤木特产于我国“三大药山”之一的太白山区,其主要成分太白楤木总皂苷（Saponins from Aralia taibaiensis,sAT）,具有抗氧化、抗炎、抑制凋亡等生物学作用,但其对CI/RI的防治作用尚不明确,同时,其脑保护活性成分和作用机制也未见报道。目的:1.揭示sAT对抗CI/RI的药理学作用,尤其对CI/RI关键环节（氧化应激和线粒体障碍）的作用;2.阐明sAT对抗CI/RI的可能分子机制,以此为基础,筛选sAT对抗CI/RI的可能药效物质,为开发和利用sAT提供理论和实验基础。方法:体内采用大鼠局灶性脑缺血/再灌注（Middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R）模型,体外采用HT22小鼠海马神经元细胞氧糖剥夺/复氧（Oxygen and glucose deprivation/reoxygenafion,OGD/R）模型,验证sAT的脑保护作用。采用网络药理学技术预测可能作用的通路和靶点以寻找sAT的潜在作用机制。根据网络药理学预测结果,Western blotting检测腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activatedprotein kinase,AMPK）、蛋白激酶B（Protein kinase B,又称Akt）、过氧化物增殖子激活-受体因子γ辅激活因子（Peroxisome proliferator-activated receptorγcoactivator-1α,PGC-1α）和叉头框蛋白O 3a（Forkhead box protein O 3a,FOXO3a）蛋白的乙酰化水平和磷酸化水平,以及下游相关蛋白的表达情况。采用siRNA干扰技术、特异性激动剂或抑制剂证明相关蛋白的调控作用。通过采用siRNA干扰技术证明sAT通过Apelin 13调控AMPK/Akt。明确sAT对P38 MAPK、ATF4和HIF-1α的作用后,采用P38 MAPK的特异性激活剂（anisomycin）和抑制剂（SB203580）,或者siRNA干扰HIF-1α或ATF4表达,观察对sAT促Apelin13表达能力和脑保护作用的影响,以明确sAT是否通过HIF-1α和P38 MAPK/ATF4调控Apelin 13。为明确sAT的药效物质基础,对sAT中的单体成分进行活性筛选。采用RT-PCR、荧光报告基因细胞筛选模型,测定不同单体成分对缺氧反应元件（Hypoxia response elements,HREs）和CCAAT/增强子结合蛋白β（CCAAT/enhancer binding protein beta,C/EBPβ）转录活性的影响。最后采用siRNA干扰HIF-1α或P38 MAPK的特异性激活剂和抑制剂验证筛选出的皂苷单体的药效学作用及其是否分别通过影响HIF-1α和P38 MAPK/ATF4促进Apelin 13表达。结果:1.药效学研究。在体内,MCAO/R引起脑梗死面积显着增加（46.6±2.86%vs 0,P<0.01）、脑组织含水量增加（85.13±1.36%vs 77.6±4.03%,P<0.01）、神经功能学评分升高（4.33±0.82 vs 0,P<0.01）,而sAT能够剂量依赖性的抑制脑梗死面积（34.27±3.69%,26.97±2.15%,17.57±2.72%vs 46.6±2.86%,P<0.01）、减少脑组织含水量（81.97±1.36,79.9±2.29,77.97±2.46 vs 85.13±1.36,P<0.01）、改善脑神经功能障碍（3.5±1.05,2.67±1.03,1.0±0.89 vs 4.33±0.82,P<0.01）,同时,能够抑制脑组织中的氧化应激（P<0.01）和细胞凋亡水平（P<0.01）。在体外,OGD/R使细胞存活率显着下降（0.46±0.09 vs 1±0,P<0.01）、LDH释放增加（149.6±14.19 vs 39.63±8.89,P<0.01）、凋亡率增加、线粒体功能异常以及氧自由基水平增加,而sAT显着抑制细胞损伤,增加细胞内抗氧化酶表达、ATP水平,改善线粒体膜电位稳态和功能。证实sAT对缺血再灌注引起的脑损伤具有保护作用,且与降低氧化应激和改善线粒体功能关系密切。2.太白楤木中共收集31个皂苷单体,并根据结构预测到415个靶点,脑卒中筛选得到389个靶点,通过Venny分析二者交集筛选得到72个共同靶点。对72个共同靶点进行KEGG分析,获得248个生物过程,32个细胞组成,63个分子功能,对获得的104条KEGG通路分析发现,sAT调节的细胞通路包括TNF信号通路、PI3K/Akt信号通路、HIF-1信号通路、MAPK通路、FoxO通路、Toll样受体、AMPK通路和钙信号通路等。其中PI3K/Akt、AMPK、MAPK、HIF-1、Fox O等信号通路与上一章发现的抗氧化应激和线粒体稳态具有密切关系,是本研究下一章关注的重点。3.sAT通过AMPK/Akt调控SIRT1抑制氧化应激和线粒体功能障碍。sAT能够促进AMPK和Akt的磷酸化水平,同时促进SIRT1蛋白表达,以及FOXO3a和PGC-1α去乙酰化和磷酸化。通过si RNA干扰SIRT1表达,证实sAT通过SIRT1调控FOXO3a和PGC-1α乙酰化水平从而影响其活性;采用siRNA干扰Akt表达,证实sAT通过Akt促进FOXO3a和PGC-1α磷酸化水平影响其活性,同时可通过Akt调控SIRT1表达,继而影响下游蛋白的表达。siRNA干扰和抑制剂实验证实sAT对AMPK和Akt的交互调节关系。最终证明sAT通过活化AMPK/Akt促进SIRT1表达,从而调控FOXO3a和PGC-1α活性抑制线粒体损伤和氧化应激。4.sAT通过P38MAPK/ATF4和HIF-1α调控Apelin 13/AMPK/Akt。与模型组比较,sAT各剂量组使脑组织中Apln基因表达量分别增加约2.26倍、2.73倍和5.31倍,Aplnr基因表达量分别增加约1.5倍、2.75倍和3.27倍（P<0.01）,同时观察到sAT能够促进Apelin 13蛋白表达,表明sAT能够促进脑细胞内Apelin 13的基因和蛋白表达。采用基因干扰Apelin 13受体证实Apelin 13在sAT调控AMPK/Akt及其下游蛋白表达发挥脑保护作用中的关键作用。为研究Apelin 13的上游调节通路,本研究关注了P38MAPK/ATF4和HIF-1α的表达情况。sAT可梯度依赖性的抑制P38 MAPK磷酸化和ATF4表达。OGD/R通过促进P38MAPK磷酸化和ATF4表达,抑制Apelin 13表达,而sAT可以逆转这些作用。sAT能够促进HIF-1α表达,而siHIF-1α使sAT的促Apelin13表达能力降低,同时对细胞的保护作用明显降低（P<0.01）。上述结果表明sAT通过促进HIF-1α表达和抑制P38 MAPK/ATF4活化上调脑细胞中Apelin 13表达。5.sAT中活性单体成分筛选。通过RT-PCR实验共筛选出12个皂苷单体对Apln基因表达具有明显的促进作用,其中6个皂苷单体（10号、14号、15号、19号、20号和21号单体）对HRE转录活性具有明显影响。Western blotting和siRNA干扰实验进一步证实这6个单体对HIF-1α蛋白表达均具有促进作用,siHIF-1α使它们显着降低对细胞的保护作用。5个皂苷单体（10号、11号、14号、19号和21号）对C/EBP转录活性具有调控作用。采用抑制剂和激活剂验证发现,10、14和19号皂苷单体是通过P38 MAPK/ATF4调控Apelin 13表达发挥细胞保护作用的。10号单体为楤木皂苷A,14号单体为去葡萄糖竹节参皂苷IVa,19号单体为竹节参皂苷IVa,这三个单体可同时影响P38 MAPK/ATF4和HIF-1α信号通路,促进Apelin 13表达。15号单体为竹节参皂苷Ib,20号单体为刺嫩芽皂苷F,21号单体为拟人参皂苷RT1可通过影响HIF-1α信号通路,促进Apelin 13表达。11号单体为楤木皂苷D和21号单体为拟人参皂苷RT1虽然对P38 MAPK/ATF4没有影响,但对C/EBPβ转录活性和Apelin13表达均有显着影响,推测其可能通过其他途径或者直接影响C/EBPβ转录活性。结论:本研究首次系统研究了sAT对CI/RI的保护作用,并借助网络药理学技术和分子生物学技术阐明了sAT发挥脑保护作用可能的分子机制,以此为基础,筛选了sAT中的皂苷单体成分,发现不同皂苷单体分别通过影响P38 MAPK/ATF4和HIF-1α信号通路共同促进Apelin 13表达,调控AMPK/Akt/SIRT1信号通路,抑制氧化应激和线粒体功能障碍,发挥脑保护作用。本研究揭示了sAT脑保护作用的药效物质基础和分子作用机制,为太白楤木的开发和应用提供理论和实验依据。
