一、寄生虫cDNA文库的研究（论文文献综述）
卢艳,陈家旭,宋鹏,李浩,艾琳,蔡玉春,储言红,陈韶红[1]（2021）在《曼氏裂头蚴cDNA文库的构建及诊断候选抗原筛选》文中研究表明目的构建曼氏裂头蚴cDNA文库,通过免疫筛选获得曼氏裂头蚴病诊断候选抗原基因。方法提取曼氏裂头蚴虫体总RNA,反转录合成cDNA,连接噬菌体载体,经体外包装后构建曼氏裂头蚴SMART cDNA文库。用曼氏裂头蚴病患者血清免疫筛选cDNA文库,获得阳性克隆,测定阳性克隆插入片段的DNA序列,进行同源性分析并预测编码蛋白的结构和功能。结果成功构建了曼氏裂头蚴cDNA文库,文库滴度为6.25 × 106 pfu/mL,重组率为100%,文库插入片段的平均长度大于1 100 bp。经免疫筛选获得12个阳性克隆,分为Sm-Ⅰ、Sm-Ⅱ、Sm-Ⅲ和Sm-Ⅳ4类,其代表克隆为Sm60-1、Sm58-1、Sm20-1、Sm22-3,插入片段长度分别为1134、1 063、883、969 bp,编码蛋白分别与欧猥迭宫绦虫抗原多肽、胞质抗原、核糖体蛋白S4样蛋白和未命名蛋白具有较高同源性。结论成功构建了曼氏裂头蚴SMART cDNA文库,获得了 4类阳性克隆,为曼氏裂头蚴病诊断抗原的进一步研究奠定了基础。
代国栋,闫鸿斌,李立,付宝权,贾万忠[2]（2021）在《人兽共患寄生虫病候选疫苗分子筛选方法研究进展》文中研究指明人兽共患寄生虫种类多、宿主广泛且危害严重。血吸虫病、棘球蚴病、囊尾蚴病、旋毛虫病、弓形虫病等是常见的重要人兽共患寄生虫病。人类和家畜饱受寄生虫病的危害,这对公共卫生和畜牧业造成了很大的影响。控制传染源、切断传播途径和保护易感群是控制人兽共患寄生虫病流行的综合防控措施。在综合防控策略中,疫苗的使用是切断循环链、控制乃至消灭人兽共患寄生虫病的理想和有效途径之一。选用高效的抗原筛选方法挖掘潜在的疫苗候选分子是开发疫苗的前提和关键。抗原筛选技术的更新换代使得研究者发掘出了更多新抗原和保护性多肽。现有的抗原筛选方法主要包括传统的粗抗原筛选法、cDNA文库筛选法、蛋白质组学筛选法、生物信息学及多组学技术联合筛选法。很多抗原筛选的方法是伴随寄生虫疫苗研究的发展应运而生的,粗抗原筛选法是基于抗原抗体相互反应的免疫学原理而设计的,此方法筛选的天然抗原可引起机体较强的免疫反应;cDNA文库筛选抗原的优势在于筛选更有针对性,所以候选产物的成分更单一、明确;蛋白质组学筛选法是基于质谱而兴起的一种筛选技术,它既可对未知蛋白组分进行鉴定,还可对鉴定结果进行差异比较,在未知分子的发现和功能特殊的靶分子筛选中发挥着重要作用;随着后基因时代的到来,生物信息学及多组学联合筛选技术使得抗原筛选逐步进入了多维、立体的筛选模式,也使得候选抗原及其表位的功能研究更加深入,这为基因工程疫苗和多肽疫苗候选分子的筛选提供了技术手段。
黄艳[3]（2021）在《Hc-nas-33参与捻转血矛线虫蜕皮过程的功能及其分子机制初步研究》文中进行了进一步梳理捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）是一种寄生于牛、羊、骆驼等反刍动物皱胃中的吸血性寄生虫,在我国呈广泛性流行,给中国的畜牧业造成重大经济损失。抗蠕虫药物对于捻转血矛线虫病有良好的治疗效果,但近年来耐药株频繁出现,增加了该病防治的难度。线虫生命调控关键基因作为新型药物靶点的筛选及抗蠕虫药物开发是目前捻转血矛线虫病防控的重要研究方向。蜕皮是线虫生长发育过程中必经的生命过程,当该过程发生障碍时,可影响虫体的正常发育,降低活动能力,甚至导致幼虫死亡,因此探明蜕皮作用机制及相关基因的生物学功能,对于该病的防控至关重要。本研究从已公布的捻转血矛线虫转录组数据库中筛选了 3种线虫虾红素样蛋白基因（Nematode astacin,NAS）,扩增获得了 Hc-nas-5、Hc-nas-31和Hc-nas-33基因全长,并对其结构域和分子进化关系进行了预测分析;在HEK 293T细胞、秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）和捻转血矛线虫中观察了 HcNASs的表达特性;利用转录特性分析和RNA干扰试验探究了Hc-nas-33在捻转血矛线虫生长发育过程中发挥的功能;构建了捻转血矛线虫酵母cDNA文库,并筛选得到Hc-NAS-33的候选互作蛋白鸟嘌呤核苷酸结合蛋白 β 亚基-1（Guanine nucleotide-binding protein subunit beta-1,GPB-1）,验证了两者的互作关系;并对Hc-GPB-1在蜕皮过程中的功能进行了研究。实验结果为深入研究捻转血矛线虫蜕皮机制奠定了基础,同时也为新药开发提供了潜在的药物靶点。1.捻转血矛线虫HcNASs基因特性分析通过扩增获得捻转血矛线虫3个虾红素样蛋白基因Hc-nas-5、Hc-nas-31和Hc-nas-33的全长DNA及mRNA序列,利用生物信息学软件预测分析基因结构、蛋白功能和分子进化关系;并构建原核表达载体获得重组蛋白,制备多克隆抗体。实验结果表明,3个HcNASs均有典型的锌金属蛋白酶结构域,此外Hc-NAS-31还具有1个CUB结构域和1个SXC结构域,Hc-NAS-33具有1个EGF结构域和1个CUB结构域;Hc-NAS-5和Hc-NAS-31具有C端信号肽。利用pET原核表达系统成功表达了 HcNASs重组蛋白,通过免疫实验动物获得了特异性较好的多克隆抗体。本研究扩增得到3种HcNASs基因对其进行了生物信息学分析,制备了多克隆抗体,可用于后续蛋白表达特性分析。2.HcNASs表达特性分析为了全面分析HcNASs的表达特性,本研究首先通过构建真核表达载体,转染HEK293T细胞,分析其在真核细胞中的定位情况;构建异源表达质粒,通过显微注射获得重组转基因虫株,探究在秀丽隐杆线虫中的表达情况;利用制备的多克隆抗体,通过幼虫间接免疫荧光（Indirect immunofluorescence,IFA）和L4及成虫免疫组织荧光（Immunohistofluorescence,IHF）分析在捻转血矛线虫中的表达特性。