一、恶性肿瘤与端粒 端粒酶相关关系的研究进展（论文文献综述）
刘宇,胡贵平,贾光[1]（2021）在《端粒长度与端粒酶：环境致癌物接触的早期生物标志物》文中进行了进一步梳理端粒是位于真核细胞线状染色体末端的一段DNA蛋白质复合体,具有稳定染色体的功能。端粒长度的变化与环境致癌物的接触密切相关;端粒修复延长依靠端粒酶的催化和介导。典型环境致癌物多环芳烃（PAHs）接触可通过调控端粒相关基因的表达,从而影响端粒长度的变化;长期接触PAHs可导致周围血白细胞端粒缩短,且呈一定程度的剂量-效应关系。端粒功能异常是砷中毒的重要机制之一,端粒长度的变化可作为砷的接触性生物标志物;但砷接触对端粒长度影响的研究结果尚存在较大差异,因此砷接触对端粒长度影响的一致性及可能的机制尚需进一步研究。大气细颗粒物接触可通过诱发机体的氧化应激和炎症反应,攻击遗传物质,进而影响体内细胞的端粒长度;急性颗粒物接触可在短期内（数小时至数天）增加端粒长度,其后端粒的缩短可能与炎症机制有关。端粒长度和端粒酶活性可作为生物标志物,在环境致癌物所致肿瘤的早期监测、诊断和预后评估中发挥重要作用。
唐铃丰[2]（2021）在《人端粒酶逆转录酶hTERT鉴别乳腺良恶性肿瘤的Meta分析》文中研究表明目的系统评估人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase,hTERT）基因检测鉴别诊断乳腺良恶性肿瘤的临床价值。方法检索CNKI、CBM、维普、Wan Fang Data、Pub Med、The Cochrane Library（2020年10期）、Web of Science、EMbase数据库中与hTERT基因检测鉴别乳腺良恶性肿瘤相关的文章,检索时间均由建库时间至2020年10月9日。提取纳入文献基本资料并通过QUADAS标准评价研究质量。使用Stata 15.0和Meta-Disc 1.4软件对数据进行统计分析。首先通过ROC曲线和Spearman相关系数来检验有无阈值效应,若有阈值效应,则拟合ROC曲线并计算AUC及Q*指数;若无阈值效应,则采用卡方检验分析异质性,并结合I2定量判断异质性的大小。然后使用meta回归分析探寻异质性来源,进行亚组分析。最后通过漏斗图分析发表偏倚。结果本研究一共纳入了17篇文献,共1436例患者（乳腺恶性肿瘤852例,乳腺良性肿瘤584例）。结果显示,hTERT诊断乳腺恶性肿瘤的合并敏感度(Sen合并)为0.81[95%CI（0.79,0.84）],合并特异度(Spe合并)为0.83[95%CI（0.79,0.86）],合并阳性似然比(+LR合并)为4.75[95%CI（3.35,6.74）],合并阴性似然比(-LR合并)为0.21[95%CI（0.15,0.30）]以及合并诊断优势比(DOR合并)为26.93[95%CI（15.02,48.28）]。所有结局指标I2均大于50%,因此采用随机效应模型进行Meta分析。对全部因素进行meta回归分析,结果显示异质性主要来源为作者国家,剔除两篇国外文献后行亚组分析,采用固定效应模型计算合并DOR为35.89,AUC=0.9242,Q*=0.8582。结论hTERT基因检测鉴别诊断乳腺良恶性肿瘤有较好的灵敏度及特异度,诊断试验的判别效果较好,其有助于临床上乳腺良恶性肿瘤的鉴别。
方楚玲[3]（2021）在《免疫调节和雄激素在IPF中的作用及吡非尼酮的临床安全性评估》文中研究指明第一部分遗传因素在特发性肺纤维化发病机制中的作用背景与目的:遗传因素在特发性肺纤维化发病中起重要作用,MUC5B基因位点rs35705950的非风险等位基因与免疫异常及IPF的进展有关。然而,在中国IPF人群中,基因组外显子区域的罕见变异尚未被系统分析。本研究旨在提高对中国IPF人群遗传变异位点及其功能的理解,并评估rs35705950非风险等位基因是否与免疫通路相关基因罕见变异富集相关。方法:纳入110例IPF患者和60例健康对照者进行病例对照研究。通过Sanger测序对rs35705950进行基因分型,采用基于基因水平的关联分析确定在IPF人群中富集的变异基因,利用GO和KEGG对已确定的变异基因进行通路分析,同时探索rs35705950与免疫通路相关的变异基因的关联。结果:在IPF患者中发现了 226个富集有害变异位点的基因,其中有36个基因在GO和KEGG通路中显着富集,通路分析提示这些基因主要参与免疫应答和细胞粘附过程。免疫通路相关基因的变异情况与患者是否携带有MUC5B非风险等位基因无显着关联。结论:本研究基于全外显子测序初步确定了中国IPF人群的罕见突变和变异基因,这些变异基因主要与免疫应答和细胞粘附相关。这些结果在一定程度上解释了之前国际上报道的IPF患者免疫/炎症途径相关基因表达水平的改变。第二部分B7H3在特发性肺纤维化中的表达水平和潜在作用背景与目的:B7H3及其裂解产物sB7H3在IPF进展中的临床意义和作用尚不清楚。本研究旨在探讨IPF患者血浆sB7H3和外周循环B7H3+细胞水平,及其与肺功能或免疫细胞的相关性以及B7H3在IPF发病中的作用。方法:采用ELISA和流式细胞术分别检测IPF患者血浆中sB7H3和B7H3+细胞水平。分析sB7H3对健康小鼠或博莱霉素干预小鼠的作用。结果:IPF患者血浆中sB7H3和外周血循环B7H3+细胞水平较健康对照者升高,两者水平均与肺功能呈负相关,尤其是在尼达尼布治疗后这种相关关系更强。IPF患者外周血B7H3+细胞水平与sB7H3和Treg水平呈正相关。