王俐钧[5]（2020）在《茵杞调脂饮调控LXRα通路改善非酒精性脂肪性肝病的机制研究》文中研究指明目的:观察茵杞调脂饮治疗非酒精性脂肪肝（NAFLD）的临床疗效,探讨其作用机制,为中医药防治NAFLD提供理论基础和实践依据。方法:理论研究:通过查阅古今文献,总结中西医对本病的研究。综述NAFLD历史渊源、流行病学、治疗方法等方面的进展,探讨了LXRα通路及其相关靶点在NAFLD中的作用,基于“肝郁生浊”理论阐述了NAFLD的病因病机,在此理论指导下以清肝化浊法为治疗原则,论述了茵杞调脂饮的组方依据。临床研究:将73例NAFLD湿热蕴结型患者随机分为治疗组和对照组,其中脱落3例,最终纳入治疗组35例,对照组35例。两组患者均予以健康宣教及引导改变生活方式,在此基础上,治疗组口服茵杞调脂饮煎剂,对照组口服水飞蓟宾胶囊。3个月后观察受试者治疗前后血清ALT、AST、GGT、ALP、TG、TC、HDL-C、LDL-C、FFA水平及中医证候积分、肝脏彩超影像图、脂肪衰减参数CAP值与不良反应发生的变化,评估药物的疗效与安全性。实验研究:采用高脂饮食诱导建立NAFLD大鼠模型,将50只雄性SD大鼠分为正常组9只,模型组41只,分别给予普通饲料、高脂饲料,12周后从两组中分别随机选取1只,进行肝组织病理切片染色,明确造模是否成功。造模完成后,正常组剩余大鼠为正常对照组,模型组剩余大鼠随机分为模型对照组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组、水飞蓟宾组。正常对照组和模型对照组大鼠灌胃生理盐水,各药物组给予不同剂量的中药或西药灌胃。8周治疗后称取大鼠体重并计算肝指数、Lee’s指数,观察肝组织HE染色、油红O染色,检测血清ALT、AST、TG、TC及肝组织TC、TG、FFA、MDA、SOD、GSH、TNFα、IL-6水平,RT-PCR法检测LXRα、SREBP-1c、FAS、DGAT2m RNA表达,Western Blot法检测LXRα、SREBP-1c、FAS蛋白表达。结果:临床研究:治疗后两组患者血清ALT、AST、GGT、ALP、TG、TC、HDL-C、LDL-C、FFA水平及中医证候积分、肝脏彩超影像图、脂肪衰减CAP值、临床综合疗效均较治疗前显着改善（P?0.05,P?0.01）,无不良反应。在改善血清ALT、AST、TG、TC、LDL-C、FFA水平及中医证候积分、肝脏彩超影像图、CAP值方面治疗组优于对照组（P?0.05,P?0.01）;在改善血清GGT、ALP及HDL-C水平方面两组无明显差异（P>0.05）;治疗组总有效率85.71%,对照组总有效率62.86%,治疗组优于对照组（P?0.01）。实验部分:经12周高脂饮食诱导成功建立NAFLD模型大鼠。在大鼠体重、肝指数、Lee’s指数、血清ALT、AST、TC、TG方面,与正常对照组相比,模型对照组大鼠上述指标发生显着异常（P?0.01）;与模型对照组相比,各药物干预组大鼠上述指标不同程度改善（P?0.05,P?0.01）;与水飞蓟宾组相比,茵杞调脂饮高剂量组上述指标显着改善（P?0.05）;中药各剂量组之间比较,高剂量组上述指标较低剂量组明显改善（P?0.05,P?0.01）,中剂量组体重、Lee’s指数、ALT、AST、TC、TG较低剂量组明显改善（P?0.05）,高剂量组上述指标较中剂量组明显改善（P?0.05）。在肝组织TC、TG、FFA、MDA、SOD、GSH、TNFα、IL-6指标方面,与正常对照组相比,模型对照组大鼠肝组织上述指标发生显着异常（P?0.01）;与模型对照组相比,各药物干预组大鼠上述指标不同程度改善（P?0.05,P?0.01）;与水飞蓟宾组相比,茵杞调脂饮高剂量组上述指标均显着改善（P?0.05）;中剂量组在降低FFA方面效果显着（P?0.05）;中药各剂量组之间比较,高剂量组上述指标较低剂量组明显改善（P?0.05,P?0.01）,中剂量组TC、TG、FFA、MDA、SOD、TNFα、IL-6指标低剂量组明显改善（P?0.05）,高剂量组TC、FFA、MDA、SOD、GSH、TNFα、IL-6指标较中剂量组明显改善（P?0.05）。在肝组织LXRα、SREBP-1c、FAS、DGAT2m RNA和蛋白表达方面,与正常对照组相比,模型对照组上述指标发生显着异常（P?0.01）;与模型对照组相比,各药物干预组大鼠上述指标不同程度降低（P?0.05,P?0.01）;与水飞蓟宾组相比,茵杞调脂饮高剂量组LXRα、FAS、DGAT2表达显着降低（P?0.05）;中药各剂量组之间比较,中、高剂量组上述指标较低剂量组明显降低（P?0.05,P?0.01）,高剂量组LXRα、FAS、DGAT2表达较中剂量组显着降低（P?0.05）。结论:1.肝失疏泄、郁浊内生是NAFLD发生的关键因素和中心环节,以清肝化浊法为基本原则契合本病的发病机理,是行之有效的治疗方法。2.茵杞调脂饮能缓解NAFLD病情,减轻临床症状、体征,恢复肝功能,降低血脂水平,改善肝脏彩超影像图、CAP值,疗效确切,安全可靠。3.茵杞调脂饮对高脂饮食诱导的NAFLD大鼠具有较好的治疗效果,机制可能与调控LXRα通路有关,进而改变下游脂代谢相关靶点SREBP-1c、FAS、DGAT2的表达,减轻肝脏脂质堆积,缓解肝组织氧化应激及炎症反应,降低血清转氨酶及血脂水平,改善肝组织病理学。中药高剂量组效果最为显着,提示较高浓度的茵杞调脂饮能更好地调节LXRα通路,缓解病变。
王超炜[6]（2020）在《褪黑素通过调控成骨/破骨分化平衡延缓骨质疏松症进程的机制研究》文中研究表明研究背景褪黑素是一种神经激素,参与调节多种生理活动,尤其是骨稳态的维持。骨质疏松症作为常见的骨代谢疾病,主要表现为骨生成与骨吸收维持的骨稳态失衡而导致的骨量下降和骨结构紊乱,患者骨脆性和骨折发生率增加,而口腔颌面的骨质疏松不利于颌面部骨缺损修复和口腔种植治疗。流行病学研究发现,补充褪黑素可以有效延缓绝经妇女骨质疏松疾病进程。但是,褪黑素如何调节骨重建、骨生成骨吸收平衡,以及骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs）在其中的作用和具体机制仍不明确。研究目的本课题拟在去势雌性小鼠骨质疏松模型的基础上,以骨生成与骨吸收平衡作为切入点,研究:1.褪黑素对骨质疏松的治疗效果;2.褪黑素对BMMSCs成骨分化能力的影响及其分子机制;3.褪黑素对BMMSCs介导的破骨细胞分化功能的影响及其作用机制。研究方法1.建立C57BL/6J背景去势雌性小鼠骨质疏松模型,给予褪黑素治疗,通过μCT和H&E染色观察骨骼微结构改变,通过q RT-PCR、免疫组化和ELISA检测各个成骨、破骨和炎症相关指标在骨组织及血清中的表达水平。2.使用搭载sh RNA的慢病毒敲减细胞内褪黑素受体（melatonin receptor,MT受体）后,通过ALP染色、茜素红染色、q RT-PCR、ELISA和western blot明确褪黑素及其受体对BMMSCs成骨分化能力的影响,探索褪黑素、MT受体、NF-κB通路之间的关系,并用NF-κB抑制剂JSH-23验证该通路在其中的作用。3.分别建立直接接触、非直接接触共培养体系,研究BMMSCs与破骨前体细胞之间相互作用的模式,通过TRAP染色、western blot评估破骨细胞分化成熟的水平,并探讨褪黑素在整个过程中的作用。研究结果1.褪黑素显着提高了骨组织、血清中成骨相关基因的转录水平和蛋白的翻译水平,明显抑制了破骨相关蛋白及炎症因子的表达,有效缓解了骨质疏松小鼠的骨流失,改善了紊乱的骨微结构。2.近生理浓度的褪黑素（10-100n M）有效提高了BMMSCs的成骨分化能力,在表象上表现为BMMSCs的ALP水平、钙化结节明显增加,在分子水平上表现为Runx2、Osterix、OCN显着升高,但Col-I水平不受影响。3.褪黑素主要通过MT2受体调节BMMSCs的成骨分化能力。敲减BMMSCs的MT2受体后,褪黑素提高其成骨分化能力（表现为ALP、Runx2、Osterix和OCN表达水平升高,矿化结节生成增加）的作用被显着削弱;而当MT1受体被敲减后,BMMSCs的成骨分化能力无显着变化。4.褪黑素通过抑制MT2受体-NF-κB通路提高BMMSCs的成骨分化能力。褪黑素处理BMMSCs后,细胞内IκBα、p65、IKKα/β的磷酸化水平明显降低,提示NF-κB通路被显着抑制;敲减MT2受体后,褪黑素诱导的NF-κB通路的抑制状态被缓解,而敲减MT1受体无此作用;此外,抑制NF-κB通路具有协同褪黑素促进BMMSCs成骨分化的作用。5.褪黑素不直接影响破骨细胞分化,但可以通过MT2受体-NF-κB通路抑制BMMSCs中RANKL的产生,并提高opg/rankl比值。6.褪黑素通过MT2受体-NF-κB通路调节BMMSCs的旁分泌功能,继而间接抑制破骨细胞分化。在BMMSCs与破骨前体细胞非直接接触共培养体系中,我们发现褪黑素间接抑制了破骨细胞分化;但在直接接触共培养体系中,未观察到该现象。另外,与BMMSCs中RANKL的产生规律一致的是,抑制NF-κB通路能促进褪黑素的破骨抑制作用,MT1受体敲减对该过程无任何影响,而MT2受体敲减却显着减弱了褪黑素的破骨抑制作用。结论本研究证实,褪黑素在延缓骨质疏松进展中有效地发挥了维持骨稳态及抗炎的双重作用,极有可能成为治疗骨质疏松症的潜在药物。此外,我们首次发现MT2受体-NF-κB通路积极地参与了褪黑素促进成骨及抑制破骨的作用过程。值得注意的是,褪黑素是通过干预BMMSCs的旁分泌间接发挥破骨抑制作用,而RANKL/RANK极可能是BMMSCs和破骨细胞分化之间重要的信号轴。总的来说,我们充分证实了褪黑素在生理浓度下能够通过抑制MT2受体-NF-κB通路提高BMMSCs的成骨分化并抑制BMMSCs介导的破骨细胞分化,从而延缓骨质疏松症的疾病进程。