实验结果显示3种HcNASs均表达于HEK 293T细胞质中;在秀丽隐杆线虫中,Hc-NAS-5只表达于咽部和尾部极少数细胞中,Hc-NAS-31不能表达,Hc-NAS-33表达于咽部与肠道内;在捻转血矛线虫中,Hc-NAS-5和Hc-NAS-31定位于L3上皮合胞体,而在成虫中Hc-NAS-5和Hc-NAS-31表达模式缺乏特异性,广泛分布于多种虫体组织,Hc-NAS-33特异性表达于肠道与肌肉接触面、子宫膜和未成熟虫卵外周。本研究明确了 HcNASs的表达特性,为后续的功能研究指明了方向。3.Hc-nas-33在捻转血矛线虫蜕皮发育过程中的功能研究为了探究Hc-nas-33是否参与捻转血矛线虫蜕皮过程,本研究利用实时荧光定量 PCR（Quantitative real time PCR,qRT-PCR）分析了Hc-nas-3在不同时段内的转录特性,同时也进行了秀丽隐杆线虫同源基因的比较性研究,其次运用RNA干扰方法探究Hc-nas-33沉默后对捻转血矛线虫生长发育的影响。转录特性分析结果显示,Hc-nas-33转录水平在捻转血矛线虫L1-L2蜕皮过程中呈振荡变化,且在中后期达到峰值,Ce-nas-33基因在蜕皮过程中同样表现振荡转录特性;RNA干扰后,幼虫正常生长发育受到严重影响,虫体出现发育迟缓、活动力下降、畸形及蜕皮功能障碍等表型。上述结果证明Hc-nas-33为捻转血矛线虫蜕皮相关基因,为后续研究捻转血矛线虫蜕皮机制、开发新药物奠定了基础。4.捻转血矛线虫酵母cDNA文库构建及Hc-nas-33互作蛋白的筛选鉴定为了进一步探索Hc-nas-33参与蜕皮过程的分子机制,本研究构建了捻转血矛线虫酵母cDNA文库,并利用酵母双杂交系统筛选与Hc-NAS-33存在相互作用的候选蛋白;通过pull down、免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,CO-IP）与真核细胞共定位验证Hc-NAS-33与互作蛋白之间关系。酵母文库筛选发现了 6种可能与Hc-NAS-33存在相互作用的候选蛋白;利用昆虫细胞杆状病毒系统成功表达 GST-Hc-NAS-33 重组蛋白,通过 pull down 验证了 Hc-NAS-33 与 Hc-GPB-1存在相互作用,与免疫共沉淀结果相符,且Hc-NAS-33在HEK 293 T细胞中能与Hc-GPB-1共定位。本研究成功筛选得到Hc-NAS-33的互作蛋白,为后续研究其在捻转血矛线虫蜕皮过程中的功能奠定了基础,有助于更好的了解线虫蜕皮分子机制。5.Hc-NAS-33与Hc-GPB-1参与蜕皮过程的机制研究本研究借助秀丽隐杆线虫表达系统,分析Hc-NAS-33和Hc-GPB-1在线虫中的共定位情况,同时利用RNA干扰技术研究Hc-GPB-1在捻转血矛线虫生长发育过程中发挥的功能。结果表明,在秀丽隐杆线虫中异源表达的Hc-NAS-33和Hc-GPB-1存在部分共定位;Hc-gpb-1沉默后,幼虫同样出现发育迟缓、活动性下降及蜕皮功能障碍等表型,且降低Hc-gpb-1表达水平使得虫体新皮的厚度受到影响,表皮、皮下与肌肉之间的紧密连接出现缝隙,相关基因的qRT-PCR进一步验证了以上结果。本研究发现在蜕皮过程中Hc-NAS-33与Hc-GPB-1均参与了新皮的合成,这为进一步阐明捻转血矛线虫蜕皮机制提供了重要依据,同时也为捻转血矛线虫药物研发提供了新的候选药物靶标。综上所述,本研究扩增得到了 3种捻转血矛线虫HcNASs基因,并对其进行生物信息学分析,明确了其蛋白表达特性。通过转录特性分析和RNA干扰实验对Hc-nas-33进行深入研究,发现该基因参与捻转血矛线虫的蜕皮过程;利用酵母双杂交系统筛选获得6种Hc-NAS-33的候选互作蛋白,并验证了与Hc-GPB-1的互作关系;通过异源表达和RNA干扰对Hc-NAS-33及其互作蛋白Hc-GPB-1在捻转血矛线虫蜕皮过程的发挥的生物学功能进行了研究。上述结果为捻转血矛线虫蜕皮机制研究奠定了基础,同时为捻转血矛线虫病的防治提供了新的思路。
周岩,陈韶红,张永年,程娜,洪加林,许学年[4]（2020）在《卫氏并殖吸虫成虫λZAP Ⅱ cDNA文库的构建及诊断候选抗原的筛选》文中研究说明目的构建卫氏并殖吸虫成虫λZAPⅡcDNA文库,使用卫氏并殖吸虫病患者混合血清筛选诊断候选抗原。方法用卫氏并殖吸虫囊蚴感染实验犬,约70 d后取犬肺,收集卫氏并殖吸虫成虫,提取虫体总RNA,经mRNA纯化试剂盒纯化后构建卫氏并殖吸虫成虫的λZAPⅡcDNA文库。用卫氏并殖吸虫病患者混合血清筛选λZAPⅡcDNA文库,获得阳性克隆,对插入片段测序并进行同源性分析。结果构建的卫氏并殖吸虫成虫λZAPⅡcDNA文库的滴度为5.2×105 pfu/ml,重组率为98.0%,文库插入片段平均长度为1.1 kb。经免疫筛选获得PwⅠ、PwⅡ、PwⅢ和PwⅣ等4类阳性克隆。其代表克隆Pw1、Pw13、Pw18和Pw21的插入片段长度依次约为720、1 263、1 052、717 bp,均包含开放阅读框,顺序编码213、394、324和209个氨基酸,分别与卫氏并殖吸虫卵黄铁蛋白（yolk ferritin）基因、虫卵抗原（egg antigen）基因、前原组织蛋白酶L（pre-procathepsin L）基因和华支睾吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶（thioredoxin peroxidase）基因同源。结论成功构建了卫氏并殖吸虫成虫λZAPⅡcDNA文库,筛选获得4类被卫氏并殖吸虫病患者血清特异性识别的阳性克隆,为进一步寻找卫氏并殖吸虫免疫诊断抗原奠定了基础。