在小鼠体内,sB7H3注射后诱导肺内MDSCs的聚集和肺组织中Ccl2的表达,伴随着肺部整体炎症的增强。此外,sB7H3可促进小鼠骨髓中MDSCs的增殖,并伴有炎性细胞因子的表达升高。体外实验显示sB7H3对MDSCs的趋化作用依赖于TLT-2。结论:sB7H3水平与IPF患者肺功能恶化相关,其可能通过与受体TLT-2结合,增强肺部炎症反应,同时促进MDSCs在骨髓中的增殖并向肺内募集。第三部分性激素在特发性肺纤维化发病机制中的潜在作用背景与目的:IPF受累对象主要为老年男性。肺泡上皮细胞端粒缩短被认为与IPF发病密切相关,但研究发现只有少数患者存在导致端粒缩短的端粒酶相关基因突变。体外试验证明性激素对端粒酶活性有调节作用且性激素水平与白细胞端粒长度（LTL）相关。本研究旨在男性IPF中,探讨性激素与LTL的相关性,以及性激素是否通过与端粒酶相关基因变异的交互作用来影响LTL,最后探索雄激素代谢通路相关基因外显子多态性是否与血浆睾酮浓度相关。方法:对101名男性IPF患者和51名年龄匹配的健康对照进行病例对照研究。对研究对象清晨血浆性激素进行定量检测,采用全外显子组测序技术分析端粒酶相关基因罕见突变及雄激素代谢相关基因外显子单核苷酸多态性（SNPs）,应用PCR方法检测LTL并以T/S 比率表示。结果:IPF患者组LTL、睾酮、双氢睾酮水平显着降低。校正年龄和端粒酶相关基因突变状态后,只有睾酮水平与LTL呈正相关（P=0.001）。同时,端粒酶相关基因罕见变异与睾酮水平之间没有显着的交互作用（P=0.661）。雄激素代谢通路相关基因外显子SNP与睾酮浓度无显着关联。结论:血浆睾酮水平与LTL呈正相关,且不受年龄或端粒酶相关基因罕见变异的影响。雄激素代谢通路相关基因外显子区域的遗传变异与雄激素水平无关联。尚需进一步的研究来检验性激素干预是否可以延缓男性IPF患者的端粒缩短。第四部分真实世界研究:探索吡非尼酮在临床实际应用中的有效性和耐受性背景与目的:吡非尼酮对于除IPF外的其他类型肺纤维化患者的安全性尚不清楚。此外,目前尚无研究系统分析IPF患者中与吡非尼酮疗效相关的因素。本研究旨在评估吡非尼酮在IPF患者中的疗效及其在其他类型肺纤维化患者中的耐受性。方法:本研究纳入使用吡非尼酮的肺纤维化患者进行回顾性研究。采用高分辨CT对110例接受吡非尼酮治疗≥3个月的IPF患者进行吡非尼酮的疗效评估,并分析疗效相关因素和无进展生存相关因素;此外,还收集所有服药者的药物不良反应和药物剂量调整信息。结果:共纳入176例患者:117例为IPF,19例为结缔组织病相关间质性肺病,40例为无法分类的ILD。对110例IPF患者疗效分析发现:89例被评估为病情稳定,21例为疾病进展（其中有10例死于急性加重,11例为病情进展）。吡非尼酮在IPF患者中的疗效与患者的基线BMI显着相关。BMI>25kg/m2或一氧化碳扩散量（DLCO）>30%的IPF患者累积无进展生存率更高。吡非尼酮最常见的不良反应为皮肤和胃肠相关的症状,三组不同疾病的患者因不良事件而停药的比例相似。结论:其他类型的肺纤维化患者对吡非尼酮的耐受性良好,不良反应事件与其在IPF患者中相似。经吡非尼酮治疗后,近80%的IPF患者病情稳定,生存分析表明吡非尼酮对于BMI较高或病情为轻中度的IPF患者有更多获益。
刘德豪[4]（2021）在《外周血白细胞端粒长度与端粒酶活性对非小细胞肺癌患者预后的影响》文中研究表明目的:探讨非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）患者外周血白细胞端粒长度以及端粒酶活性对患者预后的影响。方法:本研究病例选取2016年4月至2017年6月期间在保定市第一中心医院心胸外科确诊为NSCLC患者,经纳入标准及排除标准筛选后,选取符合入组标准的患者55例。依据端粒酶活性和端粒DNA长度的特定值进行分组:长链高活性组7例、长链低活性组14例、短链低活性组14例、短链高活性组20例。全部患者均进行一般资料收集、外周血采集以便检测NSCLC患者白细胞端粒长度和端粒酶活性代表物。在患者入院期间以及出院后均对患者生存时间及预后效果进行随访,以明确患者外周血白细胞端粒长度、端粒酶活性与患者治疗后生存时间的相关性。结果:经研究,各组患者之间年龄、性别、肿瘤病理分型、是否吸烟未见明显相关性（P>0.05）,总体对比患者临床TNM分期有统计学意义（P=0.025）。各组患者自身端粒酶活性与端粒长度无相关性（r=-0.112,P=0.228）。不同分组NSCLC患者生存时间:端粒DNA长链端粒酶低活性组患者生存时间为（30.93±1.06）月;端粒DNA长链端粒酶高活性组患者生存时间为（29.48±2.64）月;端粒DNA短链端粒酶高活性组患者生存时间为（14.70±1.65）月;端粒DNA短链端粒酶低活性组患者生存时间为（19.98±1.68）月。整体对比不同组别患者预后生存时间（OS）具有统计学意义（P<0.001）。通过Kaplan-Meier曲线组间两两对比患者预后生存时间发现:整体对比有统计学意义,不同组别之间两两对比:端粒DNA长链高活性组与端粒DNA长链低活性组对比、端粒DNA短链高活性组与短链低活性组对比、端粒DNA长链低活性组与端粒DNA短链低活性组对比均无统计学意义（P>0.05）,端粒DNA长链高活性组与端粒DNA短链高活性组对比、端粒DNA长链低活性组与端粒DNA短链高活性组对比,结果具有统计学意义（P<0.05）。经Cox风险比例回归分析得出:患者年龄、临床TNM分期、端粒长度以及端粒酶活性是影响NSCLC患者预后生存的独立风险因素。结论:评价非小细胞癌患者预后生存的独立风险因子包括患者年龄、肿瘤TNM分期、外周血白细胞端粒长度以及端粒酶活性。其中外周血白细胞端粒长度对于患者治疗效果以及生存时间的影响较其他因素更为明显。
