一、血管内皮祖细胞对缺血肢体血管生成的影响(论文文献综述)
杨春荣[1](2021)在《补肾安胎冲剂对大鼠骨髓来源EPCs细胞增殖、迁移和分化的影响及其治疗肾虚型早期先兆流产的临床观察》文中研究说明第一部分实验研究目的观察不同浓度补肾安胎冲剂药物血清对大鼠骨髓内皮祖细胞(EPCs)增殖活性、迁移能力及向VECs(血管内皮细胞)分化的影响。从细胞分化层面探讨中药对血管生成的影响,揭示“肾主生殖”、”肾主骨生髓”中医理论的科学内涵。方法鉴定分离培养的细胞为大鼠骨髓来源EPCs:首先取3-4周龄SD大鼠(雌性)5只,采用密度梯度离心法分离单个核细胞,然后收集培养7d的细胞,通过免疫荧光法测定对EPCs特异性表面抗原人白细胞分化抗原34(CD34)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2,又称KDR+)、人白细胞分化抗原133(CD133)予流式细胞仪进行检测,行Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-AC-LDC)和异硫氰酸荧光素荆豆凝集素-1(FITC-UEA-1)双摄取实验,鉴定EPCs。按照23.4g/kg.d的中药剂量制备补肾安胎冲剂中药药物血清。运用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)检测不同浓度(5%、10%、15%、20%)以及在不同时间(24h、48h、72h)干预下EPCs的细胞增殖活性。通过细胞迁移侵袭实验技术(Transwell法)检测EPCs的迁移能力、定时定量PCR(Real-time PCR)检测 EPCs 向 VECs 分化情况。结果1.EPCs的鉴定1.1细胞免疫荧光检测DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色,细胞特异性表面抗原CD34、VEGFR-2、CD133阳性表达为相应荧光素标记的红光或绿色。可见绝大多数培养的EPCs特异性表面抗原CD34、VEGFR-2、CD133均可见阳性表达,7天时阳性率均显着增高,差异有统计学意义(P<0.05)1.2流式细胞仪鉴定EPCs培养7d时,应用流式细胞仪分析培养第7天的细胞表面标志物CD34、CD133、VEGFR的表达情况,见图2。检测结果显示,CD34阳性细胞占94.7%及CD133阳性细胞占93.8%;VEGFR阳性细胞数量98.8%,差异有统计学意义(P<0.05)。结果提示,该细胞为EPCs。2.EPCs的增殖活性检测运用MTT法检测,结果显示空白对照组在24h、48h、72h的吸光度值分别为(0.034±0.003)、(0.026±0.002)、(0.029±0.005),阴性对照组在24h、48h、72h 的吸光度值分别为(0.404±0.017)、(0.569±0.033)、(0.546±0.025),5%含药血清实验组在24h、48h、72h 的 D(490)值分别为(0.526±0.018)、(0.768±0.015)、(0.675±0.051),10%含药血清实验组在24h、48h、72h的吸光度值分别为(0.532±0.014)、(0.843±0.023)、(0.770±0.034)。15%含药血清实验组在24h、48h、72h的吸光度值分别为(0.482 ±0.039)、(0.073±0.025)、(0.705±0.013)。20%含药血清实验组在 24h、48h、72h 的吸光度值分别为(0.381±0.025)、(0.458 ±0.034)、(0.454±0.095)。阴性对照组及各浓度含药血清组吸光度值明显高于空白组,差异具有统计学意义(P<0.01)。不同浓度的补肾安胎冲剂体外干预下大鼠骨髓来源内皮祖细胞的增殖活性之间差异具有统计学意义。3.EPCs的迁移能力检测采用Transwell法检测,每高倍镜视野下空白对照组及药物血清组平均迁移细胞数分别为(51.0±7.94)、(105.5±15.22),与空白对照组相比,药物血清组EPCs的迁移能力明显增高(P<0.01)。4.EPCs向VECs分化情况提取内皮祖细胞RNA,设计Real-time PCR引物,通过Real-time PCR检测,相对于空白血清处理,药物血清组血管内皮生长因子(VEGF)及血管假性血友病因子(vWF)的相对表达量(2-ΔΔCT)均显着上升,含药血清处理可以显着诱导血管新生标记分子VEGF和vWF的表达。(P<0.01,具有明显统计学差异。)药物血清组vWF的相对表达量更高,差异更显着(P<0.01)。结论1.采用免疫荧光法及流式细胞学检测鉴定培养的细胞为大鼠骨髓内皮祖细胞;2.补肾安胎冲剂可增强内皮祖细胞的增殖活性及迁移能力,影响程度可能与浓度有关,10%浓度含药血清在48h增殖率达到最高值;3.补肾安胎冲剂剂能够显着促进EPC向VECs分化的功能,并通过刺激VEGF及vWF表达发挥作用。第二部分临床研究目的:通过口服补肾安胎冲剂联合地屈孕酮和单独口服地屈孕酮治疗肾虚型早期先兆流产的随机对照临床研究,评价补肾安胎冲剂在改善肾虚型早期先兆流产患者中医证候、血清孕酮(P)、雌二醇(E2)值、VEGF表达水平等方面的临床疗效,为中医药保胎的优势提供数据支持。方法:收集2019年03月至2020年03月就诊于安徽中医药大学第一附属医院妇科门诊的肾虚型早期先兆流产的60例患者,按照1:1的比例随机分成对照组(30例)、观察组(30例)两组。对照组予口服地屈孕酮,观察组予口服补肾安胎冲剂+地屈孕酮联合治疗,治疗疗程为两周(14天)。运用软件IBMSPSS25.0对数据进行处理分析,通过比较两组患者用药前后中医证候积分及血清P、E2值、VEGF表达水平的变化情况,评估补肾安胎冲剂联合地屈孕酮治疗肾虚型早期先兆流产的临床疗效。结果:1.临床综合疗效比较:观察组(补肾安胎冲剂联合地屈孕酮)与对照组(地屈孕酮)的总有效率分别为96.67%、90%,P<0.05,说明两组均有较好的治疗效果,且观察组的总疗效优于对照组。2.中医证候积分:与治疗前比较,观察组和对照组治疗后中医证候积分均明显下降,P<0.01,差异具有显着统计学意义;两组治疗后的中医证候积分比较,p<0.01,差异具有统计学意义,说明观察组(补肾安胎冲剂联合地屈孕酮)及对照组(地屈孕酮)治疗先兆流产均能有效改善临床证候,且观察组优于对照组。3.中医证候疗效:两组患者治疗后中医证候疗效比较,P=0.035,P<0.05,差异有统计学意义,观察组总有效率93.33%,对照组总有效率为86.67%,说明观察组中医证候疗效优于对照组。4.血清P、E2水平:观察组及对照组治疗后的血清P、E2水平均明显升高,与治疗前比较,P<0.05,差异有显着统计学意义;两组患者治疗后比较,p小于0.01,差异具有统计学意义,说明两组都能有效提高血清P、E2水平,且观察组优于对照组。5.外周血VEGF水平:观察组及对照组治疗后的外周血VEGF水平均明显升高,与治疗前比较,p<0.05,差异具有统计学意义;两组患者治疗后比较p小于0.01,差异具有统计学意义,说明两组都能有效提高外周血VEGF水平,且观察组优于对照组。结论:1.补肾安胎冲剂联合地屈孕酮治疗早期先兆流产的临床综合疗效明确,且优于单纯使用地屈孕酮治疗。2.补肾安胎冲剂联合地屈孕酮能够明显改善患者的肾虚证证候。3.补肾安胎冲剂联合地屈孕酮可提高患者血清P、E2水平,明显优于单纯使用地屈孕酮治疗,值得推广使用。4.补肾安胎冲剂联合地屈孕酮可上调VEGF水平,有助于血管的新生,从而纠正母胎界面血管生成障碍,改变妊娠结局。
钱伟[2](2020)在《lncRNA TUG1/miR-320对EPCs移植改善小鼠下肢缺血及促进血管新生的研究》文中研究表明背景随着缺血性疾病日益增多,各种缺血性疾病已成为世界上致残率和致死率最高的疾病之一,而干细胞治疗研究可能给患者带来新的希望。基于内皮祖细胞(EPCs)的干细胞移植能有效保护缺血组织的完整性及功能。血管生成是指在原有的毛细血管和(或)微静脉基础上以芽生或非芽生方式形成新的血管,涉及成熟血管内皮细胞增殖和迁移;内皮细胞增殖迁移对于血管新生具有重要作用。信号转导和转录活化因子3(STAT3)一方面通过血管内皮生长因子(VEGF)促进EPCs增殖分化为内皮细胞,另一方面通过促进Wnt-5a/β-catenin通路激活,有利于血管内皮细胞介导的血管新生,进而缓解下肢缺血。研究证实mi R-320是具有显着的抗血管生成作用的一类mi RNA。牛磺酸上调基因1(TUG1)一种在血管内皮细胞中保守表达的lnc RNA,并具有重要的促血管内皮细胞增殖迁移并抑制其凋亡从而促进血管生成的作用。本实验首先在动物体内研究不同缺血时间与lncRNA TUG1、mi R-320、STAT3、VEGF、Wnt-5a、β-catenin的表达变化;然后培养EPCs,研究其增殖、迁移及成血管能力,最后将其移植到下肢缺血裸鼠体内证实其对缺血的改善,并对比缺血改善与lnc RNA TUG1、mi R-320、STAT3、VEGF、Wnt-5a、β-catenin的表达关系。第一部分下肢缺血不同时间的组织损伤情况目的:探讨lnc RNA TUG1、mi R-320、STAT3、VEGF、Wnt-5a和β-catenin在下肢缺血裸鼠模型中的表达与缺血时间的变化。方法:选取20只6周龄裸鼠随机分为5组,每组4只:(1)缺血48h组;(2)缺血24h;(3)缺血12h;(4)缺血6h组;(5)空白对照组。每组饲料喂养4周,监测裸鼠体重,建立下肢缺血裸鼠模型。48h后用激光多普勒检测缺血下肢血流的变化,然后解剖下肢,分离腓肠肌,用HE染色观察其病理损伤程度,western blot及q RT-PCR实验,分析lnc RNA TUG1、mi R-320、STAT3、VEGF、Wnt-5a和β-catenin表达变化与下肢血流变化及下肢缺血病理情况的相关性。结果:下肢血流结果:与对照组相比,裸鼠下肢血流速度在缺血后6h、12h、24h48h均显着下降。HE染色结果:与对照组相比,腓肠肌细胞在缺血6h到12h变化不明显,而在12h、24h、48h内随着缺血时间延长,胞质嗜酸性逐渐增强,细胞坏死增加。腓肠肌q RT-PCR结果显示:与对照组相比,随着缺血时间延长lnc RNA TUG1基因表达逐渐下降、mi R-320基因表达逐渐上升。Western blot结果显示:与对照组相比,随着缺血时间延长,STAT3、VEGF、Wnt-5a和β-catenin表达逐渐下降。结论:在缺血48h内,随着缺血时间增加,腓肠肌损伤逐渐加重,可能与抑制了lnc RNA TUG1表达,促进了mi R-320表达有关。第二部分EPCs鉴定及培养目的:体外研究裸鼠骨髓来源的EPCs增殖分化、迁移及成血管能力。方法:将裸鼠脱颈致死,取出股骨和胫骨;培养基冲洗骨髓,收集冲洗液,用EPCs专用培养基培养细胞。14d后收集,做流式鉴定,并采用CCK-8、Transwell及基质胶检测EPCs增殖、迁移能力及检测成血管能力。结果:裸鼠骨髓来源的细胞CD14阳性率99.9%,CD34的阳性率86.4%,KDR的阳性率0.1%;EPCs在1-5天内逐步增殖生长;并且在48h的迁移细胞量多于24h;部分EPCs在24h可以看到生成细胞簇,在48h细胞簇更多。结论:裸鼠骨髓来源的细胞中含有EPCs,且其具有生长增殖、迁移及成血管能力。第三部分EPCs移植对裸鼠下肢缺血的影响目的:探讨lnc RNA TUG1、mi R-320在EPCs移植后对下肢缺血改善后的变化。方法:选取10只6周龄裸鼠随机分为2组,每组5只:(1)缺血48h+EPCs组;(2)缺血48h+NS组。每组饲料喂养1周,监测裸鼠体重,建立下肢缺血裸鼠模型。用激光多普勒检测缺血后2d,5d,9d的血流动力学变化,第9d后解剖下肢,分离腓肠肌,用HE染色观察其病理损伤程度,免疫组化检测腓肠肌微血管密度。western blot及q RT-PCR实验,分析lnc RNA TUG1、mi R-320、STAT3、VEGF、Wnt-5a和β-catenin表达变化与下肢血流变化及下肢缺血病理情况的相关性。结果:下肢血流结果:与对照相比,注射EPCs的裸鼠下肢血流相比注射NS组在缺血48h后第5天恢复效果较好。HE染色结果:与对照组相比,注射EPCs组的下肢相比注射NS组腓肠肌细胞嗜酸性降低,细胞坏死减少。免疫组化结果:与对照组相比,注射EPCs的腓肠肌相比注射NS组的微血管密度增加较多。腓肠肌q RT-PCR结果显示:与对照组相比,注射EPCs的腓肠肌与注射NS组相比,lnc RNA TUG1基因表达上升、mi R-320基因表达下降。Western blot结果显示:与对照组相比,注射EPCs的腓肠肌相比注射NS的STAT3、VEGF、Wnt-5a和β-catenin蛋白表达增加。结论:在缺血48h后,EPCs有助于裸鼠下肢腓肠肌缺血的改善,且可能与促进了lnc RNA TUG1表达、抑制了mi R-320表达有关。