马萍[7]（2020）在《中药多糖为载体的基因传递及其诱导细胞重编程研究》文中提出谱系重编程在肝病治疗,特别是终末期肝病（End-stage liver disease,ESLD）治疗领域被深入研究。安全高效的基因载体是该技术成功应用的关键。当归多糖（Angelica sinensis polysaccharide,ASP）表面覆盖大量活性基团,易于被阳离子化修饰,是一种新型、安全、高效的基因载体,近年来被广泛应用于基因传递。本论文使用水提醇沉法制备ASP,选用聚乙烯亚胺（Polyethyleneimine,PEI）对ASP进行阳离子化修饰,利用阳离子化当归多糖（ASP-PEI）与质粒HNF1A之间的静电相互作用力,制得cASP-pHNF1A自组装纳米粒,并且进一步对该纳米粒介导的肝脏细胞重编程做了研究。实验结果显示,cASP-pHNF1A自组装纳米粒形态圆整,大小均一,细胞转染效率高。诱导的人源肝细胞（Induced human hepatocytes,ihHeps）能表达肝脏标志蛋白ALB,AAT,CK18,CK19和药物代谢酶CYP450,UGT,GST,摄取和排泄吲哚菁绿（Indocyanine Green,ICG）,储存糖原,摄取低密度脂蛋白（Low Density Lipoprotein,LDL）。因此,阳离子化当归多糖作为一种天然的基因载体,能够高效地介导细胞重编程,功能化的ihHeps细胞为肝细胞移植及其他细胞治疗手段在ELSD中的应用提供了可能。第一章综述对肝病的研究进展做了简单的概述;对细胞疗法在肝病及肝功能衰竭治疗领域中的应用进行了阐述;分别讨论了病毒型和非病毒型两大类基因载体的优缺点,对两类基因载体在肝细胞谱系重编程中的研究进展做了总结;查阅大量文献资料,概括论述和展望了天然多糖作为新型非病毒基因载体在谱系重编程中的应用;提出了本论文的研究目的、研究意义以及主要研究内容,对本论文的设计思路做出系统的规划,为本论文实验任务的顺利开展提供理论指导和依据。第二章中药多糖的提取、分离、纯化及结构解析本章研究内容围绕当归多糖的提取展开。使用传统水提醇沉工艺获取当归粗多糖,使用三氯乙酸除蛋白法和D315大孔树脂柱层析法对其进行纯化,得到精制的ASP。使用硫酸-咔唑法测定ASP中糖醛酸的含量,高效液相凝胶色谱法测定ASP的分子量为3255Da,刚果红实验结果表明ASP具有三螺旋结构,ASP的单糖组成为甘露糖:鼠李糖:葡萄糖醛酸:半乳糖:阿拉伯糖:木糖=0.23:0.17:14.41:0.39:1.68:0.87。第三章中药多糖的阳离子化修饰及表征本章研究内容围绕当归多糖的阳离子化修饰展开。选用聚乙烯亚胺作为阳离子化修饰试剂,在三乙胺的催化下,PEI能够与ASP在交联剂N,N’-羰基二咪唑（CDI）的作用下发生交联,PEI结合在多糖分子骨架上,完成对当归多糖的阳离子化修饰。Zeta电位测定、伯氨基含量测定和元素分析测定结果显示ASP-PEI带正电荷,N元素、H元素和C元素的含量明显高于ASP,实验数据一致表明PEI分子成功连接至ASP分子表面。采用傅立叶红外变换色谱（FT-IR）和核磁共振（NMR）技术对ASP-PEI的结构做进一步解析,相较于ASP而言,ASP-PEI的特征吸收峰放生了轻微位移,并且出现了新的质子峰,分析结果符合多糖阳离子化修饰的结构改造。第四章cASP-pHNF1A自组装纳米粒的制备、表征及细胞转导效率研究本章研究内容围绕cASP-pHNF1A自组装纳米粒的制备、表征及细胞转导效率展开。ASP-PEI与质粒HNF1A发生共沉淀,形成自组装纳米粒。粒径和电位的测定以及透射电镜的结果显示cASP-pHNF1A自组装纳米粒表面带正电荷、粒径在20-50nm之间、大小均一、呈规则的圆球状,有利于细胞内吞作用,提高基因传递的效率。MTT实验结果显示,自组装纳米粒的细胞毒性明显低于商业化的标准转染试剂PEI和Lipfectamine2000,与Lipfectamine3000近乎相等,符合基因载体安全、低毒的条件。使用GFP报告基因和qRT-PCR技术分别对纳米粒的细胞转导效率做了定性和定量分析,结果显示ASP-PEI与质粒HNF1A的质量比为20:1时制得的纳米粒的细胞转导效率最高,因此将其应用于后续肝脏细胞重编程研究。第五章cASP-pHNF1A自组装纳米粒介导的体细胞重编程研究本章研究内容围绕cASP-pHNF1A自组装纳米粒介导的肝脏细胞重编程展开。构建cASP-pHNF1A自组装纳米粒,成功高效地将HFFs细胞重编程为成熟的功能性人源肝脏细胞ihHeps。免疫印迹技术和免疫荧光染色的检测结果显示,ihHeps能够表达肝脏特异性蛋白ALB、AAT、CK18和CK19。qRT-PCR结果显示ihHeps能够分泌药物Ⅰ相代谢酶CYP450和Ⅱ相代谢酶UGT、GST。吲哚菁绿（ICG）摄取和排泄实验、过碘酸-希夫氏碱染色反应（PAS）反应以及LDL摄取实验结果表明ihHeps具有肝脏代谢、摄取、排泄、糖原储存以及调节脂蛋白合成和分泌的作用。
余蕾[8]（2020）在《氧供治疗改善肝细胞脂肪变性的作用及机制研究》文中研究指明目的:非酒精性脂肪性肝病（Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD）是指无过量饮酒等继发性因素导致的肝脏脂肪变性,是目前最主要的慢性肝脏疾病。目前针对NAFLD尚无有效治疗方法。慢性缺氧是NAFLD的重要致病因素,缺氧诱导因子2α（Hypoxia Inducible Factor-2α,HIF-2α）介导了这种作用。本课题研究氧供治疗改善肝脏缺氧及肝细胞脂肪变性的作用及相关机制。方法:第一部分:C57BL/6J小鼠分对照（Control,CON）组、High-fat diet（HFD）组和氧供（Oxygen therapy,OT）组,HFD组予60%高脂饮食12周,OT组高脂饮食4周后联合氧供8周,氧供方式:每天两次1个大气压（Atmosphere,atm）88%O2氧供治疗1小时。葡萄糖耐量试验和胰岛素耐量试验评估糖耐量及胰岛素抵抗水平;氧电极检测下腔静脉近肝脏出口处氧浓度;检测血脂及肝脏甘油三酯（Triglycerides,TG）水平,肝脏H&E和油红O染色;实时聚合酶链式反应（Real-time polymerase chain reaction,RT PCR）检测脂代谢基因。原代肝细胞以棕榈酸（Palmitic acid,PA）干预,设置对照组（常规培养）、PA（0.25 m M,24 h）组,氧供（PA 24 h,最后1h置于100%O2+1 atm氧舱氧供环境）组,肝细胞油红O染色并测定TG,检测糖脂代谢基因和蛋白水平。Hep G2细胞设置对照组、PA（0.5 m M,24 h）组,全氟化碳氧供（Perfluorocarbon,PFC）组（PA24 h,最后0.5、1、1.5、2h置于100%O2+1 atm全氟化碳纳米颗粒氧供环境）,油红O染色和TG测定。检测小鼠肝功能及肝脏氧化应激水平,以及原代肝细胞增殖能力和氧化应激。第二部分:RT PCR和western blot检测小鼠HIF-1α和HIF-2α表达;对Non-NAFLD、单纯性脂肪肝和脂肪性肝炎三组患者肝活检样本进行免疫组织化学染色和RT PCR检测HIF-1α与HIF-2α表达;检测高脂不同时间（HFD8W、HFD12W）小鼠肝脏HIF-2α的基因表达;慢病毒（Lentivirus,LV）过表达HIF-2α（LV-HIF-2α）感染原代肝细胞,PA干预氧供治疗后检测TG并予油红O染色,RT PCR检测肝细胞脂质合成基因的表达;给予放线菌酮（Cycloheximide,CHX）0、15、30、45、60min处理后分为有或无OT干预组,检测HIF-2α的蛋白合成;MG132干预后分为有无合并OT干预组,检测HIF-2α的蛋白降解。第三部分:全基因组测序筛选HIF-2α和氧供治疗下游信号分子羧酸酯酶1f（Carboxylesterase 1f,Ces1f）,检测HFD及氧供治疗小鼠肝脏Ces1f水平,HIF-2α小干扰RNA（small interfering RNA,si RNA）或LV-HIF-2α感染原代肝细胞,检测HIF-2α与Ces1f基因表达;检测氧供前后HFD小鼠肝脏Ces1f基因表达;油红O染色检测si RNA Ces1f感染后肝细胞的脂质沉积;si RNA HIF-2α或si RNA Ces1f感染后检测原代肝细胞TG和糖输出水平;si RNA HIF-2α之后再予LV-Ces1f干预,检测肝细胞的TG。结果:第一部分结果显示,氧供显着提高HFD小鼠肝脏血氧含量（P<0.01）、减轻小鼠体重（P<0.01）和肝重（P<0.05）,下调肝脏TG（P<0.01）、改善肝脏脂质沉积、降低血低密度脂蛋白、以及改善糖耐量和胰岛素敏感性（P<0.01）。PA诱导的原代肝细胞和Hep G2细胞氧供后,脂质沉积显着改善,TG显着降低（P<0.05）,糖代谢基因和蛋白均改善。氧供改善细胞增殖能力,对肝功能无损伤（P<0.05）,改善肝脏/肝细胞氧化应激水平和线粒体结构,氧供抑制肝脏/肝细胞脂质合成和摄取基因的表达（P<0.05）。第二部分结果表明,氧供显着降低HFD小鼠肝脏及PA处理原代肝细胞HIF-2α基因（P<0.05）和蛋白水平;随着NAFLD疾病进展,患者肝脏HIF-2α的基因（P<0.01）和蛋白表达随之升高;随着高脂时间的延长,小鼠肝脏HIF-2α的基因表达随之升高（P<0.05）。体外氧供改善肝细胞脂质沉积和抑制脂质合成基因的作用在LV-HIF-2α后被抑制（P<0.05）;CHX和MG132实验显示氧供抑制HIF-2α蛋白合成,并促进其蛋白降解。第三部分结果显示,原代肝细胞予LV-HIF-2α或si RNA HIF-2α后,Ces1f基因同步变化;随着高脂时间的延长,小鼠肝脏Ces1f与HIF-2α基因同步升高,氧供后显着下降（P<0.05）。si RNA Ces1f改善肝细胞脂质堆积;si RNA HIF-2α增加肝细胞糖输出及糖异生基因表达,si RNA Ces1f减少糖输出及糖异生基因表达（P<0.05）。同时si RNA HIF-2α和LV-Ces1f感染原代肝细胞,削弱了抑制HIF-2α表达改善肝细胞脂质沉积作用（P<0.05）。si RNA Ces1f或si RNA HIF-2α抑制PA肝细胞脂质合成基因表达（P<0.05）,si RNA HIF-2α抑制PA肝细胞脂质合成基因表达的作用在予LV-Ces1f后削弱（P<0.05）。结论:氧供治疗通过抑制HIF-2α/Ces1f通路,下调肝细胞脂质合成基因表达,进而改善肝细胞脂肪变性。氧供治疗可作为NAFLD治疗新的潜在的方式。