韩森,马旭,方健[5]（2021）在《端粒与端粒酶研究在肺癌中的临床应用前景与挑战》文中研究表明肺癌是世界范围内发病率和死亡率较高的恶性肿瘤之一。端粒和端粒酶与肺癌的发生发展密切相关。虽然端粒酶可能不是导致细胞癌变的直接原因,但在维持端粒长度和肿瘤生长方面起到关键作用。包括肺癌在内的大部分肿瘤端粒长度缩短。端粒长度的变化与肺癌发生风险相关,并可能成为肺癌的治疗靶标和预测指标。针对端粒和端粒酶信号通路的靶向治疗药物正在探索中,以端粒酶抑制剂为代表的小分子药物有希望应用于肺癌的临床治疗中。但是,人们对于端粒和端粒酶的研究还远远不够,端粒长度维持的旁路作用机制可能是下一步需要深入研究的方向。
孟凡渝[6]（2020）在《基于新型无酶生物传感体系的端粒酶及miRNA检测成像技术的研究》文中提出端粒是位于线状染色体两端的DNA-蛋白质帽子结构,能够保证遗传信息以及染色体正常的生理功能。端粒酶作为一类具有逆转录作用的酶,能够决定端粒的长短和活性大小。端粒与端粒酶在细胞衰亡、肿瘤发生以及干细胞能力维持等生命活动中都至关重要,而表达和调控机制的紊乱很可能导致癌症相关疾病的发生。在大部分恶性肿瘤细胞中端粒酶都会过表达,阻止端粒长度缩短和缺失,使癌细胞永生化。由此端粒酶可作为重要的肿瘤标志物,为癌症早期诊断提供依据和相应的治疗靶点,它的检测分析具有广泛的应用价值。本论文依据端粒酶扩增的基本原理,设计相应的核酸纳米结构和分子识别探针,构建基于功能化纳米材料介导的信号放大体系,以电化学和荧光技术作为关键检测手段,开发超灵敏生物传感器,开展针对端粒酶活性相关的定量检测和细胞内成像研究,具体内容如下:1.我们首先利用纳米材料作为信号分子,设计了无PCR参与的基于电化学传感技术的端粒酶活性分析方法。在这项研究里,使用未修饰的金纳米材料（AuNPs）和电化学伏安法定量分析从HeLa细胞中提取的端粒酶的活性。在金电极上,端粒酶可以利用硫醇修饰的端粒酶底物（TS）引物和脱氧核糖核苷酸（dNTPs）的混合物,特异性地促进含有重复核苷酸序列（TTAGGG）n的单链DNA（ssDNA）的延长。在TS引物与阻断剂DNA杂交后,纳米金粒子被ssDNA延伸部分暴露的含氮碱基捕获,并且通过差分脉冲伏安法（DPV）来具体量化端粒酶活性。在分析电化学信号后,获得20到2000个细胞的线性检测范围。这种简单的分析机制的检测极限是20个细胞。此方法无需PCR参与,快速且简单,非常适合在体外灵敏的评估细胞提取物中的端粒酶活性。2.我们接着开发了一种更稳定精确的双信号比率型电化学传感器,设计核酸的发夹结构用于端粒酶活性的超灵敏分析。发夹结构的DNA探针在其5’末端用亚甲基蓝（MB）分子标记后首先被结合在金电极界面上。然后与二茂铁标记（Fc）的端粒酶底物引物（Fc）进行杂交。随着端粒酶的催化反应,重复产生（TTAGGG）n的序列,能够与发夹DNA其余部分结合,进而触发探针的构象转导,打开发夹结构。因此,MB信号从电极表面释放,检测到的氧化峰值电流（IMB）降低。同时,Fc信号不受构象变化影响,保持相对稳定,峰值电流（IFc）可以用作内部对照,提高信号输出的稳定性和准确性。这种智能结构设计可以实现可靠的目标识别,获得的结果表现出出色的分析性能,非常适合低浓度目标物的检测。实验结果发现IMB/IFc与端粒酶浓度对数线性相关,检测限度极低。这种基于核酸结构变化和比率型信号输出的方法,可以成为一种强有力的分析端粒酶活性的实用工具,也可以作为开发其他核酸分析的多功能工具。3.端粒酶催化端粒延伸反应并添加DNA重复序列,诱发癌症或其他疾病,除了体外检测,其细胞内成像分析也具有重大应用价值。因此,开发可靠和方便的端粒酶原位监测方法对于恶性肿瘤的临床诊断至关重要。然而,大多数用于细胞内端粒酶活性测定的电流探针都面临不可避免的假阳性干扰。在这项研究中,我们设计了一种核酸四面体结构,并利用荧光共振能量转移（FRET）效应,来高灵敏度的监测和分析细胞内基于端粒酶表达的自由扩增程序。其中,由DNA四面体作为结构基底和发光DNA作为有效识别序列,构建DNA纳米探针,以实现端粒酶的体外传感检测和细胞内成像,并且避免假阳性干扰的问题。端粒酶可以使其底物引物延伸产生重复序列,发生链置换反应并改变核酸探针的构型,两端标记荧光团的发光DNA被释放游离出来,信号分子之间的距离增加导致荧光的恢复。此方法基于显着的FRET效应建立了简单比率传感器,检测限度可以达到单细胞水平。这种检测系统可以在端粒酶抑制剂的筛选分析中得到应用,在抗癌药物发现中发挥作用。4.端粒酶和miRNA在肿瘤细胞中含量较高,已被公认为常见的肿瘤检测标志物。我们又设计了基于miRNA触发的DNA酶步行器,与纳米金（AuNPs）探针结构相结合,用于端粒酶活性的逻辑门传感分析。通过链置换反应,目标miRNA打开两个发卡结构,循环扩增形成双足DNA酶步行器。在AND逻辑门实验中（实验A）,端粒酶的存在使引物（Tp）被延长,与锁定链结合。双足DNA酶和Mn2+与底物链结合,发生催化剪切作用,被AuNPs抑制的羧基荧光素信号（FAM）释放到溶液中,荧光恢复。在两种目标物或任何一种目标物不存在时,检测体系的荧光皆无法恢复。在OR逻辑门实验中（实验B）,miRNA触发的双足DNA酶可以单独打开AuNPs探针上的发卡结构,在Mn2+作用下,将荧光分子释放出来。