唐琳[3](2020)在《人参皂苷Rg1对小鼠骨髓内皮祖细胞体外增殖的影响及其作用机制的研究》文中进行了进一步梳理目的建立小鼠骨髓内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)系作为细胞模型,采用RNA-seq技术结合生物信息学手段,分析人参皂苷Rg1(ginsenoside Rg1)对小鼠骨髓EPCs增殖影响的差异表达基因及其主要意义,探讨人参皂苷Rg1对小鼠骨髓EPCs促增殖作用的分子机制,为利用人参皂苷Rg1治疗内皮损伤性疾病提供分子生物学水平依据,同时寻找促进EPCs体外生长的关键靶点,为培养数量充足、富有活力的EPCs提供新思路。方法1.采用全骨髓差速贴壁培养法与二次酶消化法相结合,分离和纯化小鼠骨髓EPCs。通过形态学观察、细胞表面抗原表达率检测,进行所获EPCs的细胞鉴定。2.在EPCs的传代培养过程中,选择增殖能力强的细胞,通过有限稀释培养获得单克隆细胞系,并进行传代培养扩增。通过形态学观察、生长特性观察、细胞表面抗原检测、核型分析、体外成血管实验,进行所建细胞系MBMME2的鉴定。3.取小鼠骨髓EPCs的传代细胞和细胞系MBMME2细胞,每种细胞分为7个组,即4个人参皂苷Rg1处理组(终浓度分别为5、10、15、20μmol/L),空白对照组、溶剂对照组(1.25‰乙醇)和阳性对照组(10-8μmol/L雌激素),培养96 h,用MTT法检测细胞增殖水平。取小鼠骨髓EPCs传代细胞,按上述分为7个组,培养3周,观察集落形成能力。以上每种细胞分为10μmol/L人参皂苷Rg1组和溶剂对照组,培养96 h,用流式细胞术进行细胞周期分析。4.将MBMME2细胞分为4个组,即3组人参皂苷Rg1处理组(终浓度分别为5、10、20μmol/L)和溶剂对照组,培养96 h,收集总RNA样本,构建cDNA文库、HiSeq测序,建立转录组数据库。经差异表达分析,筛选出差异表达基因(DEGs),并以DEGs为对象进行基因功能注释、信号通路富集分析,以及蛋白质互作网络分析。根据RNA-seq分析结果,选出20个DEGs进行RT-qPCR验证。结果1.分离和纯化所获小鼠骨髓内EPCs贴壁生长良好,细胞多为短梭形或椭圆形。细胞传代接种后,早期形成集落,逐渐长大,而至汇合。较大集落中心的细胞重叠,外围细胞为单层,形态清晰。单层细胞密集时,呈典型的铺路石样排列。所获EPC传代细胞的表面抗原阳性细胞率检测显示,CD90为97.1%,CD133为83.4%,CD34为90.8%,CD29为23.5%,CD45为8.8%。2.本研究建立的细胞系MBMME2为连续传代细胞系,具有EPCs的一般生物学特征。细胞贴壁生长速率高,对血清的依赖性低,5%FBS的生长培养基能维持细胞的快速增殖。细胞增殖指数为44.8%~47.9%。流式细胞术检测显示,CD90、CD133、CD34、CD31和CD45的阳性细胞率依次为99.7%、36.4%、96.8%、97.5%和0.1%,并得到细胞免疫荧光染色结果的支持。染色体核型多为三倍体。体外成血管实验显示,细胞能排列成多个管横截面样的网络状结构。本细胞系传代方便,大集落和融合层上浮的细胞即能接种培养。3.在人参皂苷Rg1浓度为5~20μmol/L的条件下培养96 h后,小鼠骨髓EPCs的传代细胞和细胞系MBMME2细胞的MTT实验结果显示,两种细胞的吸光值均随人参皂苷Rg1浓度增高表现为先升后降。10μmol/L人参皂苷Rg1组的MTT吸光值最大,5~15μmol/L范围内各组的MTT吸光值均显着高于对照组,20μmol/L浓度组与对照组之间的吸光值差异无显着性意义。集落形成实验显示,5~20μmol/L人参皂苷Rg1各组的EPC集落生成能力都显着高于对照组;10μmol/L组的集落生成率最高,显着高于其它各组。10μmol/L人参皂苷Rg1组的细胞增殖指数显着高于对照组。4.RNA-seq数据显示,与对照组相比,3个人参皂苷Rg1处理组都有许多基因显着差异表达。DEGs功能富集分析表明,DEGs主要与细胞通讯、分子功能调控、发育过程、细胞膜受体、细胞外基质、离子转运等相关,涉及的主要信号通路包括细胞周期、PI3K-Akt、Wnt、MAPK、雌激素、细胞分化等通路。RT-q PCR结果表明,Celsr3、Mapk4、Col3a1、Nos3、Mmp9、Cdkl3、Notch1、Grk4、Bnip3、Mapk7、Mapk11、Mapk8、Stat5a、Gper1、Bnip1、Cdk20基因的表达显着上调,显着下调P21、Casp12、Casp4、Casp6的表达显着下调,支持RNA-seq的结果,这些基因与细胞凋亡和增殖调控等功能密切相关。蛋白互作网络分析显示,Cdc20、CDK4、CDK6、P21、Bub1b等差异基因编码的蛋白处于一些信号转导网络中的重要位置,这些网络主要与细胞周期、细胞衰老、细胞凋亡、细胞分化及癌症等相关。结论1.采用细胞克隆选择和长期自然传代培养相结合,首次成功建立小鼠骨髓内皮祖细胞系MBMME2。2.在体外培养条件下,人参皂苷Rg1能促进小鼠骨髓内皮祖细胞传代细胞及其细胞系细胞的增殖,并呈明显的浓度依赖性;浓度过高时,其促增殖作用减弱。3.转录组研究揭示,人参皂苷Rg1对MBMME2细胞体外生长的影响机制涉及许多基因表达的上调和下调,这些基因主要参与Jak-Stat、MAPK、Wnt、PI3K-Akt、细胞分化及雌激素等信号通路。
方杰[4](2020)在《自体骨髓源性内皮祖细胞移植治疗缺血性脑卒中的临床研究》文中提出研究背景:以脑梗塞为代表的缺血性脑卒中是中枢神经系统(central nerve system,CNS)的常见病和多发病,多数存活者会遗留运动、感觉、认知等功能障碍。早期溶栓公认有效,但由于限于严格的时间窗及出血等风险,使之应用受限;且至今为止,对遗留的CNS功能障碍并无确切疗效的治疗方法,尤其是慢性期脑梗塞所致的CNS功能障碍,严重危害脑卒中患者的生存质量,给患者个人、家庭和社会都带来了沉重的经济负担和心理负担,亟需探寻新的、安全有效的治疗策略。随着干细胞研究的不断深入,我们发现骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)来源的内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells,EPCs)具有分化为成熟内皮血管的功能,以及参与到血管新生、促进血脑屏障(brain blood barrier,BBB)及神经功能修复的潜力,是极具治疗应用前景的干细胞疗法种子细胞。本课题在团队前期干细胞有效性、安全性实验研究均获得一定成果基础上,以严格遵循临床试验研究规范为前提,对急、慢性缺血性脑卒中临床志愿者干细胞移植治疗进行疗效与安全性评估,旨在为干细胞临床神经医学转化提供有意义数据支持及可借鉴规范流程、可行的评估指标依据。研究内容:1.探讨自体骨髓源性EPCs在治疗急性期脑梗塞中的安全性和初步疗效。2.探讨自体骨髓源性EPCs在治疗慢性期脑梗塞中的安全性和初步疗效。研究方法:第一部分1.选取符合纳入标准的急性期缺血性脑卒中(发病<7天)患者18例,采用分层区段随机化法随机分入EPCs组、BMSCs组(阳性对照)和安慰剂组,每组各6例,入组患者均接受缺血性脑卒中后的二级预防等基础治疗;2.基线评估:患者入组后进行常规的实验室生化检查、心电图、心脏彩超和头颅磁共振。功能评估包括mRS、NIHSS、Barthel Index和SSS量表;3.EPCs组和BMSCs组患者在病程第7天提取骨髓,进行体外培养和扩增后经外周静脉回输体内(2.5×106/kg体重/次,隔2周一次、共两次),安慰剂组只回输相同体积的生理盐水;4.在移植后第3、6、12和48个月对基线指标进行随访,并记录与试验可能相关的不良事件。第二部分1.选取符合纳入标准的慢性期缺血性脑卒中(发病>6个月)患者14例,分为EPCs组和对照组,每组各7例,入组患者均接受缺血性脑卒中后的二级预防等基础治疗;2.基线评估:患者入组后进行常规的实验室生化检查、心电图、心脏彩超和头颅磁共振。功能评估包括 mRS、NIHSS、Barthel Index、SSS、Fugl-Meyer量表3.EPCs组患者进行基线评估后提取骨髓,进行体外培养和扩增后经外周静脉回输体内(2.5×106/kg体重/次,隔2周一次、共两次);4.在移植后次日及移植后第3、6、12和24个月对基线指标进行随访,并记录与试验可能相关的不良事件。研究结果:1.EPCs移植治疗急性期缺血性脑卒中的不良事件(0例)明显少于BMSCs组(1例)和安慰剂组(4例),差异有统计学意义(P<0.05),但48个月死亡率无明显差异(P>0.05);随访第3个月时,EPCs组的SSS评分(47.20±2.96)明显高于BMSCs组(29.00±2.04)和安慰剂组(36.80±4.19),差异有统计学意义(P<0.05),其余时间点功能评分无显着差异(P>0.05)。2.EPCs移植治疗慢性期缺血性脑卒中发生的不良事件发生率(1例)与安慰剂组(4例)差异无统计学意义(P>0.05),两组在到达24个月随访期时均无死亡;EPCs组在随访3月时的Barthel Index评分(92.5±6.12)、NIHSS评分(5.00±2.68)优于安慰剂组(分别为70.00±15.17、7.17±0.98),差异有统计学意义(P<0.05),但安慰剂组Fugl-Meyer评分(171±28.01)优于EPCs组(168.83±13.00),差异有统计学意义(P<0.05)。12和24个月时EPCs组Fugl-Meyer评分(分别为179±15.86和178.33±16.22)均优于安慰剂组(分别为169.83±32.39和167.83±32.55),差异有统计学意义(P<0.05)。其余时间点功能评分无显着差异(P>0.05)。研究结论:1.在未增加死亡率的前提下,自体骨髓源性EPCs移植治疗急性期缺血性脑卒中具有较高的安全性,并且在3个月时表现出更佳的功能恢复。2.在未增加死亡率和不良反应发生率的前提下,自体骨髓源性EPCs移植治疗慢性期缺血性脑卒中表现出更佳的功能恢复效果,并持续到24个月。