谭婷[9]（2020）在《茵陈五苓散对非酒精性脂肪性肝病大鼠SREBP-1c和NF-κB的影响》文中指出目的:通过观察茵陈五苓散对非酒精性脂肪性肝病大鼠固醇调节元件结合蛋白-1c（SREBP-1c）和核转录因子-кB（NF-κB）表达水平的影响,探讨茵陈五苓散治疗NAFLD的作用机制,为其临床运用提供实验室依据。方法:将70只雄性SD大鼠随机分为空白对照组（15只）与实验组（55只）。空白对照组给予普通饲料,实验组大鼠饲喂改良以后的高脂饲料,制作非酒精性脂肪性肝病模型,饲喂24周。造模成功后,将实验组的大鼠随机分为5组,非酒精性脂肪肝组、茵陈五苓散1.28组、茵陈五苓散0.64组、茵陈蒿汤组、辛伐他汀对照组,每组10只。每组大鼠进行灌胃,给予对应的药物治疗,6周后检测各组大鼠的肝质量、体质量、肝指数、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterin,LDL-c）、甘油三酯（Triglyceride,TG）、总胆固醇（total cholesterol,TC）、谷草转氨酶（Aspartate Aminotransferase,AST）、谷丙转氨酶（Alanine Aminotransferase,ALT）的水平,采用HE染色,观察肝脏病理形态学的改变;荧光定量多聚酶链式反应法（RT-PCR）检测肝组织中SREBP-1c m RNA和NF-κB m RNA的表达。结果:与空白对照组比较,非酒精性脂肪肝组大鼠的TG、LDL-c、AST、ALT、体质量、肝指数、肝质量、TC、SREBP-1c和NF-κB的表达均升高（P<0.01）。与非酒精性脂肪肝组比较,辛伐他汀对照组、茵陈蒿汤组、茵陈五苓散1.28组和茵陈五苓散0.64组大鼠的表达均降低（P<0.01）。与辛伐他汀对照组比较,茵陈五苓散1.28组、茵陈蒿汤组各指标都明显降低（P<0.01）,茵陈五苓散0.64组LDL-C、TC、TG、SREBP-1c和NF-κB都明显降低（P<0.01）,肝质量和肝指数降低（P<0.01,P<0.05）,体质量差异无统计学意义（P>0.05）,ALT、AST降低（P<0.05,P<0.01）。与茵陈蒿汤组比较,茵陈五苓散1.28组ALT、AST、肝质量、肝指数与体质量、SREBP-1C、NF-κB明显降低（P<0.01）,LDL-C、TC和TG差异无统计学意义（P>0.05）,茵陈五苓散0.64组ALT、AST升高（P<0.05,P<0.01）,LDL-C、TC、TG、SREBP-1C、NF-κB、肝质量和体质量明显升高（P<0.01）,肝指数差异无统计学意义（P>0.05）。结论:茵陈五苓散可通过调节大鼠SREBP-1c和NF-κB的表达水平,改善肝细胞的脂质代谢,减缓脂肪变性程度,抑制炎症、氧化应激、肝细胞凋亡,进而保护肝组织,治疗非酒精性脂肪性肝病。茵陈五苓散1.28组在防治非酒精性脂肪性肝病的疗效上优于茵陈五苓散0.64组,且在同等药物浓度剂量下,茵陈五苓散的治疗效果要优于茵陈蒿汤。
黎少玲[10]（2020）在《基于AMPK通路探讨脂肝合剂改善NAFLD脂肪酸代谢异常机制研究》文中提出目的:本课题研究采用体内与体外模型结合,以中药复方脂肝合剂干预高脂饮食诱导的C57BL/6小鼠NAFLD模型,以及复方冻干粉、含药血清干预游离脂肪酸诱导人源肝癌HepG2细胞脂肪变性的NAFLD细胞模型进行研究,明确复方脂肝合剂对非酒精性脂肪性肝病肝细胞脂质沉积的治疗作用及其相关机制。方法:实验一:脂肝合剂改善高脂饲养诱导NAFLD模型小鼠肝脏脂质沉积作用机制研究1.脂肝合剂水煎剂制备中药复方脂肝合剂由山楂、郁金、黄芪、柴胡、丹参、决明子等组成,将上述中药按照比例称取,加入10倍量水煎煮提取2次,每次1.5小时,合并两次提取液,过滤,将其浓缩成5g/ml生药的药液,50ml离心管分装,-20℃保存备用。2.雄性C57BL/6小鼠随机分为正常组、HFD模型组、脂肝合剂低剂量组、脂肝合剂高剂量组、普罗布考阳性药对照组,每组10只,除正常组外,其余各组均给予含60%kcal的高脂饲料喂养12周,建立NAFLD模型,分别以低剂量（1.25g/ml）、高剂量（5g/ml）脂肝合剂或普罗布考（500mg/kg）灌胃,2次/日,连续给药8周,正常组给予生理盐水灌胃作空白对照,干预结束后,各组小鼠称重后取材,摘取脂肪、全肝组织,称重,分装,-80℃保存。3.指标检测1)自药物干预起,每两周记录动物体重。2)药物干预结束后,记录各组小鼠体重、取材并记录全肝重量,计算肝指数。3)血清试剂盒检测各组小鼠血脂四项、游离脂肪酸水平和肝功能水平。4)酶联免疫吸附（ELISA）检测各组小鼠血清瘦素（Leptin）表达情况5)H&E染色观察各组小鼠肝组织、白色脂肪组织病理学情况。6)油红O染色观察各组小鼠肝组织的脂质特异性着色情况。7)Western blot检测AMPK通路中脂质生成相关蛋白AMPKα、P-AMPKα、SREBP-1C、FAS、ACC和脂质β氧化相关蛋白PGC-1α、CPT-1的表达水平。8)免疫荧光检测肝组织中脂肪酸代谢相关蛋白SREBP-1C、CPT-1的表达情况。9)qRT-PCR检测各组小鼠肝组织AMPK、SREBP-1C、FAS、ACC、CPT-1、PGC-1α的mRNA表达情况。实验二:脂肝合剂冻干粉改善游离脂肪酸诱导人源肝癌HepG2细胞脂质沉积作用机制研究1.脂肝合剂冻干粉制备:将预先准备的脂肝合剂水煎剂放于一次性无菌培养皿内,放入冷冻真空干燥机内,干燥至少24小时,将真空干燥后的脂肝合剂水提物冻干粉置于超净台中迅速收集并低温保存。2.细胞培养HepG2细胞按每孔3×105个的密度接种于6孔板内,每孔加入2ml含10%FBS+1%青链霉素的DMEM高糖完全培养基,本实验分为5组:正常对照组、FFA模型组、FFA+脂肝合剂组、FFA+AMPK激活剂组、FFA+AMPK抑制剂组,细胞贴壁24小时后,去原培养基,除正常组外,各组加入用DMEM高糖培养基稀释终浓度为1m M的FFA造模液培养24小时,去造模液,各给药组分别加入含有10%FBS+1%青链霉素配制的DMEM完全培养基配制的相应药物培养24h。继续进行后续实验。3.指标检测1)收集各组细胞,匀浆,按试剂盒说明操作,测定各组细胞的甘油三酯（TG）含量。2)油红O染色观察各组细胞内脂质着色情况。3)免疫荧光检测各组细胞SREBP-1C的表达情况。4)Western-blot检测各组细胞AMPK通路脂肪酸代谢相关蛋白AMPKα、P-AMPKα、SREBP-1C、FAS、ACC、CPT-1、PGC-1α的表达情况。5)qRT-PCR检测各组细胞的AMPK、SREBP-1C、FAS、ACC、CPT-1、PGC-1α的mRNA表达情况。实验三:脂肝合剂含药血清改善游离脂肪酸诱导人源肝癌HepG2细胞脂质沉积作用机制研究1.脂肝合剂含药血清制备:10周龄雄性SD大鼠20只,体重约330-360g),随机分为正常组及给药组,给药组给予中药复方脂肝合剂灌胃,正常组则给予生理盐水灌胃,按1ml/100g大鼠体重分别进行灌胃,2次/日,连续灌胃1周。两组大鼠最后1次灌胃2小时后,以2%戊巴比妥麻醉,腹主动脉采血,3500rpm,15分钟,离心分离含药血清和对照血清。将每组10只大鼠血清分别混合,56℃水浴30分钟灭活,0.22μm过滤后分装置-80℃冰箱保存备用。2.细胞培养:HepG2细胞按每孔3×105个的密度接种于6孔板内,每孔加入2ml含10%FBS+1%青链霉素的DMEM高糖完全培养基,本实验分为6组:正常大鼠血清对照组、FFA模型组、FFA+5%MS组、FFA+10%MS组、FFA+15%MS组、FFA+20%MS组,细胞贴壁24小时后,去原培养基,加入用DMEM高糖培养基稀释终浓度为1m M的FFA造模液培养24小时,去造模液,各给药组分别加入含有不同浓度含药血清和2%青链霉素配制的DMEM完全培养基培养24h。继续进行后续实验。3.指标检测1)收集各组细胞,匀浆,按试剂盒说明操作,测定各组细胞的甘油三酯（TG）含量。2)油红O染色观察各组细胞内脂质着色情况。3)免疫荧光检测各组细胞SREBP-1C的表达情况。4)Western blot检测各组细胞AMPK通路脂肪酸代谢相关蛋白AMPKα、P-AMPKα、SREBP-1C、FAS、ACC、CPT-1、PGC-1α的表达情况。5)qRT-PCR检测各组细胞的AMPK、SREBP-1C、FAS、ACC、CPT-1、PGC-1α的mRNA表达情况。结果:实验一1.脂肝合剂虽未能明显减轻NAFLD小鼠体重但能改善肝指数。肝指数组间比较显示,普罗布考组、脂肝合剂低剂量组、脂肝合剂高剂量组与HFD模型组比较,差异均具有显着性（P<0.01）。2.脂肝合剂能改善NAFLD小鼠脂肪组织病理及瘦素水平。与正常组比较,HFD模型组血清瘦素水平明显升高,差异具有显着性（P<0.01）,与模型组比较,仅复方高剂量组瘦素水平下降,差异具有统计学意义（P<0.05）。3.脂肝合剂能有效减少NAFLD小鼠肝细胞脂质沉积,改善NAFLD小鼠肝脏病理。4.脂肝合剂改善NAFLD小鼠血清脂质水平和改善肝功能异常。与正常组比较,模型组血脂水平明显增高,差异具有显着性（P<0.01）;与模型组比较,各干预组血清TC、TG、LDL-C、NEFA均有不同程度的下降,差异具有显着性（P<0.01）。经脂肝合剂口服给药干预后,各干预组小鼠血清肝功能水平均有不同程度的下降,其中以脂肝合剂高剂量组最为明显。5.脂肝合剂增加NAFLD小鼠肝脏AMPK磷酸化水平。与HFD组相比,脂肝合剂低剂量组、脂肝合剂量组、普罗布考组的AMPKα、p-AMPKα蛋白表达均明显升高（P<0.01）。6.脂肝合剂能下调NAFLD小鼠肝脏脂脂质生成相关蛋白及mRNA的表达水平。与HFD组相比,脂肝合剂低剂量、脂肝合剂高剂量组、普罗布考组肝内的SREBP-1C、FAS、ACC蛋白明显表达下降（P<0.01）。与HFD模型组比较,脂肝合剂低剂量组、脂肝合剂高剂量组及普罗布考组AMPK基因mRNA表达量增多,SREBP-1C、FAS、ACC基因mRNA表达量下降（P<0.05）。7.脂肝合剂能上调NAFLD小鼠肝脏脂肪酸β氧化相关蛋白及mRNA的表达水平。与HFD组相比,脂肝合剂低剂量、脂肝合剂高剂量组、普罗布考组肝内的CPT-1、PGC-1α蛋白明显表达升高（P<0.05）。与HFD模型组比较,脂肝合剂低剂量组、脂肝合剂高剂量组及普罗布考组CPT-1、PGC-1α基因mRNA表达量增多（P<0.05）。实验二1.脂肝合剂和抑制及激活AMPK表达对HepG2细胞脂质沉积的影响。与正常组比较,FFA模型组与AMPK抑制剂（DOX）组HepG2细胞内TG含量明显增加（P<0.01）);与FFA模型组比较,AMPK激活剂（AICAR）组和脂肝合剂冻干粉组HepG2细胞内的TG含量明显减少。FFA模型组与AMPK抑制剂（DOX）组HepG2细胞内脂滴明显,与FFA组比较,AMPK激活剂（AICAR）组和脂肝合剂冻干粉组HepG2细胞内的TG及脂滴含量明显减少。