端粒酶产生的延伸产物,可以与AuNPs探针上含有FAM的锁定链结合形成双链,释放到溶液中产生荧光。单一目标物存在下,荧光信号皆可恢复,两种目标物存在下,荧光强度增加。除此之外,含有信号分子的AuNPs探针复合物、载有DNA酶和TP引物的二氧化锰（MnO2）纳米片,可被细胞自主摄取,传递到细胞中,用于细胞内成像分析。该方法使用生物逻辑门和DNA酶步行器,极大地提高了荧光探针检测的适用性和灵敏度,已成功应用于端粒酶和miRNA的体外检测和细胞内成像研究,对于临床诊断来说具有重要意义。5.在更进一步的研究中,我们策略性地制造了多功能纳米结构TDNs-Flare探针,来同时灵敏地检测端粒酶和miR-21这两种肿瘤标志物,以及进行相应的细胞内生物成像研究。TDNs-Flare探针主要是由金纳米颗粒（AuNPs）修饰的四面体DNA纳米结构（TDNs）作为基质,包含Flarel（Cy5）和Flare2（CDg）两种不同的反应性应答信号。在存在靶标的情况下,不完全互补的DNA链Flare会竞争性地从四面体框架中被置换下来,从而导致荧光信号的恢复。CDg荧光对应的miR-21线性检测范围从1 fmol到100 pmol,而Cy5荧光可以完成低至10个HeLa细胞的端粒酶浓度分析,动态分析范围从10到5000个HeLa细胞。此外,抗癌药物（Dox）在插入DNA双链后,会随目标物的识别和结合,而释放到细胞中发挥作用。这项研究表明TDNs-Flare探针是定量测定癌症生物标志物的很好的选择,并且已成功在研究中用于响应性生物成像。该纳米结构不仅克服了在细胞水平上同时检测多种生物标志物的障碍,而且在DNA装载抗癌药物的细胞内传递方面有着广阔的应用前景。
郑建波[7]（2020）在《肾细胞癌组织中hTERT启动子甲基化水平与其临床病理意义》文中认为研究背景:肾癌是泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,全世界每年诊断出超过40万名新患者,其中约17万名患者死于肾癌。近些年来肾癌的发病率呈上升趋势,其发病机制仍未被明确。近来发现端粒及端粒酶的活性在肿瘤包括肾癌等疾病的发生发展中可能起到了重要作用。端粒是位于真核细胞染色体末端的DNA-蛋白质复合体,由重复排列的富含鸟嘌呤的六聚体DNA及特定的端粒结合蛋白组成。对维持基因组和染色体稳定起重要作用。端粒酶是一种核糖核蛋白聚合酶,是一种能够延长端粒重复序列的酶,通过在人类染色体末端添加5’-TTAGGG-3’重复序列来维持端粒末端的T-Loop结构。在出生后的体细胞中端粒酶的表达通常受到抑制,如果其失调可能与致癌性有关。虽然它在大多数正常人类细胞中被抑制,但在高达90%的人类恶性肿瘤中可检测到端粒酶活性。端粒酶主要有人端粒酶逆转录酶（hTERT）、人端粒酶RNA组分（hTR）及相关蛋白3个不同的亚基组成,hTERT是端粒酶全酶的催化亚基,是端粒酶活性的限速因子。已知人hTERT基因的表达和功能通过多种途径调节,包括转录因子,启动子甲基化/突变,染色质重塑,交替剪接,蛋白质修饰导等。在这些调节手段中,转录调节是最重要的。自从发现正常细胞上大多数癌基因启动子存在高甲基化后,甲基化的遗传修饰被引起广泛的兴趣。DNA甲基化,一般发生在CpG位点。hTERT启动子区域没有TATA和CAAT盒,但含有一个致密的富含CG的CpG岛,这表明DNA甲基化在hTERT表达调控中可能起潜在的作用。对重亚硫酸氢盐处理后的基因组组测序,Theodora等人研究了 37种细胞系中hTERT的启动子甲基化状态,包括正常细胞,干细胞和癌细胞。虽然他们研究没有发现特异性甲基化位点或区域与hTERT表达相关,却证实了在端粒酶阴性的SUSM-1细胞系中通过去甲基化处理诱导了 hTERT表达。目前一些研究表明hTERT启动子的CpG岛甲基化与体内较低的端粒酶活性有关,然而更多研究表明hTERT启动子区域的超甲基化与hTERT mRNA表达正相关,这与我们通常认为的基因上某个区域的甲基化升高导致该基因的表达降低相反,因此DNA甲基化在hTERT表达和端粒酶活性调节中的潜在作用仍然有待阐明。肾细胞癌（RCC）是肾脏恶性肿瘤中最常见的癌症病理类型,诊断时转移率为25-30%。据报道,hTERT基因表达可以通过各种反式作用元件和顺式作用元件调节,包括 c-Myc,Sp1,WT1,HIF-1α,P53,TGF-β,SMYD3,染色质重塑和启动子突变。然而很少有研究涉及RCC中hTERT启动子的DNA甲基化状态。为此,我们使用焦磷酸测序定量评估了 hTERT启动子区域中转录上游的筛选出的5个CpG位点的甲基化水平,进一步探讨hTERT启动子甲基化百分比和hTERT表达,端粒酶活性,临床分期和患者预后之间的相关性,并对hTERT启动子甲基化水平与其表达和端粒酶活性之间的关系进行了探讨,探索hTERT启动子甲基化在肾肿瘤发生发展中的潜在作用,筛选预测肾肿瘤预后的生物标志物。研究目的:通过收集103例肾细胞癌患者的年龄、性别、肿瘤类型、TNM分期、Fuhrman分级等临床病理特征并随访手术后预后情况,检测肾细胞癌及配对癌旁正常组织的hTERT启动子甲基化水平、hTERT mRNA相对表达丰度,端粒酶活性。分析hTERT启动子甲基化水平与hTERT mRNA相对表达丰度,端粒酶活性3者之间的相互关系及其与肾细胞癌患者年龄、性别、肿瘤类型、TNM分期、Fuhrman分级等特征之间的关系,对hTERT启动子甲基化水平在肾细胞癌中的潜在作用机制进行初步的研究。