吴保义[5]（2020）在《新孢子虫NcAMA1蛋白与Vero细胞互作蛋白的筛选与初步鉴定》文中认为新孢子虫病（Neosporosis）呈世界性分布,目前全球犬类中感染率为17.14%,因新孢子虫病造成的流产对全球畜牧经济造成了巨大损失。该病对牛的危害最为严重,主要临床症状为流产,胎儿出生体重低于平均体重,运动障碍等。新孢子虫（Neospora caninum）为顶复门寄生虫,感染宿主非常广泛,包括牛,马,绵羊,山羊等多种家畜,其特有的棒状体细胞器分泌的棒状体颈部蛋白和NcAMA1蛋白形成的运动结合体（MJ）在虫体入侵过程中起到非常关键的作用,本次研究以新孢子虫NcAMA1蛋白作为研究对象,探究与NcAMA1蛋白发生相互作用的宿主细胞蛋白。为筛选出Vero细胞与NcAMA1蛋白相互作用的蛋白,本次试验根据GenBank中公布的NcAMA1基因,设计引物,从新孢子虫cDNA中扩增NcAMA1基因,构建了酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-NcAMA1,通过自转录活性检测,毒性检测验证诱饵载体的可行性,并验证了诱饵载体在酵母菌株中表达情况。通过酵母双杂交技术,对Vero细胞cDNA文库进行筛选。构建NcAMA1基因的原核表达载体和筛选到的宿主细胞蛋白Tmed2的原核表达载体,在体外进行原核表达,得到两种蛋白后经过pull-down进行再次验证NcAMA1蛋白和Tmed2蛋白在体外可发生相互作用。最终利用RNA干扰技术和抗体封闭试验,检测Tmed2对新孢子虫的入侵产生的影响。结果表明,本次试验成功从新孢子虫cDNA中扩增出NcAMA1基因,经过验证构建的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-NcAMA1无自转录活性,且对酵母菌株无细胞毒性,可以在酵母菌株中成功表达出NcAMA1蛋白。通过酵母双杂交技术成功从Vero细胞cDNA文库中筛选出与NcAMA 1蛋白相互作用的宿主蛋白细丝蛋白A（FLNA）和跨膜emp24域转运蛋白2（Tmed2）。成功构建了原核表达载体pGEX-4T1-Tmed2和pET28a-NcAMA1,在体外表达出Tmed2蛋白和NcAMA1蛋白,并通过pull-down技术验证了宿主细胞蛋白Tmed2和新孢子虫NcAMA1蛋白可以在体外发生相互作用。利用RNA干扰和抗体封闭试验,对Vero细胞进行处理后,检测虫体的入侵率均有所上升,表明本次实验筛选到的宿主细胞蛋白Tmed2在新孢子虫入侵过程中可能起到抑制作用,为探究新孢子虫的入侵过程提供了一定的科学依据。
李文宇[6]（2019）在《柔嫩艾美耳球虫侵入部位特异性关键分子及其受体研究》文中研究说明鸡球虫病是由艾美耳球虫寄生于鸡肠道上皮细胞内,引起鸡产生食欲不振、消瘦、血便等一系列临床症状的寄生虫病。其发病率高,是严重危害养禽业发展的重要疾病之一,给全球养禽业造成了巨大的经济损失。艾美耳球虫属主要寄生于鸡的肠道,不同种球虫具有明显的寄生部位特异性,但其机制机理尚不明确。有研究显示,柔嫩艾美耳球虫微线蛋白3（EtMIC3）可能是柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）侵入盲肠细胞过程中,决定其寄生部位特异性的关键分子。本研究进一步通过观察鸡球虫侵入相关分子微线蛋白（EtMIC3、EtMIC2和EtAMA1）与鸡不同肠段的结合情况,从而确定E.tenella侵入部位特异性关键分子。并在此基础上,构建鸡盲肠上皮细胞的cDNA文库,通过酵母双杂交方法确定E.tenella侵入部位特异性关键分子的受体分子,并通过GST-pulldown技术进行验证。对受体分子进行基因克隆及表达,制备抗血清,分析抗血清对球虫侵入宿主是否具有阻断作用,以及观察受体在鸡不同肠段的分布情况。本研究对于阐明鸡球虫侵入部位特异性的分子机制具有重要意义,也为鸡球虫病的防控提供新思路。1.E.tenella微线蛋白与鸡不同肠段结合能力的分析通过免疫组织化学方法观察微线蛋白EtMIC3、EtMIC2和EtAMA1与鸡不同肠段（前段、中段、后段和盲肠）的结合能力。结果发现EtMIC3与盲肠具有明显的结合作用,与其它肠段没有明显的结合作用。EtMIC2和EtAMA1与鸡肠段（前段、中段、后段和盲肠）没有明显的结合作用;用EtMIC3抗血清封闭E.tenella子孢子,计算子孢子的侵入抑制率。结果显示EtMIC3抗血清对子孢子侵入盲肠组织的抑制率为63.63%。而在对照组中,PBS和空白大鼠血清不能对E.tenella子孢子侵入盲肠组织引起明显的阻断作用,表明EtMIC3抗血清能够显着阻断E.tenella子孢子侵入盲肠组织的能力。结果显示EtMIC3分子可能是E.tenella侵入部位特异性的关键分子。2.鸡盲肠上皮细胞文库的构建提取并纯化鸡盲肠上皮细胞中总RNA,构建鸡盲肠上皮细胞cDNA文库。构建诱饵质粒pDHB1-EtMIC3,将其转入NMY51酵母菌株中,确定诱饵质粒pDHB1-EtMIC3能否在酵母中进行表达。结果表明获得了高纯度的鸡盲肠上皮细胞RNA,鸡盲肠上皮细胞cDNA初级文库滴度为3×106CFU/mL,扩增后文库滴度约为3×109CFU/mL。文库中插入的片段长度约为400 bp-2000 bp,平均长度大于1000 bp。综上所述,可以用于筛选EtMIC3的受体分子。3.EtMIC3鸡盲肠上皮细胞受体分子的鉴定通过酵母双杂交系统进行EtMIC3受体分子的筛选,经返回性验证发现有8个与EtMIC3结合的受体分子。通过对受体分子的基因克隆及蛋白表达,并经GST-pulldown验证,发现2个能够与EtMIC3分子结合的蛋白:BCL2 associated athanogene 1（BAG1）;Endonuclease,polyU-specific-like（ENDOUL）。对鸡盲肠上皮细胞中EtMIC3受体分子的研究有利于阐明E.tenella侵入部位特异性机制。4.受体分子在肠道分布情况及其抗血清对子孢子侵入的阻断作用观察通过免疫组织化学的方法观察受体分子BAG1、ENDOUL在鸡不同肠段（前段、中段、后段和盲肠）的分布情况。将BAG1、ENDOUL受体分子蛋白分别免疫鸡,制备受体分子特异性免疫抗体。将BAG1、ENDOUL抗血清通过静脉注射至鸡体内,通过攻虫试验分析受体分子抗血清对E.tenella侵入是否具有阻断作用。免疫组织化学试验结果显示,2种受体分子主要分布于鸡盲肠,不在其他肠段分布;攻虫试验结果显示,与对照组相比,BAG1、ENDOUL抗血清组能够显着减缓鸡球虫感染造成的体重下降,说明BAG1、ENDOUL抗血清对E.tenella的感染具有一定的阻断作用。
黄兵,韩红玉,董辉,赵其平,朱顺海[7]（2018）在《畜禽球虫生物学与球虫病防治研究——记上海兽医研究所四十年研究回顾》文中研究表明为全面了解中国农业科学院上海兽医研究所（原中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究所、中国农业科学院上海家畜血吸虫病研究所）在畜禽球虫生物学与球虫病防治研究方面取得的进展,本文从球虫的流行病学调查、虫种分离鉴定、诊断技术、药物防治、抗药性检测、免疫预防、体外培养、分子生物学等方面,介绍了上海兽医研究所近40年开展的主要工作和取得的研究结果,并提出了今后的重点研究方向。