2.脂肝合剂和抑制及激活AMPK表达对HepG2细脂肪酸β氧化相关蛋白及基因mRNA表达影响。与正常组比较,FFA模型组及AMPK抑制剂组AMPKα、p-AMPKα、CPT-1、PGC-1α蛋白表达表达明显降低,有显着差异（P<0.01）,与FFA组相比,AMPK激活剂（AICAR）组和脂肝合剂冻干粉组的AMPKα、p-AMPKα、CPT-1、PGC-1α蛋白明显表达升高且AMPK、CPT-1、PGC-1α基因mRNA表达增加。3.脂肝合剂和抑制及激活AMPK表达对HepG2细胞脂肪酸β氧化相关蛋白及基因mRNA表达影响。与正常组比较,FFA组及AMPK抑制剂组SREBP-1C、FAS、ACC表达明显升高,有显着差异（P<0.01）,与FFA组相比,AMPK激活剂（AICAR）组和脂肝合剂冻干粉组SREBP-1C、FAS、ACC蛋白表达降低且SREBP-1C、FAS、ACC基因mRNA明显表达下降。实验三1.脂肝合剂含药血清改善FFA诱导HepG2细胞脂质沉积。用GPO-PAP酶法检测细胞内TG含量,油红O染色检测胞质内的脂滴含量。与正常组比较,FFA模型组HepG2细胞内TG含量明显增加（P<0.01）且油红O脂滴着色也更明显;与FFA模型组比较,脂肝合剂含药血清干预后细胞内TG含量随着给药浓度增加而减少,各干预组的TG含量大小依次顺序为:FFA组>5%MS>10%MS>15%MS>20%MS>正常组,此变化趋势与油红O染色一致。2.脂肝合剂含药血清能下调FFA诱导HepG2细胞脂质生成相关蛋白及基因mRNA表达。与正常组比较,FFA组SREBP-1C、FAS、ACC蛋白表达明显升高,有显着差异（P<0.01）,与FFA组相比,脂肝合剂含药血清各组（5%MS、10%MS、15%MS、20%MS）SREBP-1C、FAS、ACC蛋白及基因mRNA表达明显表达下降。3.脂肝合剂含药血清能上调FFA诱导HepG2细胞脂肪酸β氧化相关蛋白及基因mRNA表达。与正常组比较,FFA组AMPKα、p-AMPKα、CPT-1、PGC-1α蛋白表达明显降低,有显着差异（P<0.01）,与FFA组相比,脂肝合剂含药血清各组（5%MS、10%MS、15%MS、20%MS）HepG2细胞内的AMPKα、p-AMPKα、CPT-1、PGC-1α蛋白及AMPKα、CPT-1、PGC-1α基因mRNA明显表达升高。结论:本课题研究得出以下结论:1.脂肝合剂虽未能在治疗期间显着减轻NAFLD模型小鼠的体重增长,但能降低小鼠肝指数,改善NAFLD高瘦素血症和脂肪组织细胞病理结构;脂肝合剂能有效降低NAFLD模型动物血清脂质水平,且有效改善NAFLD模型小鼠肝功能异常,减轻肝细胞损伤,以上疗效与脂肝合剂临床疗效预期相符。2.脂肝合剂减少NAFLD肝细胞内脂质沉积,改善肝脏病理学情况,治疗非酒精性脂肪性肝病,可能与激活AMPK,增加AMPK的磷酸化水平,下调NAFLD模型小鼠肝组织的SREBP-1C、FAS表达;上调PGC-1α、CPT-1的表达,抑制脂质的生成,促进脂肪酸转运至线粒体增加脂肪酸的β氧化,纠正NAFLD脂肪酸代谢异常有关。3.中药复方脂肝合剂体内、体外实验均提示复方脂肝合剂具有减轻肝细胞脂质沉积,有效治疗非酒精性脂肪肝,这对于本研究团队将中药复方脂肝合剂应用于非酒精性脂肪性肝病临床治疗及后续进一步探讨脂肝合剂药理学作用研究提供了初步的理论依据。
二、RNA干扰在肝病治疗研究中的进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、RNA干扰在肝病治疗研究中的进展（论文提纲范文）
（1）TGR5在胆盐引起的肝内胆管结石病肝内胆管纤维化中的作用及机制初探（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 TGR5受体在肝脏疾病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）穿心莲内酯对酒精性肝损伤保护作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 肝脏疾病 |
| 1.2 酒精性肝损伤 |
| 1.2.1 酒精消费的现状 |
| 1.2.2 长期饮酒的危害 |
| 1.2.3 酒精性肝病的临床诊断 |
| 1.2.4 酒精性肝病的流行病学特征 |
| 1.2.5 酒精性肝损伤的危险因素 |
| 1.2.6 酒精性肝损伤的发生机制 |
| 1.2.7 酒精性肝损伤的药物治疗 |
| 1.3 穿心莲内酯 |
| 1.3.1 穿心莲内酯的生物学活性 |
| 1.3.2 穿心莲内酯的临床应用研究 |
| 1.4 选题内容、目的及创新点 |
| 1.4.1 主要研究内容 |
| 1.4.2 本论文的研究目标 |
| 1.4.3 本论文的特色及创新之处 |
| 第2章 穿心莲内酯的文献研究及临床应用现状分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 穿心莲内酯相关研究的文献计量分析 |
| 2.2.1 材料与方法 |
| 2.2.2 结果 |
| 2.3 穿心莲内酯临床应用的病例分析 |
| 2.3.1 对象与方法 |
| 2.3.2 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 穿心莲内酯对酒精性肝损伤的保护作用及其机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 细胞学实验 |
| 3.2.1 材料与方法 |
| 3.2.2 结果 |
| 3.3 动物实验 |
| 3.3.1 材料与方法 |
| 3.3.2 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 酒精性肝损伤的模型 |
| 3.4.2 酒精性肝损伤的判定指标 |
| 3.4.3 酒精性肝损伤的分子机制 |
| 3.4.4 酒精性肝损伤的保护药物 |
| 3.5 不足与展望 |
| 第4章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）基于微生物组学的慢性肝病临床特点及粪菌移植延缓肝硬化大鼠疾病进程的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 慢性肝病的研究进展 |
| 1.1.1 病毒性肝病 |
| 1.1.2 酒精性肝病 |
| 1.1.3 非酒精性脂肪肝 |
| 1.1.4 药物性肝病 |
| 1.1.5 自身免疫性肝病 |
| 1.2 肠道微生态与慢性肝病的研究进展 |
| 1.2.1 肠道菌群的概念 |
| 1.2.2 肠-肝轴学说 |
| 1.2.3 肠道菌群与慢性肝病的研究进展 |
| 1.2.4 FMT在肝病治疗中的应用进展 |
| 1.3 本课题的设计思路 |
| 第2章 慢性肝病患者肠道菌群结构多样性研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 研究对象与分组 |
| 2.1.2 粪便样本采集与DNA提取 |
| 2.1.3 16S rRNA V4 区扩增与纯化 |
| 2.1.4 16S rRNA测序和生物信息学分析 |
| 2.1.5 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 患者临床信息统计 |
| 2.2.2 16SrRNA测序深度 |
| 2.2.3 慢性肝病患者肠道菌群物种多样性的差异分析 |
| 2.2.4 慢性肝病患者肠道菌群门和属水平的差异性分析 |
| 2.2.5 肝硬化组、LC-HCC组和NLC-HCC组中肠道菌群物种多样性分析 |
| 2.2.6 肝硬化组、LC-HCC组,NLC-HCC组肠道菌群门和属水平的差异性分析 |
| 2.2.7 肠道菌群紊乱与临床因素之间的关系 |
| 2.2.8 肠道菌群紊乱与HCC病因的关联分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 FMT对肝硬化大鼠的治疗作用及机制研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 FMT改善了各组大鼠的生活状态和生存时间 |
| 3.2.2 FMT延缓了各组大鼠的体重下降和腹水形成时间 |
| 3.2.3 FMT减轻肝损伤保护肝功能 |
| 3.2.4 FMT可改善肝硬化大鼠的肝纤维化发展进程 |
| 3.2.5 FMT可降低肝硬化大鼠血清中炎性细胞因子和内毒素含量 |
| 3.2.6 FMT可减少肝硬化大鼠肠道菌群的移位 |
| 3.2.7 FMT可改善肝硬化大鼠肠道粘膜的屏障功能 |
| 3.2.8 FMT抑制了肝硬化大鼠肝组织中TLR4 信号通路 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 FMT对肝硬化大鼠的肠道菌群组成与代谢的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 16SrRNA测序深度 |
| 4.2.2 FMT对肝硬化大鼠肠道菌群多样性的影响 |
| 4.2.3 FMT对肝硬化大鼠肠道菌群门和属水平的影响 |
| 4.2.4 UPLC-Q/TOF-MS的稳定性评估 |
| 4.2.5 FMT对肝硬化大鼠体内代谢组学的影响 |
| 4.2.6 FMT治疗后差异性代谢物鉴别 |
| 4.2.7 FMT对肝硬化大鼠相关代谢通路的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录图 |
| 附录表 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（4）太白楤木总皂苷及其单体成分对脑卒中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 太白楤木简介 |