研究对象及方法:收集2009年至2014年期间,在山东大学齐鲁医院入院手术的103名患者中,通过根治性肾切除术（n=99）或肾单位保留手术（n=4）获得成对的肾肿瘤组织和与肿瘤相邻的正常组织（NAT）。所有标本均通过组织病理学检查确认诊断。将标本在-80℃冷冻直至随后的实验室分析。对这些患者进行随访研究,随访时间从2009年1月1日起,截止时间2016年11月30日。以手术时间作为观察起点,直至患者出现死亡,记录每个病例的年龄、性别、左右、病理类型、TNM分期、Fuhrman分级、生存时间等资料。按照DNeasy组织试剂盒（Qiagen Ltd,Venlo,Netherlands）说明书从冷冻组织标本中提取DNA。通过分光光度法测量DNA浓度并调节至50ng/ml。采用EpiTect Bisulfite试剂盒（Qiagen）,严格按照产品说明书进行基因组DNA的亚硫酸氢盐修饰。通过采用特异性的引物对亚硫酸氢盐转化的基因组DNA进行PCR,PCR结果确认DNA的亚硫酸氢盐转化成功。使用PyroMark PCR试剂盒（Qiagen）进行 PCR。使用 PyroMark Assay Design Software 2.0 设计引物。对于所有样品,用0.5μl亚硫酸氢盐转化的基因组DNA进行PCR反应。使用生物素标记的引物（反向引物）通过使用链霉抗生物素蛋白包被的Sepharose珠（GE Healthcare,UK）纯化PCR产物。将PCR产物与Sepharose珠结合,纯化,洗涤,用0.2M NaOH溶液变性,并再次洗涤。然后将0.3μM测序引物与纯化的单链PCR产物退火,并根据产品说明在PyroMark Q96（Qiagen）中进行焦磷酸测序。为了总亚硫酸氢盐转化的内部对照,焦磷酸测序的区域中的非CG胞嘧啶也被包括。使用TRizol试剂（Invitrogen）从组织样品中提取总细胞RNA。使用总共1μg的RNA用M-MLV逆转录酶（Thermo,Lithuania）进行逆转录。使用SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems,Foster City,CA）在 7000 实时 PCR系统（Applied Biosystems）中进行QPCR。β2-作为内参照物。根据阈值循环值,使用2-△△Ct方法计算标本中hTERT mRNA的相对水平。使用TeloTAGGG端粒酶PCR ELISA试剂盒（Roche Diagnostics）测定端粒酶活性。提取1.0μg蛋白质进行测定,并且在端粒酶-引物延伸反应后进行30个PCR循环。使用ELISA显色反应检测PCR产物。端粒酶活性水平表示为吸光度[测定在450nm上的OD值（参考波长690nm）]。对正态分布的采用t检验。不符合正态分布的未配对组采用Mann-Whitney U检验,配对组采用Wilcoxon秩和检验,3组样本之间比较采用多样本比较的秩和检验,Kruskal-Wallis法来进行整体分析及两两比较。对于指标与预后之间的关系,采用Kaplan-Meier分析,对Log-rank检验有意义的单因素纳入多因素Cox回归分析,报告的所有P值均为双尾检验,并且采用值小于0.05。SPSS 16.0软件统计结果提示P=0.000,做图时按P<0.001显示处理。研究结果:我们提取12个肾癌组织和相对应癌旁正常组织（NAT）的DNA,采用重亚硫酸盐转化后,设计了 3对PCR引物对hTERT启动子的三个区域的14个CpG位点进行焦磷酸测序。在所有14个检查的CpG位点中发现,与NAT相比,我们发现肾癌组织中的hTERT启动子区CpG甲基化百分比更高,按P小于0.05,2组之间均有显着统计学意义。同时在三个区域PCR过程中,我们发现包含位点1至5区域的PCR扩增信号最稳定。以这个区域为研究对象,我们扩大检测样本,使用焦磷酸测序检测了 103名肾癌患者配对样本中位点1至位点5的甲基化百分比。我们发现与NAT相比,肾癌组织中所有5个CpG位点都显着高甲基化。在所有103个肾肿瘤组织和配对NAT中,患者的年龄与MMP1-5（means of methylation percentage of CpG sitel to site2）之间均不存在线性相关性。肾癌组织中MMP 1-5和hTERT全长mRNA表达（R2=0.450）之间观察到较高的正相关。一致地,在MMP 1-5和端粒酶活性之间也发现了正相关（R2=0.446）。我们的数据表明hTERT启动子在肾癌组织中是高甲基化的,并且甲基化水平与hTERT mRNA表达和端粒酶活性密切相关。我们研究hTERT启动子甲基化水平与临床病理特征之间的关联,发现所有患者的甲基化与年龄和性别无关。同时我们发现较高水平的hTERT启动子甲基化水平与疾病阶段显着相关,但是我们的数据发现Fuhrman等级之间与hTERT甲基化水平没有统计学显着差异。同时,透明细胞RCC（ccRCC）和非ccRCC之间的hTERT启动子甲基化水平没有显着差异。肾肿瘤组织与NAT相比,全长hTERT mRNA表达及端粒酶活性有明显的统计学差异,hTERT表达与端粒酶活性之间存在直线相关性。经单因素的分析,患者的TNM分期,细胞Fuhrman分级,hTERT启动子甲基化水平,hTERT mRNA表达水平,端粒酶活性对肾癌术后生存率有影响,经多因素Cox回归分析发现AJCC分期、hTERT启动子甲基化水平是影响肾癌病人预后的独立因素。研究结论:综上所述,我们通过对人肾癌中hTERT启动子甲基化水平、hTERT表达及端粒酶活性与临床特征和预后之间的相关性研究,我们发现hTERT启动子甲基化与hTERT表达/端粒酶活性之间存在正相关,hTERT表达与端粒酶活性之间存在正相关。hTERT启动子甲基化此外,我们发现了 hTERT启动子甲基化、hTERT mRNA表达及端粒酶活性与临床结果之间的密切关联,是肾癌预后不良的危险因素。hTERT启动子CaAvg（按48.3%分层）,AJCC分层是影响肾癌患者手术之后预后的独立因素,hTERT启动子甲基化水平影响hTERT mRNA表达及端粒酶活性,影响肾癌预后,揭示这种表观遗传改变可以作为RCC诊断和预后的有价值的生物标志物。