贾传礼[8]（2017）在《毒害艾美耳球虫配子体cDNA文库的构建与筛选及其动力蛋白基因的表达》文中提出鸡球虫病是由一种或数种艾美耳球虫寄生于鸡消化道上皮细胞内而引起的一种原虫寄生虫病,严重危害养鸡业。毒害艾美耳球虫（Eimerianecatrix）是鸡球虫病的重要病原之一,主要危害8～18周龄的鸡,引起鸡的急性小肠球虫病。目前,球虫病的防治主要依赖化学药物或鸡球虫病活疫苗。随着抗球虫药物的广泛与大量使用,球虫耐药性以及人们对药物残留肉蛋、污染环境等诸多问题也随之出现。同时活球虫疫苗又存在生产成本高、容易扩散病原、致弱虫株毒力易返强、虫株的抗原变异、疫苗导致饲料报酬降低、疫苗接种的剂量难以控制等弊端。因此,鸡球虫保护性抗原基因的筛选与克隆表达及其免疫保护力的研究一直是鸡球虫病研究的热点。为此,本文以毒害艾美耳球虫配子体为材料,构建毒害艾美耳球虫配子体cDNA文库,并用免疫学方法从文库中筛选抗原基因,对ENH00080190基因进行了克隆表达和免疫原性分析,为研究毒害艾美耳球虫亚单位疫苗奠定基础。1毒害艾美耳球虫配子体的分离与纯化24日龄无球虫雏鸡,每鸡经嗉囊感染10 000个毒害艾美耳球虫孢子化卵囊。感染148 h后收取第二代裂殖子。经外科手术方法,将第二代裂殖子直接注入鸡盲肠内,使第二代裂殖子同步发育至配子体;手术后30 h剖检鸡,刮取盲肠黏膜,研磨后用0.5 mmol/L透明质酸酶消化,释放配子体;随后经过60目铜筛、260目锦纶筛兜和17 μm PET膜过滤,滤液经离心洗涤后用裂解液裂解红细胞;最后用30%和50%的Percoll,5 000 rpm离心15 min,分离纯化配子体。结果显示,本法获得的配子体纯度高、数量多,这为研究毒害艾美耳球虫配子体阶段的基因组学、蛋白质组学和免疫学等奠定了基础。2毒害艾美耳球虫配子体cDNA文库的构建用Trizol试剂提取毒害艾美耳球虫配子体总RNA,随后采用SMART技术构建了毒害艾美耳球虫配子体cDNA噬菌体表达文库。经鉴定,结果显示,总RNA的OD260/OD280值为1.95,样品的28S和18S条带清晰,原始文库容量为3.42×106 pfu/mL,重组率为90%,扩增后的文库容量为2.6× 1 010 pfu/mL,插入片段长度250～1000 bp。3毒害艾美耳球虫配子体cDNA文库的筛选首先,制备抗毒害艾美耳球虫的鸡康复血清和鼠抗毒害艾美耳球虫配子体多抗血清;两种血清经ELISA检测,显示两种多抗均有很高的效价;随后,用制备的鼠多抗对文库进行筛选,初次筛选共筛出疑似5个阳性克隆,复筛后确定阳性克隆3个;最后,对复筛后获得的阳性克隆进行PCR鉴定,对获得的EST序列进行生物信息学分析。结果显示,3个EST序列的长度分别为734 bp、270 bp和606 bp,分别编码毒害艾美耳球虫特有蛋白基因、毒害艾美耳球虫动力蛋白基因和毒害艾美耳球虫假定蛋白基因。4毒害艾美耳球虫动力蛋白基因表达及免疫原性分析首先,依据ENH00080190序列合成毒害艾美耳球虫动力蛋白基因,并将其插入到与载体pET-28a（+）连接,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞。其次,用IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析。最后,以毒害艾美耳球虫感染鸡康复血清为一抗进行Western-blot检测。结果显示,基因全长为270 bp,编码89个氨基酸;表达产物大小约为13 kDa,主要以包涵体形式存在;重组蛋白能被鸡康复血清识别,显示重组蛋白具有免疫原性。
赵娜[9]（2015）在《柔嫩艾美耳球虫端粒酶逆转录酶互作蛋白的筛选及功能研究》文中提出艾美耳球虫作为细胞内寄生虫，寄生于鸡肠道内引起是由以肠道病变为主要特征的鸡球虫病并严重危害养禽业的发展。目前控制球虫病还是主要依赖抗球虫药和疫苗的使用，但由于对球虫的细胞和分子生物学等缺乏详尽的了解，迄今尚无理想的控制鸡球虫病的药物和疫苗。端粒酶及相关蛋白的发现为深入研究球虫的细胞和分子生物学特性以及寻找新的防治鸡球虫的药物和疫苗作用靶位等开辟了新的研究领域。端粒酶作为一种核糖核蛋白，由端粒酶逆转录酶（TERT）、端粒酶RNA和端粒酶相关蛋白三个亚单位组成，其以自身携带的RNA为模板，反转录合成新的端粒DNA重复序列以维持染色体端粒的稳定性。而TERT是具有催化活性的亚单位。随着对端粒酶研究的深入，先后报道了多种端粒酶相关蛋白，并发现这些蛋白在端粒酶活性调节过程中起重要作用。应用酵母双杂交筛选到的hTERT互作蛋白p23，与Hsp90共同在端粒酶的高效组装和活化中发挥作用。PinX能与hTERT的RNA结合域（326620aa）结合，并也能结合端粒酶RNA，在酵母中hPinX同源物是一个酵母端粒酶功能负向调节因子。四膜虫p65和p45作为端粒酶的一部分在端粒维持方面发挥必要的作用。目前，柔嫩艾美耳球虫（E. tenella）的TERT序列已经成功克隆出来，而端粒-like序列已被预测出来。这些表明E. tenella利用传统的端粒酶机制合成其端粒DNA维持染色体末端的稳定。但尚无TERT相关蛋白的报道。故本研究通过酵母双杂交筛选、pull-down以及免疫共沉淀技术鉴定TERT互作蛋白14-3-3，进而利用病毒载体介导的锤头状核酶探讨14-3-3在端粒酶调节中的功能。E. tenella酵母双杂交cDNA文库的构建：收集纯化E. tenella孢子化卵囊，Trizol提取总RNA并反转录成cDNA，使用SMART技术建立E. tenella酵母双杂交cDNA文库。文库滴度为5×107cfu/mL，容量为2×1010cfu。随机挑选的48个克隆菌插入片段平均大小0.82kb，文库重组率高。E.tenella诱饵表达质粒pGBKT7-TRBD的构建及其互作蛋白的筛选：将PCR获得的E. tenella TERT RNA结合域（TRBD）片段与诱饵载体pGBKT7连接构建重组质粒pGBKT7-TRBD，并转化入酵母感受态细胞中。结果表明，诱饵蛋白能在酵母菌中表达且对宿主菌无毒性作用。