郭晓瑞[5](2020)在《人源内皮克隆形成细胞(ECFCs)旁分泌对成熟血管和皮肤细胞生物学影响的实验研究》文中研究表明研究背景和目的:2型糖尿病(T2D)是最常见的代谢性疾病之一,其主要特征是由于胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗而出现慢性高血糖。慢性创伤具有特征性的病理联系,不能通过有序和及时的修复来恢复结构和功能的完整性。在糖尿病患者中,每年有2%-3%的患者发生足部溃疡。糖尿病足是一种严重的T2D并发症,常导致疼痛、痛苦和生活质量低下。内皮克隆形成细胞(Endothelial colony-forming cells,ECFCs)被认为晚期内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs),在创伤修复中的作用受到广泛关注。ECFCs是一种来源于骨髓的原始细胞,在一定的条件下可诱导分化成为成熟的内皮细胞(endothelial cells,ECs)。该细胞不仅参与胚胎时期的血管生成,而且在人体出生后的血管新生、血管损伤的内皮修复以及功能维持中仍然有重要的作用。干/祖细胞对创面的修复机制可概括为:(1)分化为成熟内皮细胞;(2)旁分泌产生多种生物活性的细胞因子促进创面的血管新生及神经再生。为此,我们推测内皮克隆形成细胞通过旁分泌机制可促进糖尿病患者慢性创面的愈合以及破损处血管再生。本实验通过探讨ECFCs条件培养基(Conditioned medium,CM)对人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs)和人真皮成纤维细胞(Human Dermal Fibroblasts,HDFs)的作用功能,为ECFCs对于糖尿病患者创面修复作用提供新思路和理论支持。方法:1.ECFCs的提取、分离培养及鉴定1.1 ECFCs细胞提取及分离培养:采集健康志愿者脐带血,采用密度梯度离心法获得单个核细胞,将人纤维蛋白加入六孔细胞培养板中,置于37℃培养箱中孵育3h进行包被,接种到包被人纤维蛋白的细胞培养板中进行培养;1.2 ECFCs细胞鉴定:将培养的ECFCs细胞,采用流式细胞仪及免疫荧光法检测ECFCs细胞表面抗原,Matrigel成管实验对ECFCs细胞进行体外检测,共聚焦法检测ECFCs细胞对于Dil-acLDL和FITC-UEA-I的摄取结合能力。2.ECFCs-CM制备与细胞因子检测2.1细胞条件培养基ECFCs-CM的制备:对数生长期的ECFCs细胞于无血清的M199基础培养液中置于常氧和低氧条件下持续培养24h和48h,收集上清液,即为条件培养液(ECFCs-CM);2.2.细胞条件培养基(ECFCs-CM)细胞因子检测:采用抗体芯片及ELISA法检测ECFCs-CM细胞因子表达;3.ECFCs-CM对HUVECs和HDFs细胞的生物学作用3.1 CCK-8法检测ECFCs-CM对HUVECs和HDFs细胞增殖能力的影响;3.2细胞划痕法检测ECFCs-CM对HUVECs和HDFs迁移能力的影响;3.3 Transwell间接共培养法检测ECFCs对HUVECs和HDFs迁移能力的影响;3.4流式细胞仪检测ECFCs-CM对HUVECs和HDFs细胞周期的影响;3.5流式细胞仪检测ECFCs-CM对HUVECs和HDFs细胞凋亡的影响;4.丝素蛋白/海藻酸钠水凝胶的制备结果:1.ECFCs细胞提取及培养:ECFCs原代培养第4天,见少量呈纺锤形贴壁细胞,呈集落样生长集落中间可见圆形细胞,周边为梭形细胞,其结构与形状和血岛极其相似,ECFCs原代培养第8天,细胞集落开始接触融合;ECFCs原代培养第14天,细胞呈典型的“铺路石”样生长;2.ECFCs细胞的鉴定:流式细胞仪检测显示KDR、CD144(vWF)高表达,CD34部分表达,CD133、CD45低表达;Matrigel基质胶上形成管腔样结构,表现出典型的内皮细胞特征;3.抗体芯片检测显示,细胞条件培养基ECFCs-CM在常氧和低氧条件下多种细胞因子高表达,随时间表达谱稍有不同。在低氧条件且持续培养48h更有利于细胞培养液上清中细胞因子表达;ELISA法检测显示,EBM-2组的细胞上清液中的PDGF-BB、IL-8和EGF无表达,ECFCs-CM组的细胞上清液中的PDGF-BB、IL-8和EGF表达量较高;4.ECFCs-CM对HUVECs和HDFs细胞的作用:CCK-8法检测显示ECFCs-CM组的HUVECs和HDFs细胞增殖情况明显高于EBM-2组(P<0.05);细胞划痕法检测显示ECFCs-CM组的HUVECs和HDFs细胞培养至0h、6h和12h和24h细胞迁移覆盖率明显大于EBM-2组(P<0.05);Transwell间接共培养法检测显示ECFCs-CM共培养组的HUVECs和HDFs细胞数明显高于EBM-2组(P<0.05);流式细胞仪检测显示ECFCs-CM组的HUVECs和HDFs细胞处于G0/G1期细胞比例明显少于EBM-2组(P<0.05);ECFCs-CM组的HUVECs和HDFs细胞早晚期凋亡率明显降低。5.丝素蛋白/海藻酸钠水凝胶:SF/ALG复合水凝胶的孔径为50-120μm,FTIR光谱结果表明重要官能团的振动模式对比纯的ALG和SF,无明显差异;SF/ALG水凝胶孔隙率分析显示水凝胶孔隙率高,均一性良好;SF/ALG水凝胶溶胀度随着时间增加。结论:富含多种细胞因子的ECFCs-CM可促进HUVECs和HDFs细胞增殖、迁移和成管,减少HUVECs和HDFs细胞的凋亡,ECFCs通过旁分泌促进新生血管形成,为干/祖细胞旁分泌机制为基础的“无细胞”治疗策略促进糖尿病及难愈性创面修复可提供新思路。
何剑波[6](2020)在《补肾活血方通过Notch通路促进血管新生对脊髓损伤的修复作用及机制研究》文中指出目的:(1)脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后,在原发损伤的基础上会出现严重的继发性损伤,造成二次伤害,带来严重的并发症。二次损伤的机制十分复杂,既往研究发现脊髓损伤后使损伤局部出现微循环血管网的破坏,目前对于脊髓损伤后血管破坏有一定的研究,但对于血管网破损及其血管新生和修复的机制还不是十分明确。本研究目的之一即观察脊髓损伤后血管网的变化情况,并且基于Notch通路、VEGF、Ang-1/Tie-2等血管新生因子探讨血管新生的相关机制;同时观察损伤后神经细胞的变化情况,为通过促进血管新生治疗SCI提供相关的理论基础。(2)研究Notch-1蛋白和EGFL-8蛋白对HUVEC血管内皮细胞和Schwann神经细胞增殖、划痕和迁移等的影响,探讨它们对血管新生和神经保护的作用。(3)在中医辩证理论指导下,急性脊髓损伤属于肾虚血瘀证,治当补肾活血。本实验拟通过运用补肾活血方(BSHXF)进行相关研究,体外实验中观察BSHXF对血管内皮细胞(HUVEC)成血管的作用;体内实验中观察其对SD大鼠脊髓损伤后损伤组织区域血管网修复的影响和相关机制,及其对SCI后神经细胞的影响。方法:(1)脊髓损伤后微循环血管网的变化及相关机制研究。将正常SD大鼠分为假手术组(Sham组)和模型组(SCI组),观察SCI后不同时间点BBB行为学评分,HE染色观察损伤区域的病理情况;免疫荧光染色观察相关血管二维情况;microfil血管灌注造影后行micro-CT扫描,观察血管的三维结构情况;Western blot实验检测Notch-1、VEGF、Ang-1/Tie-2和EGFL-8相关蛋白的变化情况;免疫荧光实验观察损伤区域GFAP和MAP-2蛋白的表达情况。(2)运用细胞增殖、划痕、tube formation和Western blot相关实验观察Notch-1蛋白和EGFL-8蛋白对血管内皮细胞(HUVEC)的增殖、划痕愈合、迁移及血管形成功能的影响,以及它们对Schwann细胞的增殖、划痕和在transwell小室中迁移的影响。(3)BSHXF对大鼠脊髓损伤模型的治疗作用、血管新生和相关机制的研究。体外实验观察BSHXF对HUVEC细胞的增殖、划痕、迁移及血管形成的影响,及其对鸡胚血管新生的作用。体内实验中观察BSHXF对SCI大鼠BBB行为学评分的影响,检测BSHXF对损伤局部血管网的修复情况,Western blot和PCR实验检测BSHXF对损伤脊髓中Notch通路、Ang-1/Tie-2和EGFL-8等相关通路的影响;检测BSHXF对SCI动物模型氧化应激反应、星形胶质细胞和神经元细胞的影响。结果:(1)BBB行为学评分提示脊髓损伤造模后会即刻出现双下肢完全瘫痪,在损伤后第1周和第2周会有一定程度的康复,BBB评分恢复程度较多;第3周和第4周进入较为缓慢的康复期,其BBB评分改善程度较小。microfil血管造影和CD31免疫荧光实验结果提示脊髓损伤后出现血管密度下降;尽管在损伤后会有一定的自我修复,但仍然有一定的局限性,到第28天时仍然存在血管网的缺损。WB实验探讨相关机制研究结果提示,在急性脊髓损伤动物模型中,Notch-1首先会出现应激性上调,在损伤第3天时其表达量达到高峰,在第7天时虽然较第3天有所下降,但仍然比正常组要明显上调;到第14天时,其表达量出现下降;到第28天时,会进一步地出现下降,明显低于正常组的表达量。相应地,N otch下游通路Jag-1,Hes-1,以及VEGF和Ang-1/Tie-2的表达量也出现与Notch-1大致类似的先升后降的表达趋势,说明Notch-1调控VEGF和Ang-1/Tie-2等相关血管新生因子参与脊髓损伤后的血管新生。同时,EGFL-8蛋白在脊髓损伤后,在损伤第7天时,出现升高的趋势,达到高峰;在第14天开始逐渐下降,但仍然较正常组的表达量要高;到第28天时持续下降,提示EGFL-8可能具有一定的促血管新生的作用,但其参与血管新生的时间点与Notch不一致。伴随着脊髓损伤后血管网的破坏,损伤区域神经元细胞数量出现减少,星形胶质细胞出现活化,尤其是后期由于过度活化形成的胶质瘢痕可能对血管新生和神经功能修复造成一定的影响。(2)体外实验结果提示,Notch-1蛋白在200ng/ml浓度时能够促进HUVEC细胞的增殖、划痕愈合、迁移以及血管形成的能力,对Schwann细胞的增殖、划痕愈合和迁移有促进作用,其抑制剂DAPT会减弱其效果。EGFL-8与Notch-1蛋白具有类似的效果,在100ng/ml时,可促进血管内皮细胞的增殖、划痕和血管的形成,同时,也能促进Schwann细胞的增殖和迁移,具有潜在的神经保护的作用。(3)在BSHXF的相关实验中,当浓度为7.5mg/ml时,可以促进HUVEC的增殖、细胞划痕愈合、迁移和血管形成,同时对鸡胚血管新生具有一定的促进作用。在动物实验中,SCI大鼠进行BSHXF干预后,与模型组相比,BSHXF治疗组中BBB评分得到明显的改善。microfil血管造影及荧光染色提示BSHXF对局部血管网的修复具有一定的改善作用。Western blot和PCR实验结果表明,经过BSHXF的干预治疗,Notch-1、Ang-1/Tie-2和EGFL-8的蛋白表达量出现升高,提示BSHXF通过Notch-1调控血管新生参与急性脊髓损伤后血管网的修复。伴随着损伤区域血管的修复,脊髓损伤组织中SOD、MDA活力情况得到平衡,Nox-1和H0-1等氧化应激相关蛋白的表达量得到改善;GFAP蛋白的表达量出现降低,星形胶质细胞的活化水平减小,同时,MAP-2的表达量升高,说明神经元细胞得到一定的保护,因而促进了脊髓损伤后神经功能的修复。结论:(1)Notch-1调控VEGF、Ang-1/Tie-2和EGFL-8参与脊髓损伤后血管新生的机制中。(2)Notch-1蛋白和EGFL-8蛋白可促进HUVEC细胞增殖、划痕愈合、迁移和血管形成,具有一定的促血管新生的作用;对Schwann细胞的增殖、划痕愈合和迁移具有促进作用,具有潜在的神经保护作用。(3)体外实验中,补肾活血方具有促进血管新生的作用;体内实验中,补肾活血方可以通过Notch-1调控VEGF、Ang-1/Tie-2和EGFL-8促进脊髓损伤后的血管新生,可改善局部氧化应激反应和抑制星形胶质细胞的过度活化,对神经元细胞具有一定的保护,从而起到改善SCI后神经功能的作用。