| 1.1.1 太白楤木分布情况 |
| 1.1.2 太白楤木的主要化学成分 |
| 1.1.3 太白楤木皂苷的药理学作用 |
| 1.2 脑卒中的发病机制和治疗现状 |
| 1.2.1 脑卒中的发病机制 |
| 1.2.2 氧化应激、线粒体功能障碍和CI/RI |
| 1.2.3 缺血性脑卒中的治疗手段 |
| 1.3 中药皂苷对缺血性脑卒中的治疗作用 |
| 1.3.1 抑制炎症反应 |
| 1.3.2 抑制氧化应激 |
| 1.3.3 改善能量代谢 |
| 1.3.4 抑制细胞凋亡 |
| 1.3.5 改善脑血管循环 |
| 1.3.6 抑制兴奋性氨基酸损伤 |
| 1.4 Apelin13 在缺血性脑卒中治疗中的重要作用 |
| 1.4.1 Apln基因简介 |
| 1.4.2 Apelin13 具有明确的脑保护作用 |
| 1.4.3 Apelin和缺血再灌注损伤 |
| 1.5 展望 |
| 第二章 sAT的脑保护作用研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 sAT的提取和纯化 |
| 2.3.2 总皂苷含量测定 |
| 2.3.3 动物实验 |
| 2.3.4 细胞实验 |
| 2.3.5 蛋白免疫印迹(Western blotting) |
| 2.3.6 统计分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 sAT减轻MCAO/R引起的脑损伤 |
| 2.4.2 sAT减轻MCAO/R引起的脑组织凋亡 |
| 2.4.3 sAT抑制脑组织内氧化应激水平 |
| 2.4.4 sAT减轻OGD/R引起的细胞损伤 |
| 2.4.5 sAT抑制OGD/R引起的细胞凋亡 |
| 2.4.6 sAT抑制OGD/R引起的氧化应激水平 |
| 2.4.7 sAT保护线粒体的功能 |
| 2.5 讨论和小结 |
| 第三章 网络药理学技术筛选sAT的潜在作用靶点 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 太白楤木皂苷单体成分及靶点信息收集 |
| 3.3.2 脑卒中靶点 |
| 3.3.3 交集靶点 |
| 3.3.4 共同靶点网络构建 |
| 3.3.5 靶点通路注释分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 太白楤木皂苷靶点预测结果 |
| 3.4.2 脑卒中相关靶点收集 |
| 3.4.3 共同靶点 |
| 3.4.4 共同靶点PPI网络构建 |
| 3.4.5 基因功能富集分析 |
| 3.4.6 通路富集分析结果 |
| 3.5 讨论和小结 |
| 第四章 sAT通过调控AMPK/Akt信号通路发挥脑保护作用 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验试剂 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞培养 |
| 4.3.2 细胞转染 |
| 4.3.3 抑制剂的使用 |
| 4.3.4 免疫沉淀技术 |
| 4.3.5 Western blotting检测蛋白表达 |
| 4.3.6 线粒体膜电位测定 |
| 4.3.7 ATP含量测定 |
| 4.3.8 细胞存活率测定 |
| 4.3.9 细胞凋亡率测定 |
| 4.3.10 统计分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 sAT对 AMPK和 Akt的激活作用 |
| 4.4.2 sAT对 SIRT1/FOXO3/PGC-1 信号通路的激活作用 |
| 4.4.3 sAT通过Akt调控SIRT1 信号通路 |
| 4.4.4 sAT对 AMPK和 Akt的交互调节作用 |
| 4.5 讨论和小结 |
| 第五章 sAT通过P38 MAPK/ATF4和HIF-1α调控Apelin 13/AMPK/Akt信号通路 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 实验试剂 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 侧脑室注射给药 |
| 5.3.2 sAT处理 |
| 5.3.3 MCAO/R模型 |
| 5.3.4 TTC染色 |
| 5.3.5 神经功能学评分 |
| 5.3.6 脑组织含水量 |
| 5.3.7 S-100β和NSE含量测定 |
| 5.3.8 Western blotting测定蛋白表达 |
| 5.3.9 RT-PCR测定Apln和 Aplnr mRNA表达 |
| 5.3.10 抑制剂和激活剂使用方法 |
| 5.3.11 细胞转染 |
| 5.3.12 细胞凋亡率测定 |
| 5.3.13 ROS含量 |
| 5.3.14 细胞存活率 |
| 5.3.15 线粒体膜电位 |
| 5.3.16 统计分析 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 sAT促进Aplein13 蛋白和基因的表达 |
| 5.4.2 Apelin13对MCAO/R引起的脑损伤具有保护作用 |
| 5.4.3 sAT通过Apelin13调控AMPK/Akt信号通路 |
| 5.4.4 sAT对 P38 MAPK和 ATF4 表达的影响 |
| 5.4.5 sAT通过抑制P38 MAPK/ATF4 促进Apelin13 表达 |
| 5.4.6 sAT对 HIF-1α表达的影响 |
| 5.4.7 sAT通过上调HIF-1α促进Apelin13 表达 |
| 5.5 讨论和小结 |
| 第六章 筛选太白楤木皂苷的主要活性成分并进行验证 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 实验材料 |
| 6.2.1 化合物 |
| 6.2.2 实验试剂 |
| 6.2.3 实验仪器 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 细胞OGD/R模型 |
| 6.3.2 RT-PCR测定单体对Apln表达的影响 |
| 6.3.3 细胞转染 |
| 6.3.4 荧光素酶报告基因检测 |
| 6.3.5 Western blotting |
| 6.3.6 统计分析 |
| 6.4 实验结果 |
| 6.4.1 不同皂苷单体对Apln基因表达的影响 |
| 6.4.2 不同皂苷单体对HRE的调控作用 |
| 6.4.3 不同皂苷单体对C/EBPβ的调控作用 |
| 6.4.4 皂苷单体分别对HIF-1α的调控作用验证 |
| 6.4.5 皂苷单体分别对P38 MAPK/ATF4 的调控作用验证 |
| 6.5 讨论和小结 |
| 总结与展望 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读博士/硕士学位期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（5）茵杞调脂饮调控LXRα通路改善非酒精性脂肪性肝病的机制研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 理论研究 |
| 1.非酒精性脂肪性肝病的研究进展 |
| 1.1 非酒精性脂肪性肝病的流行病学和危险因素 |
| 1.2 LXRα通路与非酒精性脂肪性肝病 |
| 1.3 非酒精性脂肪性肝病的治疗现状 |
| 2.肝郁生浊与非酒精性脂肪性肝病 |
| 2.1 历史渊源 |
| 2.2 肝郁生浊概论 |
| 2.3 从肝郁生浊理论探讨非酒精性脂肪性肝病 |
| 2.4 治疗方法及遣方用药 |
| 第二部分 临床研究 |
| 1 临床资料 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 诊断标准 |
| 1.3 纳入标准 |
| 1.4 排除标准 |
| 1.5 终止标准 |
| 1.6 剔除标准 |
| 1.7 脱落标准 |
| 1.8 不良事件 |
| 1.9 质量控制 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 治疗方案 |
| 2.2 观察指标 |
| 2.3 疗效评定 |
| 2.4 统计方法 |
| 3 研究结果 |
| 3.1 基线资料比较 |
| 3.2 疗效比较 |
| 3.3 不良反应发生率比较 |
| 4 讨论 |
| 4.1 清肝化浊法论治NAFLD的理论基础 |
| 4.2 茵杞调脂饮的用药特色 |
| 4.3 试验指标的选择 |
| 4.4 茵杞调脂饮治疗NAFLD的疗效评价 |
| 5 结论 |
| 第三部分 实验研究 |
| 实验一 茵杞调脂饮对非酒精性脂肪性肝病大鼠生化指标及肝脏病理学的影响 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 动物与饲料 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验药物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 造模及分组 |
| 2.2 给药方法 |
| 2.3 标本采集 |
| 2.4 指标检测 |
| 2.5 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 一般情况观察 |
| 3.2 大鼠体重、肝指数、Lee’s指数的变化 |
| 3.3 大鼠血清ALT、AST、TG、TC水平的变化 |
| 3.4 肝组织形态学观察 |
| 4 讨论 |
| 4.1 造模方法的选择及探讨 |
| 4.2 水飞蓟宾作为阳性对照药物的选择 |