-半乳糖苷酶试验表明诱饵蛋白无自激活作用。将pGBKT7-TRBD/Y187与酵母双杂交cDNA文库共培养筛选互作蛋白，初步筛选到了TRBD互作蛋白核仁素、14-3-3和尿苷磷酸化酶。-半乳糖苷酶试验表明14-3-3与TRBD间存在相互作用。TRBD与14-3-3蛋白相互作用的鉴定：将TRBD和14-3-3基因分别克隆至原核表达载体pET-32a和pGEX-4T-1，并在大肠杆菌中进行原核表达和纯化。SDS-PAGE显示二者均能以可溶性蛋白的形式表达。将纯化的His-TRBD/GST-14-3-3共孵育，通过pull-down试验验证两种蛋白的相互作用。结果表明，E. tenella TRBD蛋白与14-3-3蛋白在体外具有相互作用。构建真核表达质粒pcDNA-3.1-Myc-TRBD和pcDNA-3.1-HA-14-3-3，共转染293T细胞，Western blot显示Myc-TRBD和HA-14-3-3均能在293T细胞中表达。免疫共沉淀结果表明Myc-TRBD蛋白与HA-14-3-3蛋白在真核细胞内具有相互作用。14-3-3蛋白的功能研究：设计合成针对14-3-3基因的的锤头状核酶并连接到E. tenella病毒载体上获得pEtV-RFP-Ham-14-3-3，进行体内和体外对14-3-3基因切割研究。体外试验表明pEtV-RFP-Ham-14-3-3体外转录体对14-3-3体外转录体切割效率达到85.24%。通过电转染方法，将pEtV-RFP-Ham-14-3-3体外转录体导入E. tenella体内，Western blot检测显示在球虫体内核酶对14-3-3基因具有一定的切割效率，14-3-3表达水平相对于RFP-GFP株下调11.24%。当14-3-3基因表达被抑制后，E. tenella端粒酶活性升高，初步表明14-3-3可能对于端粒酶活性具有负向调节的作用。综上所述，本研究完成了E. tenella酵母双杂交cDNA文库的构建并筛选到了TERT相互作用蛋白14-3-3，pull-down和免疫共沉淀结果进一步证明了两种蛋白的相互作用。利用E. tenella病毒载体介导的核酶干扰了14-3-3在球虫体内的表达，从而初步表明14-3-3可能对于端粒酶活性具有负向调节的作用。本研究为深入探讨14-3-3调节端粒酶活性的机制以及寻找新的防治球虫病的药物和疫苗分子靶位奠定了重要基础。
孙嘉慧[10]（2013）在《田鼠巴贝虫感染诊断抗原的筛选及相关基因的克隆表达》文中研究表明自从19世纪末Victor Babes在罗马尼亚的牛的红细胞中发现寄生包涵体以来,全世界新巴贝虫虫株陆续得到鉴定,该病原体引起的巴贝虫病给牲畜和人类健康造成很大影响。巴贝虫病是一种重要的人兽共患寄生原虫病,其病原体通过硬蜱传播,宿主感染后引起红细胞溶解,导致高血红素尿和血红蛋白尿,并可能导致器官衰竭。已发现感染人类的巴贝虫有7种,其中田鼠巴贝虫和分歧巴贝虫的危害最为深广。目前,人感染巴贝虫的诊断主要是基于形态学鉴定,同时结合临床表现、流行病史进行的综合诊断,而相关血清学、分子生物学检测方法的研究较少,国内研究更为少见。由于形态学鉴定的敏感性不高且巴贝虫与疟原虫的形态学上易于混淆,常常造成临床上的误诊与漏诊,耽误治疗。因此,急需要发展快速有效的巴贝虫病诊断试剂,而诊断抗原的发掘是发展免疫诊断试剂的关键,重组抗原是诊断抗原的重要来源之一。目的本研究旨在通过克隆已报道抗原、免疫筛选cDNA文库及免疫蛋白组方法获得特异性、敏感性较高的田鼠巴贝虫感染的免疫诊断抗原。方法本文以田鼠巴贝虫标准株（Babesia microti ATCC（?）PRA-99TM）为材料,主要进行了以下研究：1)根据已报道的巴贝虫候选抗原信息,合成目的基因和扩增引物,构建重组质粒,进行表达纯化。2)构建田鼠巴贝虫的cDNA文库,用田鼠巴贝虫感染小鼠混合血清筛选cDNA文库,获得阳性克隆。3)用ELISA方法评价重组蛋白用于检测小鼠血清的诊断效果,并检测了田鼠巴贝虫的重组蛋白对疟疾病人血清的交叉反应。4)提取田鼠巴贝虫粗抗原,进行双向电泳,分别用感染田鼠巴贝虫7天及30天的小鼠血清免疫杂交,在银染胶上确定与硝酸纤维素膜所对应的阳性点,进行质谱鉴定。结果1)合成了文献报道的8种巴贝虫的9个基因序列,并构建了重组质粒,分别是：田鼠巴贝虫的BmSA1,吉氏巴贝虫的血小板反应相关无名蛋白,分歧巴贝虫、牛巴贝虫、双芽巴贝虫以及绵羊巴贝虫的棒状体相关蛋白1,马泰勒虫的裂殖子抗原1和东方巴贝虫的BoP29;成功表达并纯化了其中的BmSA1等6个重组蛋白。2)所构建的田鼠巴贝虫cDNA文库的滴度为5.2×105pfu/ml,重组率为91.0%,文库插入片段平均长度为1.1kb。从cDNA文库中筛选得到6个阳性克隆Bm2、Bm4、Bm6、Bm7、Bm9和Bm15,其插入片段依次约为633、614、1073、890、1001和1032bp,均包含开放阅读框,分别编码159、100、254、217、60和244个氨基酸,相对分子质量（Mr）依次约为17900、11400、28600、24000、6800和28900。成功克隆表达了其中4个（Bm4、Bm6、Bm7、Bm15）。3)用ELISA方法对已获得的重组抗原的诊断价值进行初步评价的结果表明,Bm4、Bm6、Bm7、Bm15和BmSA1检测感染小鼠血清的敏感性分别是15%、55%、100%、80%和100%,特异性分别为100%、100%、100%、90%和100%。巴贝虫种内其他虫株的5个重组蛋白与田鼠巴贝虫感染小鼠血清呈现交叉反应,反应率为40%—90%。Bm4、Bm6、Bm7、Bm15和BmSA1检测疟疾病人血清的特异性为87.7%—100%.4)免疫蛋白组研究中,用感染田鼠巴贝虫7天及30天小鼠血清分别杂交筛选出8个和51个田鼠巴贝虫的蛋白点,经质谱分析,分别鉴定8个和79个蛋白,尚有待于深入发掘。结论本研究通过三种方法得到了多个巴贝虫潜在抗原靶标,其中田鼠巴贝虫的两个重组抗原Bm7和Bmm15检测小鼠血清具有较高的敏感性和特异性,但其应用于人田鼠巴贝虫感染的诊断还需进一步验证。
二、寄生虫cDNA文库的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、寄生虫cDNA文库的研究（论文提纲范文）