齐振强[7](2019)在《慢性肾脏病证素特征及黄芪丹参有效单体干预缺血损伤肾小球内皮细胞血管生成的机制研究》文中研究表明目的:临床研究:收集CKD 3~5期非透析患者的临床资料,综合分析CKD患者中医证候要素分布规律及其与疾病分期和实验室指标的关系,探讨CKD的基本病机和证候特征,为临床辨证论治提供客观依据。实验研究:探讨补气活血中药黄芪-丹参有效单体(毛蕊异黄酮-丹参酮ⅡA)对体外缺血损伤肾小球内皮细胞血管生成的影响及调节机制,为中医药采用补气活血法治疗肾脏疾病提供理论依据。方法:1.制定CKD患者中医证素调查表,纳入山东省中医院肾病科2016年12月至2018年10月的CKD 3~5期非透析住院患者,采集患者一般资料、现病史、疾病分期、四诊信息和主要实验室指标等,使用SPSS22.0软件对患者基本资料、证素分布等进行统计分析,明确CKD常见中医证候要素分布规律及其与疾病分期和实验室指标的关系,探讨CKD的基本病机和证候特征。2.毛蕊异黄酮、丹参酮ⅡA及其配伍对缺血损伤HRGEC的保护作用:体外培养人肾小球内皮细胞(HRGEC),以Earle’s平衡盐代替正常培养基诱导建立HRGEC缺血模型,采用MTT法筛选毛蕊异黄酮(0.1mg/L、1mg/L、5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L)和丹参酮ⅡA(0.001mg/L、0.01mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.5mg/L、1mg/L、10mg/L)保护Earle’s平衡盐诱导的缺血损伤HRGEC的最佳药物浓度,根据筛选出的最佳作用浓度,两药分设低、中、高3个剂量组,设计正交实验,采用MTT法筛选出两药最佳药物配伍比例;使用最佳作用浓度的毛蕊异黄酮、丹参酮ⅡA及其配伍干预Earle’s平衡诱导的HRGEC缺血模型,采用MTT实验、凋亡实验、粘附实验、活性氧检测实验观察毛蕊异黄酮、丹参酮ⅡA及其配伍对HRGEC存活率、凋亡、粘附能力、活性氧的影响。3.毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍干预缺血损伤HRGEC血管生成的研究:采用细胞迁移实验、Matrigel血管生成实验观察毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍对体外缺血损伤HRGEC血管生成的影响;采用Seahorse XF细胞能量代谢分析仪观察毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍对缺血损伤HRGEC线粒体呼吸功能的影响;采用转录组测序技术检测毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA对缺血损伤HRGEC m RNA表达谱的影响,筛选差异基因,使用q-RT-PCR和Western Blot验证选取的差异基因表达情况。4.毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍对SGK1/TP53/SLC2A3信号通路的调节作用:SGK1抑制剂(EMD638683)抑制HRGEC SGK1表达,Western-blot法检测SGK1、TP53、SLC2A3蛋白表达变化。结果:1.共纳入185例CKD3~5期非透析患者,男性104例,女性81例,男女比例为1.28:1。年龄介于25岁至92岁之间,平均年龄54.68±14.18岁。原发病中,以慢性肾小球肾炎为主,占36.76%,其次为糖尿病肾病,占22.70%。合并症及并发症中,高血压最为多见,共162例,占87.57%,其次为贫血96例,占51.89%。中医症状频率出现大于20%的依次为倦怠乏力、面色黧黑或晦暗、水肿、肢体困重、面色无华或萎黄、唇甲色淡、食少纳呆、大便溏软、少气懒言、小便清长或夜尿多、脘腹胀满、口干口苦、畏寒肢冷、面色晄白、口咽干燥、恶心呕吐、肢体麻木,活动不灵、便结而尿短赤。中医证候要素构成,以虚实夹杂证最为多见,共149例,占总例数的80.54%,单纯虚证仅占11.89%,单纯实证仅占7.57%;四种虚性证候要素中气虚证最为多见,共123例,占总例数的66.49%,血虚证次之,占45.95%,阳虚证占31.89%,阴虚证最少,占25.41%;四种实性证候要素中血瘀证最为多见,共102例,占总例数的55.14%,湿热证次之,占45.41%,湿浊证占17.84%,水湿证最少,占14.05%;虚实夹杂证候要素中,出现频率前十位的证候要素组合依次为气虚证+血瘀证+湿热证、气虚证+血瘀证、气虚证+血虚证+湿热证、气虚证+湿热证、气虚证+血瘀证+湿浊证、气虚证+血虚证+血瘀证+湿浊证、血虚证+湿热证、气虚证+血瘀证+水湿证、气虚证+阳虚证+血瘀证+水湿证、气虚证+血虚证+血瘀证+湿热证。不同分期CKD患者的证候要素频率分布情况,虚性证候要素:CKD3期依次为:气虚证>阴虚证>血虚证>阳虚证;CKD4期依次为:气虚证>血虚证>阳虚证>阴虚证;CKD5期依次为:气虚证>血虚证>阳虚证>阴虚证;气虚证在CKD各期分布均衡(P>0.05),血虚证、阴虚证和阳虚证在CKD各期分布不均衡(P<0.05)。实性证候要素:CKD3期依次为:血瘀证>湿热证>水湿证>湿浊证;CKD4期依次为:血瘀证>湿热证>湿浊证>水湿证;CKD5期依次为:血瘀证>湿热证>湿浊证>水湿证。血瘀证、湿热证、水湿证在CKD各期分布均衡(P>0.05);湿浊证在CKD各期分布不均衡(P<0.05)。中医证候要素与实验室指标的关系,血红蛋白、血清白蛋白、血肌酐指标在虚性证候要素之间的差异有统计学意义(P<0.05),24h尿蛋白定量差异无统计学意义(P>0.05)。血虚证、阳虚证患者血红蛋白水平明显低于气虚证、阴虚证患者(P<0.05);气虚证患者白蛋白水平明显低于血虚证、阴虚证、阳虚证患者(P<0.05);血虚证和阳虚证患者血肌酐明显高于气虚证、阴虚证患者(P<0.05)。血红蛋白、血清白蛋白、血肌酐、24h尿蛋白定量在实性证候要素之间的差异均无统计学意义(P>0.05)。2.毛蕊异黄酮、丹参酮ⅡA及其配伍对缺血损伤HRGEC的保护作用:毛蕊异黄酮的最佳作用浓度为10mg/L,丹参酮ⅡA的最佳作用浓度为0.05mg/L,毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍的最佳作用浓度为10mg/L+0.025mg/L;Earle’s平衡盐诱导的HRGEC缺血损伤使存活率降低,凋亡率升高,粘附能力降低,细胞内活性氧水平升高(P<0.05);毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA可提高HRGEC存活率,减少凋亡,降低细胞内活性氧水平(P<0.05),两药配伍优于单药(P<0.05),丹参酮ⅡA可提高粘附能力(P<0.05),毛蕊异黄酮对粘附能力无改善(P>0.05)。3.毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍干预缺血损伤HRGEC血管生成的研究:Earle’s平衡盐诱导的缺血损伤使HRGEC迁移能力降低,成血管能力降低(P<0.05),毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍可改善缺血损伤引起的HRGEC迁移能力和成血管能力抑制(P<0.05);Earle’s平衡盐诱导的缺血损伤显着抑制了HRGEC线粒体呼吸能力,可降低基础呼吸、ATP产生能力和呼吸储备,毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍可显着改善缺血损伤HRGEC的线粒体呼吸能力,可提高基础呼吸、ATP产生能力和呼吸储备;毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍对缺血损伤HRGEC基因表达谱的影响:模型组与正常组比较,共筛选出差异m RNA 3464个,其中2273个上调,1191个下调(qvalue≤0.05);毛蕊异黄酮+丹参酮ⅡA配伍组与模型组比较,共筛选出差异m RNA642个,其中299个上调,343个下调(q-value≤0.05);选取相关基因进行验证,qRT-PCR检测SGK1、TP53、MAPK14、SLC2A3、VEGFA、CS m RNA表达,Western Blot检测VEGFA、CS蛋白表达,验证结果显示各基因表达变化同测序结果趋势基本相同,提示测序结果真实可靠。4.毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍对SGK1/TP53/SLC2A3信号通路的调节作用:Earle’s平衡盐诱导的HRGEC缺血损伤引起SGK1、SLC2A3蛋白表达显着下调,TP53蛋白表达显着上调(P<0.05);毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍干预后SGK1、SLC2A3蛋白表达显着上调,TP53蛋白表达显着下调(P<0.05)。采用EMD638683抑制SGK1表达后,SGK1、SLC2A3蛋白表达进一步显着下调,TP53蛋白表达进一步显着上调(P<0.05)。结论:临床研究:CKD病机虚实夹杂,气虚证、血瘀证在CKD各期普遍存在,气虚血瘀是CKD的基本病机;血虚证和阳虚证与血红蛋白、血肌酐有一定相关性,气虚证与血清白蛋白有一定相关性。实验研究:毛蕊异黄酮、丹参酮ⅡA对Earle’s平衡盐诱导的HRGEC缺血损伤具有显着保护作用,可提高细胞存活率,减少凋亡,降低细胞内活性氧水平,两药配伍优于单药,丹参酮ⅡA可提高细胞粘附能力。毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍具有显着促血管生成作用,可提高缺血损伤HRGEC迁移能力和成血管能力,其作用机制可能与调控CS、VEGFA、SGK1、TP53、SLC2A3表达,促进细胞存活,抑制凋亡,增强线粒体呼吸和葡萄糖代谢有关。