| 4.3 疗效探讨 |
| 5 结论 |
| 实验二 茵杞调脂饮对非酒精性脂肪性肝病大鼠脂质代谢、氧化应激及炎性因子的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 动物与饲料 |
| 1.2 仪器与设备 |
| 1.3 药物与试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 造模及分组 |
| 2.2 标本采集 |
| 2.3 指标检测 |
| 2.4 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 茵杞调脂饮对肝组织TC、TG、FFA水平的影响 |
| 3.2 茵杞调脂饮对肝组织MDA、SOD、GSH水平的影响 |
| 3.3 茵杞调脂饮对大鼠肝组织TNFα、IL-6 水平的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 肝脂代谢与非酒精性脂肪性肝病 |
| 4.2 氧化应激与非酒精性脂肪性肝病 |
| 4.3 炎性因子与非酒精性脂肪肝 |
| 5 结论 |
| 实验三 茵杞调脂饮对非酒精性脂肪性肝病大鼠LXRα通路的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 动物与饲料 |
| 1.2 仪器与设备 |
| 1.3 药物与试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 造模及分组 |
| 2.2 标本采集 |
| 2.3 指标检测 |
| 2.4 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 茵杞调脂饮对大鼠肝组织LXRα、SREBP-1c基因表达的影响 |
| 3.2 茵杞调脂饮对大鼠肝组织FAS、DGAT2 基因表达的影响 |
| 3.3 茵杞调脂饮对大鼠肝组织LXRα、SREBP-1c、FAS蛋白表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 LXRα通路与肝脂代谢 |
| 4.2 LXRα通路与氧化应激 |
| 4.3 LXRα通路与炎性因子 |
| 4.4 茵杞调脂饮对LXRα通路的作用 |
| 5 结论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 综述 非酒精性脂肪性肝病的中医治疗进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一 中英文缩略词表 |
| 附录二 非酒精性脂肪性肝病患者临床登记表 |
| 附录三 扩增曲线和溶解曲线 |
| 致谢 |
| 查新报告 |
| 发表论文 |
（6）褪黑素通过调控成骨/破骨分化平衡延缓骨质疏松症进程的机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 褪黑素在骨质疏松症中的作用 |
| 引言 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 结论 |
| 第二部分 褪黑素对骨髓间充质干细胞成骨分化能力的影响及机制研究 |
| 引言 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 第三部分 褪黑素对骨髓间充质干细胞介导的破骨细胞分化的影响及机制研究 |
| 引言 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 间充质干细胞临床治疗的研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
（7）中药多糖为载体的基因传递及其诱导细胞重编程研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 第一章 综述 |
| 1 肝病的概述及研究进展 |
| 2 细胞疗法应用于肝病治疗研究进展 |
| 2.1 原代肝细胞 |
| 2.2 肝祖细胞 |
| 2.3 干细胞 |
| 2.4 谱系重编程 |
| 2.4.1 病毒型基因载体介导的谱系重编程 |
| 2.4.2 非病毒型基因载体介导的谱系重编程 |
| 2.4.3 存在的问题和局限性 |
| 3 天然多糖作为新型非病毒基因载体研究进展和展望 |
| 4 本论文的研究意义与内容 |
| 4.1 研究对象与意义 |
| 4.2 研究思路与内容 |
| 第二章 中药多糖的提取、分离、纯化及结构解析 |
| 1 仪器与试剂 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 2 实验与方法 |
| 2.1 当归药材的预处理 |
| 2.2 当归粗多糖的提取 |
| 2.3 当归多糖的纯化 |
| 2.3.1 粗多糖除蛋白 |
| 2.3.2 柱层析法 |
| 2.4 当归多糖的结构解析 |
| 2.4.1 分子量测定 |
| 2.4.2 糖醛酸含量测定 |
| 2.4.3 刚果红实验 |
| 2.4.4 单糖组成 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 当归多糖的纯化 |
| 3.1.1 粗多糖除蛋白 |
| 3.1.2 柱层析法 |
| 3.2 当归多糖的结构解析 |
| 3.2.1 分子量测定 |
| 3.2.2 糖醛酸含量测定 |
| 3.2.3 刚果红实验 |
| 3.2.4 单糖组成 |
| 4 本章小结 |
| 第三章 中药多糖的阳离子化修饰及表征 |
| 1 仪器与试剂 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 2 实验与方法 |
| 2.1 当归多糖的阳离子化修饰 |
| 2.2 阳离子化当归多糖(ASP-PEI)的表征 |
| 2.2.1 Zeta电位测定 |
| 2.2.2 元素分析 |
| 2.2.3 伯氨基含量测定 |
| 2.2.4 傅立叶红外光谱(FT-IR)分析 |
| 2.2.5 核磁共振(NMR)分析 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 Zeta电位测定 |
| 3.2 元素分析 |
| 3.3 伯氨基含量测定 |
| 3.4 傅立叶红外光谱(FT-IR)分析 |
| 3.5 核磁共振(NMR)分析 |
| 4 本章小结 |
| 第四章 cASP-pHNF1A自组装纳米粒的制备、表征及细胞转导效率研究 |
| 1 仪器与试剂 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要溶液 |
| 2 实验与方法 |
| 2.1 cASP-pHNF1A自组装纳米粒的制备 |
| 2.1.1 质粒DNA的制备 |
| 2.1.2 质粒DNA的鉴定 |
| 2.1.3 cASP-pHNF1A自组装纳米粒的制备 |
| 2.1.4 cASP-pHNF1A自组装纳米粒携带基因能力的测定 |
| 2.2 cASP-pHNF1A自组装纳米粒的表征 |
| 2.2.1 Zeta电位测定 |
| 2.2.2 粒径测定 |
| 2.2.3 形态观察 |
| 2.2.4 细胞毒性 |
| 2.3 cASP-pHNF1A自组装纳米粒细胞转导效率的研究 |
| 2.3.1 cASP-pHNF1A自组装纳米粒细胞转导效率的定性分析 |
| 2.3.2 cASP-pHNF1A自组装纳米粒细胞转导效率的定量分析 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 cASP-pHNF1A自组装纳米粒的制备 |
| 3.1.1 质粒DNA的鉴定 |
| 3.1.2 cASP-pHNF1A自组装纳米粒携带基因能力的测定 |
| 3.2 cASP-pHNF1A自组装纳米粒的表征 |
| 3.2.1 Zeta电位测定 |
| 3.2.2 粒径测定 |
| 3.2.3 形态观察 |
| 3.2.4 细胞毒性 |
| 3.3 cASP-pHNF1A自组装纳米粒细胞转导效率的研究 |
| 3.3.1 cASP-pHNF1A自组装纳米粒细胞转导效率的定性分析 |
| 3.3.2 cASP-pHNF1A自组装纳米粒细胞转导效率的定量分析 |
| 4 本章小结 |
| 第五章 cASP-pHNF1A自组装纳米粒介导的体细胞重编程研究 |
| 1 仪器与试剂 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要溶液 |
| 2 实验与方法 |
| 2.1 人源包皮成纤维细胞(HFFs)的分离与培养 |
| 2.1.1 HFFs细胞的原代培养 |
| 2.1.2 HFFs细胞的传代培养 |
| 2.1.3 HFFs细胞的冻存与复苏 |
| 2.2 HFFs细胞重编程为诱导的人源肝细胞(ihHeps) |
| 2.3 ihHeps的鉴定 |
| 2.3.1 细胞形态变化 |
| 2.3.2 免疫荧光反应 |
| 2.3.3 蛋白免疫印记(Western Blotting) |
| 2.3.4 实时荧光定量PCR |
| 2.3.5 吲哚菁绿(ICG)的摄取和分泌 |
| 2.3.6 糖原的储存 |
| 2.3.7 低密度脂蛋白(LDL)的摄取 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 人源包皮成纤维细胞(HFFs)的分离与培养 |
| 3.2 HFFs细胞重编程为人源肝细胞(ihHeps) |
| 3.3 ihHeps的鉴定 |
| 3.3.1 免疫荧光反应 |
| 3.3.2 蛋白免疫印迹(Western Blotting) |
| 3.3.3 实时荧光定量PCR |
| 3.3.4 吲哚菁绿(ICG)的摄取和分泌 |