白华荣[8]（2020）在《功能核酸在恶性肿瘤诊疗中的应用研究》文中进行了进一步梳理随着经济社会不断发展,人们对生命健康的诉求日益提高。生命活动相关的生物医学问题,如疾病早期诊断与治疗,也越来越受到人类重视,已成为现代生物医学重要发展方向。基于此,科学家们在生物医学领域进行了不断探索,并在疾病生物标志物灵敏检测和恶性肿瘤诊疗新体系构建方面取得了重要进展。其中,功能核酸作为一种具有特殊功能的核酸元件可以为生物医学研究和发展提供全新思路。纳米材料凭借其优异的物理化学性质在生物传感和肿瘤诊疗领域越来越受到关注。此外,功能核酸和纳米材料两者相互结合构建的一系列新型多功能纳米体系可用于生物成像和治疗,是一类理想的生物传感工具。功能核酸作为具有特殊功能的核酸分子,具体包括DNAzyme、核酸适体、i-motif结构、反义DNA、siRNAs等。其中核酸适体是通过SELEX技术筛选得到的单链RNA或DNA,能够选择性和特异性识别与结合靶标。另外DNAzymes是一类可以通过体外筛选获得的具有催化活性的单链DNA,具有与核酶相似催化功能,例如催化RNA或DNA切割或者连接,光切割胸腺嘧啶二聚体等。由于具有较强识别和结合能力、水溶性和生物相容性好等特性,功能核酸在生物传感、环境分析、药物释放和癌症诊疗等研究领域得到广泛应用。然而,功能核酸在实际应用中仍然存在很多限制。例如,功能核酸与靶标的结合在复杂体系中易受干扰、很难进入细胞、易被核酸酶降解以及在体内循环时间短等。纳米材料是指几何尺寸达到纳米量级的一类具有特殊性能的材料。由于具有比表面积大、负载能力强、生物相容性好等特性,纳米材料已被广泛应用于生物传感和肿瘤诊疗等领域。介孔二氧化硅纳米材料、二氧化锰（MnO2）纳米材料、金纳米颗粒、上转换纳米材料、DNA纳米材料等便是其中典型代表。尤其是具有磁性、带电性、荧光性质或者光热效应等特性的纳米材料,其本身就可以作为成像分子或药物应用于癌症诊疗领域。基于以上研究背景,围绕如何提高核酸适体在复杂体系中效能及如何将功能核酸修饰的纳米材料应用到肿瘤诊疗中,本论文开发了一系列基于功能核酸的分子探针和纳米生物传感体系用于肿瘤诊疗领域。具体包括以下内容:（1）为了提高在复杂体系中核酸适体与靶蛋白间相互作用的抗干扰能力,我们合成醛基基团和F-羧基基团修饰的核酸适体,发展蛋白质-核酸适体模板（PAT）技术,实现了核酸适体在靶蛋白上定点交联,得到蛋白质-核酸适体共轭物。实验结果表明PAT技术能有效促进核酸适体与靶蛋白之间形成特异性共价键,为细胞膜蛋白分离鉴定提供有力手段。（2）除了在复杂体系中与靶标蛋白间的相互作用易受干扰这一问题外,功能核酸还存在很难进入细胞的缺点。基于F碱基独特的疏水性和自聚特性,我们将F碱基整合到DNA分子序列中,并研究了不同数量和位点修饰的功能核酸细胞内在化性能。实验证明由于疏水性F碱基配对诱导保护效应,相比茎部形成F-F碱基对的发卡型DNA,单链F碱基修饰的线型DNA具有更强的细胞内在化能力。由此证实构象转换能够增强F碱基修饰功能核酸的细胞内在化能力。（3）为了进一步提高功能核酸进入细胞的效率,我们利用DNAzyme放大和催化发卡自组装（CHA）放大相结合策略,构建了一种基于级联放大反应的CAR纳米探针。该纳米探针由MnO2纳米片、DNAzyme和CHA等组分构成。MnO2纳米片既可以做为载体将DNAzyme和CHA递送到细胞内,又可以在细胞内被降解,进而将所有DNA链释放到胞内同一位置。降解产生的Mn2+通过质子海绵效应能促进DNA链溶酶体逃逸,同时作为DNAzyme辅助因子实现对DNA链的酶切,通过细胞内级联放大反应,实现细胞内端粒酶活性灵敏检测。该方法为细胞内生物分子灵敏检测提供了新思路。（4）我们进一步将光敏剂PcC4装载入介孔二氧化硅颗粒中,用DNA链O1堵孔,构建了一种基于双蛋白驱动激活的新型纳米光敏剂。该新型纳米光敏剂在d NTPs存在时,颗粒表面DNA链O1可以被端粒酶延伸,在DNA链3’端产生端粒重复序列,与5’端序列互补。互补产生的杂交链会形成具有刚性的发卡型DNA结构,并从颗粒表面脱离下来,释放出PcC4。释放出的PcC4与胞内白蛋白结合,激活自淬灭状态PcC4,使其在光照条件下,产生ROS,实现肿瘤特异性成像和光动力治疗。