（1）曼氏裂头蚴cDNA文库的构建及诊断候选抗原筛选（论文提纲范文）
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 曼氏裂头蚴 |
| 1.2 血清 |
| 1.3 曼氏裂头蚴可溶性抗原 |
| 1.4 主要试剂与菌株 |
| 2 方法 |
| 2.1 曼氏裂头蚴总RNA提取 |
| 2.2 c DNA文库的构建和鉴定 |
| 2.3 筛库血清的预处理 |
| 2.4 文库的免疫筛选 |
| 2.5 阳性克隆插入片段的鉴定 |
| 2.6 插入片段序列分析 |
| 结果 |
| 1曼氏裂头蚴总RNA质量 |
| 2曼氏裂头蚴cDNA文库构建及鉴定 |
| 3 c DNA文库免疫筛选与阳性克隆鉴定 |
| 4 阳性克隆编码蛋白结构域功能预测 |
| 讨论 |
（2）人兽共患寄生虫病候选疫苗分子筛选方法研究进展（论文提纲范文）
| 1 基于粗抗原或部分纯化抗原的筛选方法 |
| 1.1 基于粗抗原的筛选方法 |
| 1.2 基于蛋白同源性的抗原筛选方法 |
| 2 基于cDNA文库的筛选方法 |
| 3 基于质谱的蛋白质组学筛选方法 |
| 4 基于生物信息学的筛选方法 |
| 5 基于多组学技术联合的筛选方法 |
| 6 小结与展望 |
（3）Hc-nas-33参与捻转血矛线虫蜕皮过程的功能及其分子机制初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 捻转血矛线虫病简介 |
| 1 捻转血矛线虫形态与生活史 |
| 2 临床症状 |
| 3 诊断 |
| 4 药物治疗与耐药性 |
| 5 疫苗 |
| 第二章 线虫蜕皮研究进展 |
| 1 蜕皮的生物学意义 |
| 2 线虫表皮层结构特征 |
| 3 表皮、上皮及肌肉之间的连接 |
| 4 线虫蜕皮过程 |
| 5 线虫蜕皮机制研究进展 |
| 第三章 线虫虾红素样蛋白 |
| 1 虾红素蛋白 |
| 2 线虫虾红素样蛋白 |
| 3 寄生性线虫虾红素样蛋白研究进展 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第四章 捻转血矛线虫HcNASs基因特性分析、原核表达及多克隆抗体制备 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 捻转血矛线虫HcNASs基因的获得与结构分析 |
| 2.2 捻转血矛线虫HcNASs蛋白功能预测及进化关系分析 |
| 2.3 HcNASs基因全长CDS扩增 |
| 2.4 原核蛋白诱导表达及纯化 |
| 2.5 多克隆抗体特异性检测 |
| 3 讨论 |
| 第五章 HcNASs表达特性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 HcNASs在HEK 293T细胞中的表达特性 |
| 2.2 启动子活性分析 |
| 2.3 HcNASs在秀丽隐杆线虫中的表达模式 |
| 2.4 过表达HcNASs对秀丽隐杆线虫的影响 |
| 2.5 L3幼虫间接免疫荧光定位 |
| 2.6 L4及成虫IHF分析 |
| 3 讨论 |
| 第六章 Hc-nas-33在捻转血矛线虫蜕皮发育过程中的功能研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 Hc-nas-33基因各时期转录情况qRT-PCR检测 |
| 2.2 Hc-nas-33基因在捻转血矛线虫蜕皮过程中的转录水平检测 |
| 2.3 秀丽隐杆线虫同源基因在蜕皮过程中发挥功能的比较研究 |
| 2.4 RNA干扰实验 |
| 3 讨论 |
| 第七章 捻转血矛线虫酵母cDNA文库构建及Hc-nas-33互作蛋白的筛选鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 捻转血矛线虫cDNA文库的建立 |
| 2.2 诱饵质粒构建 |
| 2.3 诱饵质粒毒性与自激活检测 |
| 2.4 Hc-GBP-1与Hc-NAS-33相互作用验证 |
| 3 讨论 |
| 第八章 Hc-NAS-33与Hc-GPB-1参与蜕皮过程的机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 pCe-gpb-1启动子活性分析 |
| 2.2 Hc-NAS-33与Hc-GPB-1在秀丽隐杆线虫中的共定位分析 |
| 2.3 Hc-nas-33与Hc-gpb-1干扰后对捻转血矛线虫的影响 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 创新点 |
| 研究展望 |
| 附录Ⅰ 常用溶液配制 |
| 附录Ⅱ 实验涉及引物序列 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的主要成果 |
| 致谢 |
（4）卫氏并殖吸虫成虫λZAP Ⅱ cDNA文库的构建及诊断候选抗原的筛选（论文提纲范文）
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 血清 |
| 1.2 卫氏并殖吸虫成虫 |
| 1.3 卫氏并殖吸虫排泄分泌抗原 |
| 1.4 主要试剂与菌株 |
| 2 方法 |
| 2.1 筛库血清的预处理 |
| 2.2 成虫总RNA的提取和mRNA的纯化 |
| 2.3 cDNA文库的构建和鉴定 |
| 2.4 cDNA文库的免疫筛选 |
| 2.5 阳性克隆的删除环化 |
| 2.6 序列分析 |
| 结 果 |
| 1 总RNA质量的鉴定 |
| 2 卫氏并殖吸虫成虫cDNA文库的鉴定 |
| 3 卫氏并殖吸虫成虫cDNA文库的免疫筛选 |
| 4 阳性克隆测序分析 |
| 讨 论 |
（5）新孢子虫NcAMA1蛋白与Vero细胞互作蛋白的筛选与初步鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1. 新孢子虫病研究进展 |
| 1.1 生活史 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.3 临床症状 |