| 3.3.5 糖原的储存 |
| 3.3.6 低密度脂蛋白(LDL)的摄取 |
| 4 本章小结 |
| 全文总结与创新点 |
| 一 全文总结 |
| 1 中药多糖的提取、分离、纯化及结构解析 |
| 2 中药多糖的阳离子化修饰及表征 |
| 3 cASP-pHNF1A自组装纳米粒的制备、表征及细胞转导效率研究 |
| 4 cASP-pHNF1A自组装纳米粒介导的体细胞重编程研究 |
| 二 创新点 |
| 三 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间已发表或完成的论文 |
（8）氧供治疗改善肝细胞脂肪变性的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.非酒精性脂肪性肝病应早期干预 |
| 2.慢性细胞缺氧是NALFD发生、发展重要病理生理机制 |
| 3.氧供治疗缓解慢性缺氧,改善肝细胞脂肪变性的可能性 |
| 4.缺氧诱导因子-2α与 NAFLD肝细胞脂肪变性相关 |
| 5.HIF-2α可能是氧供治疗改善肝细胞脂肪变性的靶分子 |
| 6.参考文献 |
| 第二章 氧供治疗改善肝细胞脂肪变性 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1.材料、试剂和主要仪器 |
| 2.动物饲养 |
| 3.氧供治疗 |
| 4.葡萄糖耐量试验和胰岛素耐量试验 |
| 5.血氧浓度测定 |
| 6.细胞提取与培养 |
| 7.苏木精-伊红(H&E)和油红O染色 |
| 8.Tunel细胞凋亡检测 |
| 9.生化分析、氧化应激检测 |
| 10.Western blot |
| 11.细胞内总RNA提取及逆转录与实时聚合酶链式反应(Real-time polymerase chain reaction,RT PCR) |
| 12.统计分析 |
| 结果 |
| 1.氧供治疗改善高脂饮食小鼠肝脏缺氧及脂肪变性 |
| 2.氧供治疗改善高脂饮食小鼠糖耐量及胰岛素抵抗 |
| 3.氧供治疗改善棕榈酸处理肝细胞脂肪变性及糖代谢 |
| 4.氧供治疗抑制肝细胞脂质合成基因表达 |
| 5.氧供治疗对肝脏和肝细胞无损害,并改善肝细胞氧化应激 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 HIF-2α在氧供治疗改善肝细胞脂肪变性中的作用及机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1.材料和试剂 |
| 2.细胞过表达 |
| 3.Western blot |
| 4.RT PCR |
| 5.IHC |
| 6.蛋白合成水平和蛋白酶体降解水平检测 |
| 结果 |
| 1.肝脏HIF-2α基因及蛋白表达水平与NAFLD病情进展相关 |
| 2.氧供治疗抑制肝脏及肝细胞HIF-2α表达 |
| 3.HIF-2α介导氧供治疗改善肝细胞脂肪变性 |
| 4.氧供治疗抑制HIF-2α蛋白合成、促其泛素化降解 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 羧酸酯酶1f在介导HIF-2α调控肝脏脂代谢中的作用研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1.材料和试剂 |
| 2.细胞小干扰RNA |
| 3.细胞逆转实验 |
| 4.实时聚合酶链式反应(Real-time polymerase chain reaction,RT PCR) |
| 结果 |
| 1.氧供治疗抑制肝细胞HIF-2α下游信号分子Ces1f表达 |
| 2.抑制Ces1f缓解肝细胞脂肪变性,沉默HIF-2α改善肝细胞脂肪变性作用在过表达Ces1f后被部分削弱 |
| 3.分别抑制原代肝细胞HIF-2α或 Ces1f表达同步下调脂质合成基因表达,过表达Ces1f部分消除沉默HIF-2α下调脂质合成通路效应 |
| 4.抑制原代肝细胞HIF-2α表达发生糖代谢异常,而抑制Ces1f表达可改善糖代谢 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结与展望 |
| 1.全文总结 |
| 2.展望 |
| 第五章 综述:缺氧诱导因子与非酒精性脂肪性肝病研究进展 |
| 1.非酒精性脂肪性肝病概述及研究进展 |
| 1.1 非酒精性脂肪性肝病的定义及分类 |
| 1.2 非酒精性脂肪性肝病的流行病学 |
| 1.3 非酒精性脂肪性肝病的临床表现 |
| 1.4 非酒精性脂肪性肝病的诊断及分类 |
| 1.5 非酒精性脂肪性肝病的治疗 |
| 2.缺氧与非酒精性脂肪性肝病 |
| 2.1 肝小叶氧浓度梯度与肝脏代谢 |
| 2.2 缺氧与非酒精性脂肪性肝病 |
| 2.3 缺氧诱导因子与非酒精性脂肪性肝病 |
| 2.4 氧供治疗非酒精性脂肪性肝病的可能性 |
| 2.5 缺氧诱导因子-2α介导氧供治疗改善NAFLD |
| 3.参考文献 |
| 博士研究生期间科研成果 |
| 致谢 |
（9）茵陈五苓散对非酒精性脂肪性肝病大鼠SREBP-1c和NF-κB的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词 |
| 前言 |
| 第一部分 实验研究内容 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物与实验饲料 |
| 1.2 药品 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 造模分组与给药 |
| 2.2 制备标本 |
| 2.3 指标检测方法 |
| 3 统计方法 |
| 第二部分 实验研究结果 |
| 1 各组大鼠一般情况比较 |
| 2 各组大鼠肝组织病理学比较 |
| 3 各组肝质量、肝指数及体质量的比较 |
| 4 各组大鼠血清ALT、AST的比较 |
| 5 各组大鼠血清生化指标的变化 |
| 6 SREBP-1c、NF-κB 基因在肝脏中的表达水平 |
| 第三部分 讨论 |
| 1 中医对非酒精性脂肪性肝病的认识 |
| 1.1 非酒精性脂肪性肝病的中医病因病机 |
| 1.2 中医对非酒精性脂肪性肝病的治疗概况 |
| 2 现代医学对非酒精性脂肪性肝病的认识 |
| 3 非酒精性脂肪性肝病与SREBP-1c、NF-κB 之间的关系 |
| 4 茵陈五苓散防治非酒精性脂肪性肝病的研究现状 |
| 5 实验结果分析 |
| 第四部分 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 文献综述 NF-κB、SREBP-1c 与非酒精性脂肪性肝病发病关系的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 在校期间发表论文 |
（10）基于AMPK通路探讨脂肝合剂改善NAFLD脂肪酸代谢异常机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 非酒精性脂肪性肝病现代医学研究概况 |
| 一、概述 |
| 二、流行病学 |
| 三、病因研究 |
| 四、诊断标准 |
| 五、临床治疗 |
| 六、疗效评价 |
| 第二节 非酒精性脂肪性肝病祖国医学研究概况 |
| 一、概述 |
| 二、病因病机分析 |
| 三、证候分型 |
| 四、辨证治疗 |
| 五、脂肝合剂的组方分析 |
| 第二章 脂肝合剂改善NAFLD脂肪酸代谢异常作用机制研究 |
| 第一节 脂肝合剂改善NAFLD模型小鼠肝脏脂肪沉积作用机制研究 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、数据统计 |
| 四、实验结果 |
| 五、实验小结 |
| 第二节 脂肝合剂冻干粉改善FFA诱导HEPG2 细胞脂质沉积作用机制研究 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、数据统计 |
| 四、实验结果 |
| 五、实验小结 |
| 第三节 脂肝合剂含药血清改善FFA诱导HEPG2 细胞脂质沉积作用机制研究 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、数据统计 |
| 四、实验结果 |
| 五、实验小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
四、RNA干扰在肝病治疗研究中的进展（论文参考文献）
- [1]TGR5在胆盐引起的肝内胆管结石病肝内胆管纤维化中的作用及机制初探[D]. 马可. 遵义医科大学, 2021
- [2]穿心莲内酯对酒精性肝损伤保护作用的研究[D]. 宋远. 吉林大学, 2021(01)
- [3]基于微生物组学的慢性肝病临床特点及粪菌移植延缓肝硬化大鼠疾病进程的机制研究[D]. 郑瑞鹏. 吉林大学, 2020(01)
- [4]太白楤木总皂苷及其单体成分对脑卒中的作用及机制研究[D]. 段佳林. 西北大学, 2020(01)
- [5]茵杞调脂饮调控LXRα通路改善非酒精性脂肪性肝病的机制研究[D]. 王俐钧. 山东中医药大学, 2020(01)
- [6]褪黑素通过调控成骨/破骨分化平衡延缓骨质疏松症进程的机制研究[D]. 王超炜. 浙江大学, 2020(01)
- [7]中药多糖为载体的基因传递及其诱导细胞重编程研究[D]. 马萍. 江苏大学, 2020(02)
- [8]氧供治疗改善肝细胞脂肪变性的作用及机制研究[D]. 余蕾. 南京大学, 2020(12)
- [9]茵陈五苓散对非酒精性脂肪性肝病大鼠SREBP-1c和NF-κB的影响[D]. 谭婷. 湖南中医药大学, 2020(03)
- [10]基于AMPK通路探讨脂肝合剂改善NAFLD脂肪酸代谢异常机制研究[D]. 黎少玲. 广州中医药大学, 2020(05)