刘晓亭[9]（2020）在《新型核酸纳米载体的设计及在肿瘤细胞成像和药物递送中的应用研究》文中提出目前医学水平和诊断技术得到了快速的发展,但癌症的发病率和死亡率仍然处在较高水平,是威胁人类健康和生命的重大疾病之一。癌症的早期诊断和精准治疗是决定癌症能否得到成功治愈的关键因素。近年来,肿瘤标志物的不断发现为癌症早期诊断提供了保障,细胞内肿瘤标志物种类较多,表达水平也有所差异,对于一些低表达丰度的肿瘤标志物需要建立更加灵敏的分析方法。另一方面,化学治疗作为癌症治疗的经典方法之一,但化疗通常会受到化疗药物低溶解性、强的毒副作用及耐药性等问题的制约,因此,需要开发具有特定功能的纳米载体进行化疗药物的递送。本论文致力于新型核酸纳米载体的设计及在肿瘤细胞成像和药物递送方面的应用研究。通过对目前已报道的核酸纳米载体进行总结,发现随着核酸纳米载体研究的深入,仍然存在一些不足和挑战:（1）现有的核酸纳米载体多为细胞质递送化疗药物,耐药细胞中细胞膜上过表达的外排转运体会将细胞质中的药物重新泵出细胞,降低细胞内的药物浓度,限制化疗效果,因此,如何构建药物作用位点靶向的核酸纳米载体对于提高药物的作用效果具有重要意义;（2）在应对化疗过程中出现的药物耐受性的问题上,常用的策略是利用纳米载体避开外排转运体介导的药物外排,而直接抑制外排转运体的表达是一种更根本的策略来应对药物耐受性;（3）细胞内许多肿瘤标志物的表达丰度偏低,目前多数具有细胞成像和药物递送双重功能的核酸纳米载体输出方式为1:1式,极大的限制了检测的灵敏度和药物释放,构建具有信号放大特性的核酸纳米载体来实现活细胞内肿瘤标志物的灵敏检测及药物释放是一个关键问题。基于以上问题和挑战,设计了三种新型的核酸纳米载体用于活细胞内肿瘤标志物的成像及药物递送。本文主要分为以下五章内容:第一章为绪论部分,主要分析了癌症诊断和治疗上所面临的严峻挑战,介绍了用于核酸纳米载体设计的经典核酸结构单元、金纳米颗粒,概述了核酸纳米载体在癌症诊断与治疗中的研究进展,并以此为基础总结了目前核酸纳米载体在细胞成像和药物递送上存在的问题。第二章,构建了一种内源性刺激响应核靶向的纳米载体（AuNP-mRS-DSs）用于活细胞内MRP1 mRNA的成像和药物递送。纳米载体由三部分组成:（ⅰ）金纳米颗粒（AuNP）,用于装载DNA和淬灭荧光;（ⅱ）mRNA识别序列（mRS）通过金-硫键连接到AuNP表面,用于MRP1 mRNA的特异性识别;（ⅲ）可拆卸的亚单位（DS）,由Cy5标记的DNA连接链和核仁素识别基序（含AS1411适体）杂交而成,并通过DNA连接链连接到mRS上,用于装载阿霉素（Dox）、结合核仁素及荧光信号的输出。首先,纳米载体的核仁素识别基序靶向肿瘤细胞表面过表达的核仁素,然后整个纳米载体在核仁素介导的内化作用下进入细胞。随后,mRS特异性识别过表达的MRP1 mRNA,从而释放束缚的DS,被AuNP淬灭的Cy5荧光恢复。最后,利用核仁素从细胞质到细胞核穿梭的作用,DS靶向细胞核递送Dox。细胞内荧光成像可以实现耐药细胞和非耐药细胞的区分。此外,通过荧光成像可以观察到耐药细胞中释放的可拆卸亚单位的分布。与游离阿霉素（IC50>8.00 μM）相比,将 Dox 装载到 AuNP-mRS-DSs 后对 MCF-7/ADR细胞的IC50更低为2.20 μM,这表明利用核酸纳米载体载药对耐药的乳腺癌细胞具有极好的抑制效果。该纳米载体在癌症化疗敏感性预测和耐药性的规避上具有重要意义。第三章,构建了多功能分子信标（MBs）修饰的金纳米颗粒作为纳米载体（MBs-AuNP）,用于活细胞内耐药相关mRNA的协同抑制及原位成像。MBs-AuNP由两部分构成:（ⅰ）三种特殊设计的分子信标修饰到AuNP表面,用于结合耐药相关的mRNAs,装载Dox并输出荧光信号;（ⅱ）AuNP,用于装载MBs,介导MBs进入细胞并淬灭荧光。被细胞摄取后,MBs-AuNP与三种不同的耐药相关 mRNA（MDR1 mRNA、MRP1 mRNA 和 BCRP mRNA）杂交,通过抑制mRNAs的翻译过程来减少外排蛋白的表达,同时,被AuNP淬灭的荧光团远离金纳米粒,荧光恢复,实现mRNAs的原位成像。实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和蛋白印迹结果表明,经MBs-AuNP处理后耐药肿瘤细胞内耐药相关mRNA和外排蛋白的表达均有所下降。与游离Dox相比,Dox-MBs-AuNP对HepG2/ADR（IC50:0.35 vs 1.06μM）和 MCF-7/ADR（IC50:2.78 vs>5μM）具有更好的细胞毒性。通过荧光成像分析可直接观察细胞内杂交事件并实现耐药和非耐药肿瘤细胞的区分。该纳米载体能够通过基因沉默来下调多种外排蛋白的表达,实现对沉默事件的原位监测,提供了一种从基因水平应对药物耐受性的策略。第四章,构建了一种端粒酶特异性的DNAzyme驱动的DNA walker作为纳米载体（tsDNA-AuNP）用于细胞内端粒酶的活性分析及药物递送。该纳米载体由三部分构成:（ⅰ）AuNP,用于装载DNA并淬灭荧光;（ⅱ）行走链,由端粒酶引物和含DNAzyme序列的发卡结构杂交而成,用于结合端粒酶及切割底物发卡;（ⅲ）含有DNAzyme切割位点的底物发卡,用于装载阿霉素并输出荧光信号。该纳米载体内化入胞后,端粒酶引物在端粒酶的作用下发生延伸,打开含DNAzyme序列的发卡结构,释放被封闭的DNAzyme序列,然后行走链沿着三维的轨道运动,在外加Mn2+的作用下切割含DNAzyme切割位点的底物发卡,输出荧光信号并释放阿霉素,随后进行下一轮的切割反应。该方法能够实现低至10个HeLa细胞中端粒酶活性的检测,通过荧光成像的方法能够实现肿瘤细胞和正常细胞的区分,此外,该核酸纳米载体也能够用于端粒酶抑制剂的筛选。第五章为结论部分,主要总结了本论文的创新点及前景展望。