| 1.4 入侵机制 |
| 1.5 疫苗的进展 |
| 1.6 诊断及预防 |
| 2. 酵母双杂交技术 |
| 2.1 酵母双杂交技术原理 |
| 2.2 酵母双杂交技术的应用 |
| 3. 研究目的与意义 |
| 材料与方法 |
| 1. 材料 |
| 1.1 菌种及载体 |
| 1.2 主要试剂及培养基 |
| 1.3 主要试剂的配置 |
| 2. 方法 |
| 2.1 虫株的培养及纯化 |
| 2.1.1 细胞的复苏与培养 |
| 2.1.2 新孢子虫的复苏与纯化 |
| 2.2 酵母双杂交诱饵载体的构建 |
| 2.2.1 新孢子虫cDNA的提取 |
| 2.2.2 NcAMA1片段的获取 |
| 2.2.3 pGBKT7-NcAMA1诱饵载体构建 |
| 2.3 酵母双杂交诱饵载体的鉴定 |
| 2.3.1 酵母感受态细胞的制备 |
| 2.3.2 诱饵载体转化酵母感受态细胞 |
| 2.3.3 诱饵载体自转录活性检测 |
| 2.3.4 诱饵载体毒性检测 |
| 2.3.5 验证诱饵载体的表达 |
| 2.4 用诱饵载体筛选宿主蛋白 |
| 2.4.1 诱饵载体靶菌株与Vero细胞cDNA文库杂交 |
| 2.4.2 杂交效率及筛选到的克隆数计算 |
| 2.4.3 宿主蛋白的筛选 |
| 2.4.4 获取筛选到的插入片段 |
| 2.4.5 回复杂交 |
| 2.5 Tmed2蛋白的获取 |
| 2.5.1 引物合成 |
| 2.5.2 Tmed2片段的获取 |
| 2.5.3 pGEX-4T-1-Tmed2载体构建 |
| 2.5.4 Tmed2原核表达 |
| 2.6 NcAMA1蛋白的获取 |
| 2.6.1 NcAMA1片段的获取 |
| 2.6.2 pET28a-NcAMA1载体构建 |
| 2.6.3 NcAMA1原核表达 |
| 2.7 pull down实验验证 |
| 2.8 Tmed2 siRNA鉴定 |
| 2.8.1 细胞培养 |
| 2.8.2 细胞转染 |
| 2.8.3 荧光定量PCR鉴定沉默效果 |
| 2.8.4 蛋白印迹鉴定沉默效果 |
| 2.9 针对Tmed2对Vero细胞进行处理 |
| 2.9.1 MTT法检测抗TMED2抗体对细胞影响 |
| 2.9.2 入侵实验 |
| 结果 |
| 3.1 酵母双杂交诱饵载体的构建 |
| 3.2 诱饵载体自转录活性检测和毒性检测 |
| 3.3 诱饵载体的表达检测 |
| 3.4 杂交效率计算及杂交克隆数计算 |
| 3.5 诱饵载体对Vreo细胞cDNA文库的筛选 |
| 3.6 回复杂交 |
| 3.7 Tmed2原核表达载体构建及表达 |
| 3.8 NcAMA1原核表达载体构建及表达 |
| 3.9 pull down验证 |
| 3.10 Tmed2 siRNA沉默效率鉴定 |
| 3.11 MTT实验检测抗Tmed2抗体对细胞毒性 |
| 3.12 入侵实验 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录A (作者简介) |
| 附录B (在研期间发表的论文) |
（6）柔嫩艾美耳球虫侵入部位特异性关键分子及其受体研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语 |
| 绪论 |
| 参考文献 |
| 第一章 鸡球虫病及鸡球虫侵入机制研究 |
| 1 鸡球虫病 |
| 1.1 病原 |
| 1.2 防治 |
| 1.3 鸡球虫的侵入部位特异性及其侵入机制 |
| 2 微线蛋白(MICs)及其在顶复门原虫侵入过程中的作用 |
| 2.1 微线蛋白(MICs)概述 |
| 2.2 微线蛋白(MICs)分子结构域及其功能 |
| 2.3 微线蛋白(MICs)在鸡球虫及其他顶复门原虫侵入过程中的作用 |
| 参考文献 |
| 第二章 蛋白质相互作用的研究技术 |
| 1 检测未知相互作用蛋白方法 |
| 2 检测已知相互作用蛋白方法 |
| 3 蛋白质相互作用技术的应用 |
| 参考文献 |
| 第三章 E.tenella微线蛋白与鸡不同肠段结合能力的观察 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 EtMIC3、EtMIC2和EtAMA1的扩增及序列分析 |
| 2.2 EtMIC3、EtMIC2和EtAMA1表达载体的构建 |
| 2.3 重组蛋白EtMIC3、EtMIC2和EtAMA1的表达 |
| 2.4 微线蛋白EtMIC3、EtMIC2、EtAMA1与不同肠段的结合能力分析 |
| 2.5 EtMIC3抗血清对E.tenella子孢子侵入阻断作用的观察 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 鸡盲肠上皮细胞酵母双杂交系统的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 鸡盲肠细胞RNA检测 |
| 2.2 cDNA的合成与均一化 |
| 2.3 鸡盲肠上皮细胞cDNA文库质量的评价 |
| 2.4 重组诱饵质粒pDHB1-EtMIC3的构建与鉴定 |
| 2.5 诱饵质粒pDHB1-EtMIC3在NMY51酵母菌中的表达情况 |
| 2.6 酵母双杂交功能性检测 |
| 2.7 筛选3-AT的最适浓度 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 EtMIC3盲肠受体分子的筛选及其验证 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 酵母双杂交初次筛选 |
| 2.2 返回性验证 |
| 2.3 返回验证阳性捕获质粒中插入基因的鉴定 |
| 2.4 生物信息学分析 |
| 2.5 受体分子的扩增及序列分析 |
| 2.6 重组表达质粒的鉴定 |
| 2.7 受体蛋白的表达、纯化及复性 |
| 2.8 pGEX-6p-1-EtMIC3载体的构建与表达 |