李勇[8](2019)在《血管生长因子AGGF1通过增强内皮祖细胞功能治疗糖尿病小鼠后肢缺血》文中提出AGGF1(Angiogenic factor with G-patch and FHA domain1)基因突变导致人先天性骨肥大性静脉曲张综合征(Klippel–Trénaunay syndrome,KTS)。AGGF1基因定位于第五号染色体5q13,并编码一个新的血管生长因子。AGGF1蛋白质包含有4个已知的结构域,分别是N端的coiled coil区,OCRE区,C端的FHA(Forkhead-associated domain)区和G-patch区,共714个氨基酸。AGGF1在鸡胚绒毛尿囊膜实验(chick embryo chorioallantoic membrane,CAM)中表现出与血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGF-A)功能相当的促血管新生能力。在小鼠后肢缺血模型的基因治疗中,肌肉注射的AGGF1质粒能有效表达并促进缺血肢的血流恢复和血管新生。在斑马鱼研究中发现,AGGF1是静脉和血液血管母细胞(分化为内皮细胞和血细胞)分化所必需的。在冠状动脉疾病(Coronary artery disease,CAD)和心肌梗死(myocardial infarction,MI)治疗中,基于AGGF1蛋白的抗血管渗漏功能,其治疗效果优于传统VEGFA治疗。此外,近期研究发现AGGF1蛋白治疗可以有效抑制血管损伤后新生内膜形成,这对动脉粥样硬化,冠心病和心肌梗死等心血管疾病的血管重建术后血管再狭窄进行治疗具有重要意义。糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一种以长时间高血糖为特征的常见的代谢紊乱疾病,并伴有多种并发症,主要包括外周血管疾病(perpherial vascular disease,PAD)、心血管疾病、脑血管疾病、慢性肾病、糖尿病酮酸症(diabetic ketoacidosis,DKA)、高渗性非酮症糖尿病昏迷(hyperosmolar hyperglycemic state,HSS)以及眼疾等。糖尿病影响全球超过4个亿的人群,其与血管内皮功能失常密切相关。在糖尿病病人中,血管并发症往往与血管生长,重构,氧化应激,内皮细胞再生以及血管新生息息相关。因此,在临床上急需发展治疗干预方法以修复糖尿病患者体内功能失常内皮细胞以及恢复其血管血流。内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)是内皮细胞的前体细胞,它具有增殖分化能力,在体内能生成血管,在体外能形成官腔样结构。内皮祖细胞在糖尿病条件下功能失常并导致缺血后修复性血管新生减少。近年来,大量研究表明,内皮祖细胞在血管损伤修复和血流再灌注方面具有一定效果,但其效果有待进一步提高。因此,我们设想AGGF1蛋白可能通过增强内皮祖细胞功能以治疗糖尿病条件下的血管疾病。同时AGGF1蛋白可能与糖尿病条件下内皮祖细胞功能失常有关。该论文项目设计了一系列分子水平,细胞水平及动物个体水平的实验对这些假设进行了验证并尝试阐明AGGF1调控内皮祖细胞功能以及治疗糖尿病条件下血管疾病的分子机制。本论文以AGGF1为研究对象,探讨其在内皮祖细胞中的功能以及AGGF1蛋白在内皮祖细胞治疗糖尿病后肢缺血中的作用。我们研究发现,在高脂肪食物诱导的Ⅱ型糖尿病小鼠EPCs中,EPCs的血管形成能力、增殖、跨内皮细胞迁移以及迁移能力均较对照组减弱。类似的,相比于野生型(WT)小鼠,来源于Aggf1基因杂合敲除鼠(Aggf1+/-)的EPCs也呈现出较弱的血管形成能力、增殖、跨内皮细胞迁移以及迁移能力。此外,在db/db小鼠EPCs中,EPCs的血管形成能力、增殖、跨内皮细胞迁移以及迁移能力均较对照组减弱,并且Aggf1+/-db/db小鼠EPCs的血管形成能力,增殖,跨内皮细胞迁移以及迁移能力最弱。当用高浓度葡萄糖处理(High glucose,HG)野生型EPCs(模拟糖尿病条件)时,EPCs血管形成、增殖、跨内皮细胞迁移以及迁移能力降低,但是这种高糖处理给EPCs所带来的负面效应能有效的被AGGF1蛋白预处理所拮抗。EPCs在高糖处理后活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平上升,AGGF1蛋白能抑制HG所导致的ROS上升。更重要的是,在治疗上,AGGF1蛋白预处理的EPCs能够显着地增强高脂肪食物诱导的Ⅱ型糖尿病小鼠和db/db小鼠缺血后肢的血流恢复和血管新生。这些结果表明AGGF1蛋白有望发展成为基于EPCs的治疗糖尿病的潜在靶点。分子机制研究显示,高糖处理后Fyn的细胞核内聚集增加,Nrf2的细胞核内聚集减少,从而导致Nrf2的下游靶基因如HO-1、NQO-1、CAT表达受到抑制,最终导致细胞的抗氧化能力下调,但是AGGF1的存在可以下调Fyn的细胞核内聚集,增加Nrf2的细胞核内聚集,从而引起Nrf2的下游靶基因如HO-1、NQO-1、CAT表达上升,最终使EPCs呈现出强的抗氧化应激能力。这表明HG氧化应激所导致的负面效应可以被AGGF1蛋白有效的拮抗。此外,当我们使用PI3K抑制剂Wartmannin时,AGGF1蛋白对HG所诱导的氧化应激的拮抗保护效应消失,当我们使用Akt或者Nrf2的小分子干扰RNA敲低Akt或者Nrf2表达时,AGGF1蛋白对EPCs功能的保护效应消失。以上研究结果表明:(1)AGGF1蛋白是EPCs血管新生功能必需的;(2)AGGF1蛋白可以增强EPCs对糖尿病条件下氧化应激的抵抗能力;(3)AGGF1蛋白可以显着增加EPCs在治疗糖尿病后肢缺血小鼠中的血流恢复能力和血管新生能力;(4)AGGF1通过调控p Akt/Fyn/Nrf2信号通路拮抗糖尿病条件下EPCs功能失常;(5)首次提出AGGF1蛋白治疗可能是一种新的有效的糖尿病血管相关疾病治疗手段。
李慧[9](2019)在《缺血性脑卒中患者冬夏季外周血CD34+、KDR+细胞水平及其影响因素》文中提出目的检测缺血性脑卒中患者慢性期外周血CD34+、KDR+细胞的水平,探讨冬夏季外周血中CD34+、KDR+细胞水平是否存在差异,并分析缺血性脑卒中危险因素对外周血中CD34+、KDR+细胞水平影响,为临床缺血性脑卒中的防治提供新的思路及理论基础。方法选择唐山工人医院神经内科2017年8月至2017年10月和2018年3月至2018年5月收住的高血压相关急性缺血性脑卒中患者各17例,共34例,分别于每位患者发病3个月后和发病9个月后采集其清晨空腹静脉血(根据患者不同的采血时间,17例患者第一次采血点落入冬季,即12月及次年1-2月,第二次采血点落入夏季,即6-8月;另外17例患者第一次采血点落入夏季,第二次采血点落入冬季),运用流式细胞仪对外周血中CD34+、KDR+细胞的数量进行检测,以CD34+、KDR+细胞在CD45弱阳性(CD45dim)细胞群体的百分比表示外周血中各类细胞水平,认为CD45dimCD34+KDR+细胞为内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells,EPCs),探讨冬夏季患者外周血中CD34+、KDR+细胞水平是否存在差异。同时,每次采血时将部分血液标本送检验科检验,进一步分析影响CD34+、KDR+细胞水平的因素,观察指标包括患者收缩压(Systolic blood pressure,SBP)、舒张压(Diastolic blood pressure,DBP)、总胆固醇(Total cholesterol,CHO)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、低密度脂蛋白胆固醇(Low-density lipoprotein,LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(High-density lipoprotein,HDL-C)、血同型半胱氨酸(Homocysteine,HCY)。冬夏季节和不同病程患者外周血CD34+、KDR+细胞水平的比较采用非参数秩和检验,P<0.05为差异有统计学意义;外周血中细胞水平与缺血性脑卒中危险因素的关系的分析,采用Spearman相关检验和线性回归分析,以P<0.05为差异有统计学意义。结果1本研究34例患者,仅在17例患者外周血中检测到CD45dimCD34+KDR+细胞(即EPCs)。并且其在外周血CD45dim细胞群体中所占比值较小。由于本研究中所检测到的以CD45dimCD34+KDR+定义的EPCs的检出率及其在每例患者外周血中所占的百分比均低,所得到的数据的稳定性、可靠性较差,故未对其水平进行季节性比较分析。同时在外周血中检测到了CD45dimCD34+KDR-细胞和CD45dimKDR+CD34-细胞。2比较冬夏季患者外周血CD45dim群体中CD34+、KDR+细胞水平:夏季CD45dimCD34+细胞水平与冬季比较,差异无统计学意义(r=-0.128,P=0.898);冬季CD45dimKDR+细胞的水平较夏季减少,差异有统计学意义(r=-2.152,P=0.031)。3缺血性脑卒中危险因素与外周血CD45dimKDR+细胞水平关系采用单因素分析:在夏季时,SBP(r=-0.520,P=0.002)、TG(r=-0.597,P<0.001)、HCY(r=-0.343,P=0.047)与外周血CD45dimKDR+细胞水平呈负相关,有统计学意义(P<0.05);在冬季时,TG(r=-0.406,P=0.017)和SBP(r=-0.469,P=0.005)与外周血CD45dimKDR+细胞水平呈负相关,有统计学意义(P<0.05);DBP、CHO、LDL-C、HDL-C与外周血CD45dimKDR+细胞水平不存在显着关联(P>0.05)。多因素采用线性回归分析,外周血CD45dimKDR+细胞水平变化的影响因素:SBP(t=-2.638,P=0.013))是冬季时外周血CD45dimKDR+细胞水平的独立相关因素。结论1缺血性脑卒中慢性期患者外周血CD45dimKDR+细胞水平冬季较夏季降低。2缺血性脑卒中慢性期患者外周血中CD45dimim KDR+细胞水平与部分缺血性脑卒中危险因素相关,在冬季时收缩压是其独立相关因素。图5幅;表7个;参116篇。
贺怡然[10](2016)在《鹿茸动员大鼠骨髓内皮祖细胞修复内皮功能的机制研究》文中指出目的:通过观察鹿茸对大鼠下肢缺血模型外周血骨髓来源内皮祖细胞(EPCs)数量及其增殖能力、一氧化氮(NO)含量以及血管内皮生长因子(VEGF)表达水平的影响,探讨鹿茸动员大鼠骨髓EPCs修复内皮功能,促进缺血肢体血管新生的作用机制。方法:采用结扎法建立大鼠下肢缺血模型,将成模大鼠随机分为模型组,鹿茸高、中、低剂量组和复方丹参片组,空白组为同批次正常大鼠仅作皮肤切开缝合,每组15只。于术后第二天开始灌胃给药,鹿茸高、中、低剂量组分别按照0.572g·kg-1、0.286g·kg-1、0.143g·kg-1;复方丹参片组为0.286g·kg-1,每天灌胃给药1次,连续14天。正常组和模型组给予等剂量蒸馏水。分别在术后第3天、第7天、第14天,各组随机取大鼠5只,采用全自动生化仪检测大鼠外周血谷草转氨酶(AST)、肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)的表达水平;取左侧大腿腓肠肌用免疫组化的方法进行处理,观察缺血下肢毛细血管结构的恢复,计算毛细血管密度(单位视野蓝染面积/单位视野面积);左下肢腓肠肌用苏木精-伊红(HE)染色观察期病理改变。并且在第7天从外周血中分离、培养EPCs,然后收集贴壁细胞利用流式细胞仪来鉴定CD34/CD133表型,使用CCK-8法检测细胞数量变化及其增殖能力,采用ELISA法检测血管内皮生长因子(VEGF)的表达水平并用硝酸还原酶法检测一氧化氮(NO)含量。结果:1.利用流式细胞仪来鉴定CD34/CD133均阳性表达,表明各组均出现了内皮祖细胞。2.鹿茸高剂量组能够增加下肢缺血大鼠外周血中EPCs的数量,并且显着提升其增殖能力;明显扩增其外周血中NO的含量;促进VEGF蛋白的表达。3.鹿茸高剂量组在术后第3天、第7天和第14天时均能够显着减低下肢缺血大鼠血清AST、CK、LDH的活力水平,与前人实验结果相符。4.术后第7天、第14天,鹿茸高剂量组显着提升下肢缺血大鼠MVD值,但在术后第3天,其作用效果并不明显。5.鹿茸能够改善下肢缺血大鼠肌细胞萎缩,间质增生的病理改变;增加了肌纤维间的血管。结论:鹿茸能够动员内皮祖细胞修复内皮功能,促进血管新生,减轻患肢缺血状态。为治疗下肢缺血疾病提供了部分依据,具有深远的影响意义。