| 2.9 受体分子的GST-pulldown验证 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 EtMIC3受体分子在鸡不同肠段的分布及其抗血清对E.tenella侵入阻断作用分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 受体蛋白在不同肠段的分布 |
| 2.2 受体分子抗血清对E.tenella侵入阻断作用分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表论文情况 |
（7）畜禽球虫生物学与球虫病防治研究——记上海兽医研究所四十年研究回顾（论文提纲范文）
| 0前言 |
| 1 流行病学 |
| 2 虫种分离 |
| 3 诊断技术 |
| 4 药物防治 |
| 5 抗药性检测 |
| 6 免疫预防 |
| 7 体外培养 |
| 8 分子生物学 |
| 1 0 展望 |
（8）毒害艾美耳球虫配子体cDNA文库的构建与筛选及其动力蛋白基因的表达（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述: 鸡球虫病的研究进展 |
| 1 鸡球虫病原 |
| 2 鸡球虫的生活史 |
| 3 鸡球虫的体外培养 |
| 4 鸡球虫免疫机理 |
| 5 鸡球虫cDNA文库的研究 |
| 6 鸡球虫疫苗的研究 |
| 7 结语 |
| 参考文献 |
| 第一章 毒害艾美耳球虫配子体的分离与纯化 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 毒害艾美耳球配子体cDNA文库的构建 |
| 1 材料与试剂 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 毒害艾美耳球虫配子体cDNA文库的筛选 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 毒害艾美耳球虫动力蛋白基因表达与免疫原性分析 |
| 1 材枓 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（9）柔嫩艾美耳球虫端粒酶逆转录酶互作蛋白的筛选及功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 鸡球虫分子生物学研究进展 |
| 1 基因组学 |
| 2 转录组学 |
| 3 蛋白组学 |
| 4 宿主细胞入侵 |
| 5 鸡球虫分子生物学诊断方法 |
| 6 球虫防控新方法 |
| 第2章 端粒酶及相关蛋白研究进展 |
| 1 端粒酶 |
| 2 端粒酶相关蛋白 |
| 第3章 原虫基因功能研究方法 |
| 1 转染 |
| 2 RNAi |
| 3 基因敲除 |
| 4 核酶 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 E. tenella 酵母双杂交 cDNA 文库的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第2章 E.tenella TERT 诱饵表达质粒的构建及其互作蛋白的筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第3章 TERT 与 14-3-3 蛋白相互作用的鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第4章 14-3-3 蛋白的功能研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 学术论文及发表情况 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（10）田鼠巴贝虫感染诊断抗原的筛选及相关基因的克隆表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 技术路线 |
| 第一部分 文献已报道巴贝虫蛋白的克隆表达 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 田鼠巴贝虫cDNA文库的构建和免疫筛选 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 重组蛋白诊断价值的初步评价 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第四部分 免疫蛋白组方法筛选田鼠巴贝虫病的诊断抗原 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 论着 |
| 参考文献 |
四、寄生虫cDNA文库的研究（论文参考文献）
- [1]曼氏裂头蚴cDNA文库的构建及诊断候选抗原筛选[J]. 卢艳,陈家旭,宋鹏,李浩,艾琳,蔡玉春,储言红,陈韶红. 中国血吸虫病防治杂志, 2021(04)
- [2]人兽共患寄生虫病候选疫苗分子筛选方法研究进展[J]. 代国栋,闫鸿斌,李立,付宝权,贾万忠. 中国畜牧兽医, 2021(06)
- [3]Hc-nas-33参与捻转血矛线虫蜕皮过程的功能及其分子机制初步研究[D]. 黄艳. 浙江大学, 2021
- [4]卫氏并殖吸虫成虫λZAP Ⅱ cDNA文库的构建及诊断候选抗原的筛选[J]. 周岩,陈韶红,张永年,程娜,洪加林,许学年. 中国病原生物学杂志, 2020(10)
- [5]新孢子虫NcAMA1蛋白与Vero细胞互作蛋白的筛选与初步鉴定[D]. 吴保义. 延边大学, 2020(05)
- [6]柔嫩艾美耳球虫侵入部位特异性关键分子及其受体研究[D]. 李文宇. 南京农业大学, 2019
- [7]畜禽球虫生物学与球虫病防治研究——记上海兽医研究所四十年研究回顾[J]. 黄兵,韩红玉,董辉,赵其平,朱顺海. 中国动物传染病学报, 2018(06)
- [8]毒害艾美耳球虫配子体cDNA文库的构建与筛选及其动力蛋白基因的表达[D]. 贾传礼. 扬州大学, 2017(01)
- [9]柔嫩艾美耳球虫端粒酶逆转录酶互作蛋白的筛选及功能研究[D]. 赵娜. 吉林大学, 2015(08)
- [10]田鼠巴贝虫感染诊断抗原的筛选及相关基因的克隆表达[D]. 孙嘉慧. 中国疾病预防控制中心, 2013(03)