二、血管内皮祖细胞对缺血肢体血管生成的影响(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、血管内皮祖细胞对缺血肢体血管生成的影响(论文提纲范文)
(1)补肾安胎冲剂对大鼠骨髓来源EPCs细胞增殖、迁移和分化的影响及其治疗肾虚型早期先兆流产的临床观察(论文提纲范文)
中文摘要 |
ABSTRACT |
常用缩略中英文词表 |
第一部分 实验研究 补肾安胎冲剂对大鼠骨髓EPCs细胞增殖、迁移和分化的影响 |
前言 |
1 实验目的 |
2 实验材料 |
2.1 实验动物 |
2.2 实验主要试剂及仪器设备 |
2.2.1 主要试剂 |
2.2.2 主要仪器 |
2.3 实验药物 |
3 实验方法 |
3.1 大鼠骨髓来源EPCs的鉴定 |
3.1.1 双荧光染色法鉴定 |
3.1.2 免疫荧光染色 |
3.1.3 流式细胞仪动态检测EPC表面标志 |
3.2 制备补肾安胎冲剂中药药物血清 |
3.3 不同浓度的补肾安胎冲剂干预对EPCs增殖活性的影响 |
3.4 采用补肾安胎冲剂的不同干预时间对EPCs增殖的影响 |
3.5 Transwell法检测EPCs的迁移能力 |
3.6 RT-qPCR检测补肾安胎冲剂干预下EPCs向VECs分化的情况 |
3.6.1 Total RNA抽提 |
3.6.2 Total RNA质检 |
3.6.3 反转录(First Strand cDNA Synthesis) |
3.6.4 荧光定量PCR检测 |
3.6.5 计算相对表达量 |
4 大鼠骨髓来源EPCs的鉴定 |
4.1 双荧光染色法鉴定 |
4.2 免疫荧光法检测 |
4.3 流式细胞仪检测 |
5 补肾安胎冲对EPCs增殖活性的影响 |
5.1 不同浓度补肾安胎冲剂干预对EPCs增殖活性的影响 |
5.2 补肾安胎冲剂的不同干预时间对EPCs增殖活性的影响 |
5.3 各组EPCs增殖率结果 |
6 补肾安胎冲剂对EPCs迁移能力的影响 |
7 补肾安胎冲剂对EPCs分化的影响 |
8 讨论 |
8.1 大鼠骨髓来源EPCs的分离培养与鉴定 |
8.2 补肾安胎冲剂通过促进EPCs增殖和迁移参与母胎界面血管重铸 |
8.3 补肾安胎冲剂通过促进EPCs分化为VECs参与血管新生 |
9 结论 |
参考文献 |
第二部分 临床研究 补肾安胎冲剂联合地屈孕酮治疗肾虚型早期先兆流产的临床观察 |
前言 |
1 临床资料 |
1.1 病例来源 |
1.2 诊断标准 |
1.2.1 西医诊断标准 |
1.2.2 中医肾虚证证候诊断标准 |
1.2.3 纳入标准 |
1.2.4 排除标准 |
1.2.5 病例剔除及脱落标准 |
2 研究方案 |
2.1 治疗方案 |
2.1.1 对照组(地屈孕酮) |
2.1.2 观察组(补肾安胎冲剂+地屈孕酮片) |
2.1.3 给药疗程 |
2.2 标本的处理 |
2.3 观察指标 |
2.3.1 疗效性指标 |
2.3.2 安全性指标 |
2.4 疗效评定标准 |
2.4.1 中医证候分级量化标准 |
2.4.2 中医证候疗效判定标准 |
2.4.3 临床综合疗效判定标准 |
2.5 统计方法 |
3 研究结果 |
3.1 一般资料 |
3.1.1 两组年龄、孕周、不良妊娠史比较 |
3.1.2 两组治疗前病情程度比较 |
3.2 两组患者治疗前后中医证候积分比较 |
3.3 两组治疗后中医证候疗效比较 |
3.4 两组治疗后临床综合疗效比较 |
3.5 治疗前后两组患者血清P、E_2水平比较 |
3.5.1 两组患者治疗前后血清P水平比较 |
3.5.2 两组患者治疗前后血清E_2水平比较 |
3.6 两组患者治疗前后外周血VEGF表达水平比较 |
3.7 安全性观察 |
4 讨论 |
4.1 早期先兆流产与肾虚的关系 |
4.2 补肾安胎冲剂的方药分析 |
4.3 血清孕酮、雌二醇在先兆流产中的检测意义 |
4.4 VEGF表达水平在先兆流产中的检测意义 |
4.5 结果分析 |
5 结论 |
结语 |
参考文献 |
综述 早期先兆流产的中西医研究现状 |
参考文献 |
个人简介 |
致谢 |
(2)lncRNA TUG1/miR-320对EPCs移植改善小鼠下肢缺血及促进血管新生的研究(论文提纲范文)
摘要 |
abstract |
中英文缩略词表 |
第1章 前言 |
第2章 下肢缺血不同时间的组织损伤情况 |
2.1 实验材料 |
2.1.1 实验动物和分组 |
2.1.2 主要实验试剂 |
2.1.3 实验仪器 |
2.2 实验方法 |
2.2.1 主要试剂配制 |
2.2.2 动物模型的建立 |
2.2.3 激光多普勒检测下肢血流速度 |
2.2.4 获取腓肠肌标本 |
2.2.5 组织石蜡包埋切片及HE染色 |
2.2.6 RNA的提取及qRT-PCR |
2.2.7 蛋白质印迹法(Western blot) |
2.3 统计学处理结果 |
2.4 实验结果 |
2.4.1 缺血后下肢血流速度下降 |
2.4.2 缺血后可损伤腓肠肌细胞 |
2.4.3 腓肠肌细胞损伤程度与lncRNA TUG1 下降有关 |
2.4.4 细胞损伤相关蛋白分析 |
2.5 讨论 |
2.6 小结 |
第3章 EPCs鉴定及培养 |
3.1 实验材料 |
3.1.1 实验动物 |
3.1.2 主要实验试剂 |
3.1.3 实验仪器 |
3.2 实验方法 |
3.2.1 骨髓细胞的提取 |
3.2.2 细胞传代 |
3.2.3 EPCs流式鉴定 |
3.2.4 CCK-8 检测细胞生长增殖能力 |
3.2.5 Transwell检测细胞迁移能力 |
3.2.6 基质胶检测细胞成血管能力 |
3.3 统计学处理结果 |
3.4 实验结果 |
3.4.1 裸鼠骨髓细胞中含有EPCs |
3.4.2 骨髓提取的EPCs具有增殖潜能 |
3.4.3 骨髓提取的EPCs具有迁移能力 |
3.4.4 骨髓提取的EPCs具有成血管能力 |
3.5 讨论 |
3.6 小结 |
第4章 EPCs移植对裸鼠下肢缺血的影响 |
4.1 实验材料 |
4.1.1 实验动物和分组 |
4.1.2 实验细胞 |
4.1.3 主要实验试剂 |
4.1.4 主要仪器 |
4.2 实验方法 |
4.2.1 动物模型的建立 |
4.2.2 EPCs移植 |
4.2.3 激光多普勒检测下肢血流变化 |
4.2.4 获取腓肠肌标本 |
4.2.5 组织石蜡包埋及HE染色 |
4.2.6 免疫组化检测腓肠肌微血管 |
4.2.7 RNA的提取及qRT-PCR |
4.2.8 蛋白质印迹法(Western blot) |
4.3 统计学处理结果 |
4.4 实验结果 |
4.4.1 EPCs移植可改善下肢缺血 |
4.4.2 EPCs移植减少缺血后腓肠肌细胞损伤 |
4.4.3 EPCs移植可增加缺血后腓肠肌微血管密度 |
4.4.4 EPCs移植改善下肢缺血与lnc RNA TUG1 上升有关 |
4.4.5 缺血改善相关蛋白分析 |
4.5 讨论 |
4.6 小结 |
全文结论 |
攻读硕士期间的研究成果 |
致谢 |
参考文献 |
综述 |
参考文献 |
(3)人参皂苷Rg1对小鼠骨髓内皮祖细胞体外增殖的影响及其作用机制的研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
第一章 文献综述 |
1.1 内皮祖细胞研究进展 |
1.1.1 内皮祖细胞的发现及其意义 |
1.1.2 内皮祖细胞的培养与鉴定 |
1.1.3 内皮祖细胞系 |
1.1.4 内皮祖细胞的应用研究 |
1.1.5 内皮祖细胞增殖研究进展 |
1.2 人参皂苷Rg1的药效及其作用机制的研究进展 |
1.2.1 人参皂苷Rg1药效研究的概述 |
1.2.2 人参皂苷Rg1作用机制的研究 |
1.3 本研究的目的及总体设计 |
第二章 小鼠骨髓EPCs的分离、培养与鉴定 |
2.1 材料与方法 |
2.1.1 实验动物 |
2.1.2 主要试剂 |
2.1.3 主要仪器 |
2.1.4 差速贴壁法 |
2.1.5 二次酶消化法 |
2.1.6 纯化传代细胞培养 |
2.1.7 集落形成实验 |
2.1.8 细胞表面抗原表达检测 |
2.2 结果与分析 |
2.2.1 细胞形态学观察结果 |
2.2.2 集落特征 |
2.2.3 细胞表面抗原阳性细胞率 |
2.3 讨论 |
2.4 小结 |
第三章 小鼠骨髓内皮祖细胞系MBMME2的建立与鉴定 |
3.1 材料与方法 |
3.1.1 实验动物 |
3.1.2 主要试剂 |
3.1.3 主要仪器 |
3.1.4 骨髓EPCs分离和纯化 |
3.1.5 细胞克隆培养和筛选 |
3.1.6 传代培养 |
3.1.7 细胞系的保存与复苏 |
3.1.8 细胞生长对FBS依赖性的观察 |
3.1.9 细胞增殖能力的观察 |
3.1.10 细胞周期分析 |
3.1.11 核型分析 |
3.1.12 流式细胞术 |
3.1.13 细胞免疫荧光染色 |
3.1.14 体外成血管实验 |
3.1.15 统计学分析 |
3.2 结果与分析 |
3.2.1 细胞形态学观察结果 |
3.2.2 细胞生长特性 |
3.2.3 细胞周期分布 |
3.2.4 染色体核型 |
3.2.5 细胞表面抗原阳性细胞率 |
3.2.6 体外成血管实验 |
3.3 讨论 |
3.4 小结 |
第四章 人参皂苷Rg1对小鼠骨髓内皮祖细胞体外增殖的影响研究 |
4.1 材料与方法 |
4.1.1 实验细胞 |
4.1.2 主要试剂 |
4.1.3 主要仪器 |
4.1.4 细胞传代培养 |
4.1.5 MTT比色法 |
4.1.6 集落形成实验 |
4.1.7 细胞周期分析 |
4.1.8 统计学分析 |
4.2 结果与分析 |
4.2.1 细胞增殖速率 |
4.2.2 集落形成能力 |
4.2.3 细胞周期分布 |
4.3 讨论 |
4.4 小结 |
第五章 人参皂苷Rg1 对小鼠内皮祖细胞系MBMME2 细胞生长影响的转录组学研究 |
5.1 材料与方法 |
5.1.1 主要试剂 |
5.1.2 主要仪器 |
5.1.3 实验分组 |
5.1.4 RNA-Seq流程 |
5.1.5 RT-q PCR |
5.2 结果与分析 |
5.2.1 RNA样本浓度与质量检测结果 |
5.2.2 测序数据质量评价 |
5.2.3 样本间Venn分析 |
5.2.4 样本间的PCA分析 |
5.2.5 差异基因聚类分析 |
5.2.6 差异基因表达分析 |
5.2.7 功能注释分析 |
5.2.8 GO功能富集分析 |
5.2.9 KEGG富集分析 |
5.2.10 DEGs信号通路分析 |
5.2.11 主要差异蛋白互作网络 |
5.2.12 RT-q PCR |
5.3 讨论 |
5.3.1 人参皂苷Rg1对MBMME2 促增殖作用机制 |
5.3.2 MBMME2 对人参皂苷Rg1 的耐受机制 |
5.4 小结 |
结语 |
参考文献 |
附录 |
附录一 专业名词缩略语表(Abbreviations) |
附录二 攻读学位期间发表的主要论文及专利 |
致谢 |
(4)自体骨髓源性内皮祖细胞移植治疗缺血性脑卒中的临床研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
第一章 前言 |
1. 脑卒中概况 |
2. 干细胞与脑卒中 |
3. BMSCs与脑卒中 |
4. EPCs与脑卒中 |
5. 研究设计 |
参考文献 |
第二章 自体骨髓源性内皮祖细胞移植对急性期缺血性脑卒中的安全性评价及初步疗效评估 |
2.1 目的 |
2.2 研究方法 |
2.3 结果 |
2.4 讨论 |
参考文献 |
第三章 自体骨髓源性内皮祖细胞移植对慢性期缺血性脑卒中的安全性评价及初步疗效评估 |
3.1 目的 |
3.2 研究方法 |
3.3 结果 |
3.4 讨论 |
参考文献 |
全文小结 |
英文缩略词表 |
附图 |
附表 |
综述 |
参考文献 |
在读期间成绩 |
致谢 |
(5)人源内皮克隆形成细胞(ECFCs)旁分泌对成熟血管和皮肤细胞生物学影响的实验研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
1 前言 |
2 实验材料 |
2.1 一般资料 |
2.2 主要仪器 |
2.3 实验试剂 |
3 实验方法 |
3.1 ECFCs细胞的提取 |
3.2 ECFCs细胞传代 |
3.3 ECFCs细胞冻存 |
3.4 ECFCs表面抗原检测 |
3.5 ECFCs检测鉴定--免疫荧光标记 |
3.6 Matrigel基质胶成管实验 |
3.7 细胞条件培养基ECFCs-CM的制备 |
3.8 抗体芯片检测ECFCs-CM中细胞因子表达 |
3.9 ELISA法检测ECFCs-CM中细胞因子表达情况 |
3.10 CCK8检测ECFCs-CM对HUVECs和HDFs增殖能力的影响 |
3.11 迁移--划痕实验 |
3.12 迁移--transwell共培养 |
3.13 细胞凋亡 |
3.14 细胞周期检测 |
3.15 丝素蛋白/海藻酸钠水凝胶的制备及表征检测 |
4 数据处理和统计学分析 |
5 结果 |
5.1 ECFCs培养及传代 |
5.2 免疫荧光染色ECFCs检测鉴定 |
5.3 流式细胞仪检测ECFCs表面抗原检测鉴定 |
5.4 ECFCs细胞的成管能力检测 |
5.5 抗体芯片法检测ECFCs-CM细胞因子表达 |
5.6 ELISA法检测ECFCs-CM中细胞因子表达情况 |
5.7 CCK-8法检测ECFCs-CM对HUVECs增殖能力的影响 |
5.8 CCK-8法检测ECFCs-CM对HDFs增殖能力的影响 |
5.9 细胞划痕法检测ECFCs-CM对HUVECs迁移能力的影响 |
5.10 细胞划痕法检测ECFCs-CM对HDFs迁移能力的影响 |
5.11 Transwell间接共培养法检测ECFCs-CM对HUVECs迁移能力的影响 |
5.12 Transwell间接共培养法检测ECFCs-CM对HDFs迁移能力的影响 |
5.13 流式细胞仪法检测ECFCs-CM对HUVECs和HDFs细胞凋亡的影响 |
5.14 流式细胞仪检测ECFCs-CM对HUVECs细胞周期的影响 |
5.15 流式细胞仪检测ECFCs-CM对HDFs细胞周期的影响 |
5.16 SF/ALG水凝胶合成大体形态观察 |
5.17 SF/ALG水凝胶傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析 |
5.18 SF/ALG水凝胶孔隙率分析 |
6 讨论 |
6.1 为什么选择人源性ECFCs作为糖尿病慢性损伤修复的细胞 |
6.2 如何通过表面抗原检测鉴定ECFCs细胞 |
6.3 为何采用抗体芯片法对ECFCs-CM中细胞因子进行检测 |
6.4 ECFCs-CM中细胞因子表达情况的分析 |
6.5 ECFCs-CM对HUVECs和HDFs增殖能力的影响 |
6.6 胞划痕法检测ECFCs-CM对HUVECs和HDFs迁移能力的影响 |
6.7 Transwell间接共培养法检测ECFCs-CM对HUVECs和HDFs迁移能力的影响 |
7 结论 |
8 展望 |
参考文献 |
综述 |
参考文献 |
附录 |
攻读学位期间科研着作情况 |
致谢 |
(6)补肾活血方通过Notch通路促进血管新生对脊髓损伤的修复作用及机制研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
引言 |
第一章 文献研究 |
1.1 脊髓损伤概况 |
1.1.1 脊髓的基本结构与解剖 |
1.1.2 脊髓损伤的定义及临床表现 |
1.1.3 脊髓损伤的流行病学 |
1.1.4 脊髓损伤的发病因素 |
1.1.5 急性脊髓损伤动物模型 |
1.2 急性脊髓损伤发病机制 |
1.2.0 脊髓组织中微循环血管的破坏与血管新生 |
1.2.1 炎症反应 |
1.2.2 氧化应激反应 |
1.2.3 神经细胞的自噬、凋亡 |
1.2.4 血-脊髓屏障损害 |
1.2.5 胶质瘢痕的形成 |
1.3 脊髓血管造影中的应用与血管新生的相关机制研究 |
1.3.1 micro-CT在脊髓血管造影中的应用 |
1.3.2 血管新生相关因子 |
1.4 中医对急性脊髓损伤病机的认识 |
1.5 中医对急性脊髓损伤的治疗 |
第二章 NOTCH调控VEGF、ANG-1/TIE-2等信号通路参与脊髓损伤后血管新生机制的研究 |
2.1 实验材料 |
2.1.1 实验动物 |
2.1.2 主要实验仪器与设备 |
2.1.3 主要试剂与耗材 |
2.2 实验方法 |
2.2.1 实验分组设计 |
2.2.2 急性脊髓损伤动物模型的建立及护理 |
2.2.3 BBB评分 |
2.2.4 组织病理形态学检测 |
2.2.5 microfil血管灌注实验 |
2.2.6 Western blot |
2.2.7 micro-CT扫描 |
2.2.8 统计学分析 |
2.3 实验结果 |
2.3.1 脊髓损伤后行为学评分BBB评分 |
2.3.2 HE病理染色 |
2.3.3 CD31荧光染色评价大鼠SCI后脊髓血管面积 |
2.3.4 microfil血管造影评价SCI后脊髓血管密度 |
2.3.5 脊髓损伤后血管新生及Notch-1等相关因子蛋白的表达情况 |
2.3.6 星形胶质细胞在脊髓损伤后的活化情况 |
2.3.7 脊髓损伤后神经元出现损伤 |
2.4 讨论 |
2.4.1 SCI模型中,前期BBB评分恢复较快,后期神经功能的康复成为难点 |
2.4.2 脊髓损伤后机体出现代偿性血管新生 |
2.4.3 Notch调控VEGF、Ang-1/Tie-2信号通路参与脊髓损伤后的血管新生 |
2.4.4 脊髓损伤后星形胶质细胞出现活化 |
2.4.5 脊髓损伤后神经元出现凋亡 |
2.5 小结 |
第三章 NOTCH-1和EGFL-8蛋白对血管形成及神经保护的作用 |
3.1 实验材料 |
3.1.1 细胞 |
3.1.2 主要实验仪器与设备 |
3.1.3 主要试剂与耗材 |
3.2 实验方法 |
3.2.1 MTS实验检测细胞活性 |
3.2.2 细胞划痕和tranwell实验 |
3.2.3 HUVEC细胞管腔形成(tube formation)实验 |
3.2.4 细胞免疫荧光实验 |
3.2.5 蛋白印迹实验 |
3.3 实验结果 |
3.3.1 Notch-1蛋白对HUVEC血管内皮细胞的影响 |
3.3.2 Notch-1蛋白对Schwann细胞的影响 |
3.3.3 EGFL-8蛋白对HUVEC血管内皮细胞的影响 |
3.3.4 EGFL-8蛋白对Schwann cell的影响 |
3.4 讨论 |
3.4.1 Notch信号通路与血管新生及神经保护功能 |
3.4.2 EGFL-8蛋白对HUVEC血管内皮细胞和Schwann细胞的影响 |
3.5 小结 |
第四章 补肾活血方通过NOTCH促进血管新生对急性脊髓损伤的修复作用及机制研究 |
4.1 实验材料 |
4.1.1 实验动物和细胞 |
4.1.2 主要实验仪器与设备 |
4.2 实验方法 |
4.2.1 补肾活血方的制备 |
4.2.2 HUVEC的培养 |
4.2.3 MTS实验检测细胞活力 |
4.2.4 BSHXF干预细胞后对HUVEC划痕和transwell迁移实验的影响 |
4.2.5 BSHXF对HUVEC细胞管腔形成的影响 |
4.2.6 鸡胚绒毛尿囊膜模型(CAM) |
4.2.7 BSHXF对胚体外置明胶海绵血管新生的影响 |
4.2.8 动物实验分组 |
4.2.9 急性脊髓损伤动物模型的建立及护理(同前) |
4.2.10 BBB行为学评分 |
4.2.11 组织病理形态学检测(同前) |
4.2.12 microfil血管灌注(同前) |
4.2.13 Western blot免疫印迹实验 |
4.2.14 脊髓组织中ROS活性的检测 |
4.2.15 RT-PCR |
4.2.16 micro-CT扫描(同前) |
4.2.17 统计学分析 |
4.3 实验结果 |
4.3.1 BSHXF对HUVEC细胞的毒性实验 |
4.3.2 BSHXF促进HUVECs划痕愈合 |
4.3.3 BSHXF对HUVEC细胞在transwell小室中迁移的影响 |
4.3.4 BSHXF促进HUVEC管腔形成 |
4.3.5 BSHXF对MAPK信号通路的影响 |
4.3.6 BSHXF促进尿囊膜血管新生和诱导血管向明胶海绵长入 |
4.3.7 BSHXF可改善脊髓损伤后BBB评分 |
4.3.8 脊髓取材外观图 |
4.3.9 BSHXF可改善SCI后的病理改变 |
4.3.10 CD31免疫荧光染色 |
4.3.11 microfil血管造影结果 |
4.3.12 BSHXF对Notch-1、VEGF、Ang-1/Tie2和EGFL-8蛋白的影响 |
4.3.13 BSHXF对Notch通路、VEGF、Ang-1/Tie2等基因的影响 |
4.3.14 补肾活血方对脊髓损伤后ROS的影响 |
4.3.15 补肾活血方对星形胶质细胞的影响 |
4.3.16 补肾活血方对脊髓损伤后神经元的影响 |
4.4 讨论 |
4.4.1 补肾活血方具有促进血管新生的作用 |
4.4.2 补肾活血方通过血管新生对脊髓损伤的治疗作用 |
4.4.3 补肾活血方促进脊髓损伤后血管新生的机制 |
4.4.4 补肾活血方减轻脊髓损伤后氧化应激反应 |
4.4.5 补肾活血方对脊髓损伤后神经细胞的影响 |
4.5 小结 |
结语 |
参考文献 |
附录 《土大黄苷通过NFATcl和R0S通路抑制破骨细胞分化和骨吸收功能》 |
在校期间发表论文情况 |
附件 |
致谢 |
(7)慢性肾脏病证素特征及黄芪丹参有效单体干预缺血损伤肾小球内皮细胞血管生成的机制研究(论文提纲范文)
提要 |
abstract |
引言 |
第一部分 临床研究 |
1 研究目的 |
2 研究对象及来源 |
3 诊断标准 |
3.1 CKD诊断标准 |
3.2 CKD分期标准 |
3.3 中医证候要素诊断标准 |
4 纳入标准 |
5 排除标准 |
6 研究方法 |
6.1 研究设计 |
6.2 中医证素调查量表制定 |
6.3 调查方法 |
6.4 收集资料 |
6.5 统计方法 |
7 结果 |
7.1 性别分布 |
7.2 年龄分布 |
7.3 原发病情况 |
7.4 合并症及并发症情况 |
7.5 CKD各分期人数分布情况 |
7.6 常见症状分布情况 |
7.7 中医证候要素构成情况 |
7.8 CKD不同分期中医证候要素分布演变情况 |
7.9 中医证候要素与实验室指标的关系 |
8 讨论 |
8.1 中医学对本病的认识 |
8.2 证候、证素在CKD中医病机研究中的应用 |
8.3 研究结果分析 |
8.4 气虚血瘀是CKD的基本病机 |
9 结论 |
第二部分 实验研究 |
实验一 毛蕊异黄酮、丹参酮ⅡA及其配伍对缺血损伤HRGEC的保护作用 |
1 实验目的 |
2 实验材料 |
2.1 细胞株 |
2.2 主要试剂 |
2.3 主要仪器及耗材 |
2.4 实验用药物和试剂的配制 |
3 实验方法 |
3.1 细胞培养 |
3.2 实验分组 |
3.3 MTT比色实验 |
3.4 凋亡实验 |
3.5 粘附实验 |
3.6 活性氧检测实验 |
3.7 统计学方法 |
4 实验结果 |
4.1 毛蕊异黄酮不同浓度作用下细胞存活力比较 |
4.2 丹参酮ⅡA不同浓度作用下细胞存活力比较 |
4.3 毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA不同浓度配伍作用下细胞存活力比较 |
4.4 毛蕊异黄酮、丹参酮ⅡA及其配伍对HRGEC存活率的影响 |
4.5 毛蕊异黄酮、丹参酮ⅡA及其配伍对HRGEC凋亡的影响 |
4.6 毛蕊异黄酮、丹参酮ⅡA及其配伍对HRGEC粘附能力的影响 |
4.7 毛蕊异黄酮、丹参酮ⅡA及其配伍对HRGEC活性氧的影响 |
5 讨论 |
5.1 毛蕊异黄酮、丹参酮ⅡA及其配伍的最佳药物作用浓度筛选 |
5.2 毛蕊异黄酮、丹参酮ⅡA及其配伍对缺血损伤HRGEC的保护作用 |
6 结论 |
实验二 毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍干预缺血损伤HRGEC血管生成的研究 |
1 实验目的 |
2 实验材料 |
2.1 细胞株 |
2.2 主要试剂 |
2.3 主要仪器及耗材 |
2.4 实验用药物和试剂的配制 |
3 实验方法 |
3.1 细胞培养 |
3.2 实验分组 |
3.3 细胞迁移实验 |
3.4 Matrigel血管生成实验 |
3.5 细胞能量代谢实验 |
3.6 RNA的提取与质检 |
3.7 转录组测序 |
3.8 测序结果q-RT-PCR验证 |
3.9 Western Blot法检测VEGFA、CS蛋白表达 |
3.10 统计学方法 |
4 结果 |
4.1 毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍对HRGEC迁移的影响 |
4.2 毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍对HRGEC血管生成的影响 |
4.3 毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍对缺血损伤HRGEC线粒体呼吸的影响 |
4.4 转录组测序基因组比对结果 |
4.5 转录组测序差异基因表达分析结果 |
4.6 转录组测序差异基因富集分析 |
4.7 转录组测序实验结果验证 |
4.8 Western Blot检测VEGFA、CS蛋白表达变化 |
5 讨论 |
5.1 毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍对缺血损伤HRGEC血管生成的影响 |
5.2 毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍对缺血损伤HRGEC线粒体呼吸功能的影响 |
5.3 毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍对缺血损伤HRGEC基因表达谱的影响 |
5.4 毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍对缺血损伤HRGECVEGFA、CS表达的影响 |
6 结论 |
实验三 毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍对SGK1/TP53/SLC2A3 信号通路的调节作用 |
1 实验目的 |
2 实验材料 |
2.1 细胞株 |
2.2 主要试剂 |
2.3 主要仪器及耗材 |
2.4 实验用药物和试剂的配制 |
3 实验方法 |
3.1 细胞培养 |
3.2 实验分组 |
3.3 Western Blot法检测SGK1、TP53、SLC2A3 的蛋白表达 |
3.4 统计学方法 |
4 结果 |
4.1 EMD638683 干预后各组SGK1 蛋白表达变化 |
4.2 EMD638683干预后各组TP53蛋白表达变化 |
4.3 EMD638683 干预后各组SLC2A3 蛋白表达变化 |
5 讨论 |
6 结论 |
结语 |
参考文献 |
综述 中医药促血管生成作用的研究进展 |
参考文献 |
附录 |
致谢 |
查新报告 |
论文着作 |
(8)血管生长因子AGGF1通过增强内皮祖细胞功能治疗糖尿病小鼠后肢缺血(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
1 引言 |
1.1 糖尿病 |
1.2 内皮祖细胞 |
1.3血管新生与AGGF1 |
1.4 研究意义 |
2 材料和方法 |
2.1 实验相关仪器 |
2.2 实验相关软件 |
2.3 实验小鼠 |
2.4 细胞系和细胞培养 |
2.5 内皮祖细胞的分离与培养 |
2.6 内皮祖细胞的鉴定 |
2.7 抗体 |
2.8 鼠尾DNA提取与基因型PCR鉴定 |
2.9 Ⅱ型糖尿病模型的高脂肪食物诱导 |
2.10 小鼠后肢缺血模型的建立 |
2.11 慢病毒的包装与感染 |
2.12 管腔形成实验(tube formation assay) |
2.13 细胞增殖实验 |
2.14 跨内皮迁移实验 |
2.15 划痕实验 |
2.17 细胞siRNA转染 |
2.18 重组人AGGF1蛋白的诱导表达纯化 |
2.19 RNA提取及c DNA第一链合成 |
2.20 实时荧光定量 PCR(Quantitative Real-time PCR) |
2.21 免疫印迹试验(Western blot) |
2.22 免疫组织化学检测 |
2.23 数据分析 |
3 结果 |
3.1 骨髓单个核细胞的分离与向内皮祖细胞的诱导培养、鉴定 |
3.2 AGGF1可能参与内皮祖细胞的分化 |
3.3 AGGF1是内皮祖细胞促血管新生功能必需的 |
3.4 AGGF1对高葡萄糖条件下内皮祖细胞功能失常具有保护作用 |
3.5 AGGF1促进Ⅱ型糖尿病小鼠后肢缺血模型中内皮祖细胞介导的血管新生与血流恢复 |
3.6 AGGF1在内皮祖细胞中拮抗高糖诱导的氧化应激 |
3.7 AGGF1 通过Akt/Fyn/Nrf2 信号通路参与内皮祖细胞氧化应激 |
3.8 敲低Akt表达,Wortmannin处理和敲低Nrf2 表达可降低AGGF1 依赖性的EPCs促血管新生功能 |
4 讨论 |
5 总结和展望 |
致谢 |
参考文献 |
附录Ⅰ 攻读学位期间发表论文目录 |
本文中所用的英文缩略语对照表 |
(9)缺血性脑卒中患者冬夏季外周血CD34+、KDR+细胞水平及其影响因素(论文提纲范文)
摘要 |
abstract |
英文缩略表 |
引言 |
第1章 实验研究 |
1.1 研究对象 |
1.1.1 诊断标准 |
1.1.2 纳入标准 |
1.1.3 排除标准 |
1.1.4 退组标准 |
1.2 研究方法 |
1.2.1 资料收集 |
1.2.2 外周血CD34+、KDR+细胞检测 |
1.2.3 统计学方法 |
1.3 结果 |
1.3.1 外周血中CD45dimCD34+KDR+细胞检测结果 |
1.3.2 不同季节患者外周血CD45dim群体中CD34+、KDR+细胞水平的比较 |
1.3.3 缺血性脑卒中患者慢性期外周血中CD34+、KDR+细胞的比较 |
1.3.4 不同季节患者的一般情况、临床及实验室指标比较 |
1.3.5 外周血中CD45dim KDR+细胞不同季节中的影响因素分析 |
1.4 讨论 |
1.4.1 流式细胞术鉴定CD34+、KDR+细胞的原理 |
1.4.2 外周血中的CD34+、KDR+细胞 |
1.4.3 高血压合并缺血性脑卒中 |
1.4.4 外周血中CD34+、KDR+细胞季节性变化 |
1.4.5 影响CD34+、KDR+细胞的因素 |
1.4.6 研究的创新、局限与展望 |
1.5 结论 |
参考文献 |
第2章 综述 内皮祖细胞及其临床应用 |
2.1 内皮祖细胞生物学特性 |
2.1.1 EPCs的来源 |
2.1.2 EPCs的表型与鉴别 |
2.1.3 EPCs的动员和归巢 |
2.1.4 EPCs的调控因素 |
2.2 内皮祖细胞的研究与应用 |
2.2.1 EPCs在动物缺血模型中的研究 |
2.2.2 EPCs修复心肌细胞 |
2.2.3 EPCs治疗慢性肾病 |
2.2.4 EPCs治疗肢体缺血及促进创伤愈合 |
2.2.5 EPCs改善糖尿病血管形成能力 |
2.2.6 EPCs在肿瘤疾病中的研究 |
2.2.7 EPCs在缺血性脑卒中的研究与展望 |
参考文献 |
附录 A 随访信息登记表 |
结论 |
致谢 |
导师简介 |
作者简介 |
学位论文数据集 |
(10)鹿茸动员大鼠骨髓内皮祖细胞修复内皮功能的机制研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
引言 |
一、材料和方法 |
1. 实验材料 |
2. 实验方法 |
3. 统计学分析 |
二、结果 |
2.1 外周血中EPCs的鉴定 |
2.2 鹿茸对下肢缺血大鼠外周血EPSs数量及其增殖能力的影响 |
2.3 鹿茸对下肢缺血大鼠VEGF水平的影响 |
2.4 鹿茸对下肢缺血大鼠NO含量的影响 |
2.5 鹿茸对下肢缺血大鼠不同时间点的血清AST、CK和LDH活力水平的影响 |
2.6 鹿茸对下肢缺血大鼠不同时间点毛细血管密度的影响 |
2.7 病理组织学观察 |
三、结论 |
四、讨论 |
结语 |
参考文献 |
综述 内皮祖细胞与肢体缺血性疾病的研究进展 |
参考文献 |
附录 |
致谢 |
四、血管内皮祖细胞对缺血肢体血管生成的影响(论文参考文献)
- [1]补肾安胎冲剂对大鼠骨髓来源EPCs细胞增殖、迁移和分化的影响及其治疗肾虚型早期先兆流产的临床观察[D]. 杨春荣. 安徽中医药大学, 2021(01)
- [2]lncRNA TUG1/miR-320对EPCs移植改善小鼠下肢缺血及促进血管新生的研究[D]. 钱伟. 南昌大学, 2020(08)
- [3]人参皂苷Rg1对小鼠骨髓内皮祖细胞体外增殖的影响及其作用机制的研究[D]. 唐琳. 湖南师范大学, 2020(01)
- [4]自体骨髓源性内皮祖细胞移植治疗缺血性脑卒中的临床研究[D]. 方杰. 南方医科大学, 2020
- [5]人源内皮克隆形成细胞(ECFCs)旁分泌对成熟血管和皮肤细胞生物学影响的实验研究[D]. 郭晓瑞. 南方医科大学, 2020(01)
- [6]补肾活血方通过Notch通路促进血管新生对脊髓损伤的修复作用及机制研究[D]. 何剑波. 广州中医药大学, 2020(06)
- [7]慢性肾脏病证素特征及黄芪丹参有效单体干预缺血损伤肾小球内皮细胞血管生成的机制研究[D]. 齐振强. 山东中医药大学, 2019(05)
- [8]血管生长因子AGGF1通过增强内皮祖细胞功能治疗糖尿病小鼠后肢缺血[D]. 李勇. 华中科技大学, 2019(01)
- [9]缺血性脑卒中患者冬夏季外周血CD34+、KDR+细胞水平及其影响因素[D]. 李慧. 华北理工大学, 2019(01)
- [10]鹿茸动员大鼠骨髓内皮祖细胞修复内皮功能的机制研究[D]. 贺怡然. 山西省中医药研究院, 2016(12)