熊佳惠[10]（2020）在《基于网络药理学方法研究附子理中汤治疗晚期胃癌的作用机制》文中研究指明目的:基于网络药理学的方法,探讨附子理中汤对于晚期胃癌的作用机制。方法:首先,通过TCMSP数据库、Drug Bank数据库和Pharm Mapper平台对附子理中汤所含化学活性成分进行筛选并获取其作用靶点,再利用GAD、OMIM及CTD数据库获得胃癌的相关靶点;然后,利用Draw Ven Diagram平台制作韦恩图,获得两者的交集靶点蛋白,通过Cytoscape3.5.1软件构建出蛋白互作图;再通过DAVID分析工具和KOBAS3.0软件对搜集到的靶点蛋白从生物过程（biological process,BP）、分子功能（molecular function,MF）和细胞组分（cellular component,CC）三个方向进行基因本体功能富集分析和KEGG通路分析;最后,利用PDB数据库、Systems Dock Web Site数据库集进行受体-配体的分子对接,并分析docking scores,验证附子理中汤治疗晚期胃癌的有效性。结果:从TCMSP数据库筛选出附子理中汤的147种化学成分,其中预测到4791个靶点,通过CTD、OMIM筛选出28006个与胃癌相关的靶点,最后韦恩图确定附子理中汤治疗晚期胃癌存在346个潜在靶标;其中附子理中汤与胃癌相互作用的关键靶标有TP53（肿瘤抑制蛋白p53）、AKT1（蛋白激酶B）、CDKN1A（细胞周期素依赖性激酶抑制因子1A）、STAT3（信号转导子与转录激活因子3）、BCL2L1（促生存因子）、JUN（核内癌基因）、CCND1（细胞周期素D1）、EGF（表皮生长因子）等,主要作用机制可能涉及2-Oxocarboxylicacid metabolism（2-氧羧酸代谢）信号通路和Propanoate metabolism（丙酸盐代谢）信号通路等分子通路,分子对接结果中表明STAT3对接分数最高,与附子理中汤有较好的结合性。结论:附子理中汤治疗晚期胃癌的关键靶点包括TP53（肿瘤抑制蛋白p53）、AKT1（蛋白激酶B）、CDKN1A（细胞周期素依赖性激酶抑制因子1A）、STAT3（信号转导子与转录激活因子3）、BCL2L1（促生存因子）、JUN（核内癌基因）、CCND1（细胞周期素D1）、EGF（表皮生长因子）等,其主要作用机制可能涉及2-Oxocarboxylicacid metabolism（2-氧羧酸代谢）信号通路和Propanoate metabolism（丙酸盐代谢）信号通路等分子通路等,靶点STAT3与附子理中汤有较好的结合性,可能在附子理中汤治疗晚期胃癌的过程中发挥着至关重要的作用。
二、恶性肿瘤与端粒 端粒酶相关关系的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、恶性肿瘤与端粒 端粒酶相关关系的研究进展（论文提纲范文）
（1）端粒长度与端粒酶：环境致癌物接触的早期生物标志物（论文提纲范文）
| 1 端粒、端粒长度和端粒酶 |
| 2 环境致癌物对端粒长度和端粒酶活性的影响 |
| 2.1 PAHs |
| 2.2 砷 |
| 2.3 颗粒物 |
| 3 端粒长度与端粒酶活性作为环境致癌物接触的早期生物标志 |
| 4 展 望 |
（2）人端粒酶逆转录酶hTERT鉴别乳腺良恶性肿瘤的Meta分析（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1 资料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述:人端粒酶逆转录酶h TERT在乳腺肿瘤诊断治疗中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的文章 |
（3）免疫调节和雄激素在IPF中的作用及吡非尼酮的临床安全性评估（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 遗传因素在特发性肺纤维化发病机制中的作用 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 结论 |
| 第二部分 B7H3在特发性肺纤维化中的表达水平和潜在作用 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 第三部分 性激素在特发性肺纤维化发病机制中的潜在作用 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论 |
| 第四部分 真实世界研究:探索吡非尼酮在临床实际应用中的有效性和耐受性 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 结论 |
| 综述 B7H3的功能及其在纤维化性间质性肺病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 附录 |
| 致谢 |
（4）外周血白细胞端粒长度与端粒酶活性对非小细胞肺癌患者预后的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 端粒长度、端粒酶与非小细胞肺癌患者预后相关性研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）基于新型无酶生物传感体系的端粒酶及miRNA检测成像技术的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 端粒和端粒酶概述 |
| 1.1.1 端粒和端粒酶的发现 |
| 1.1.2 端粒和端粒酶的组成结构 |
| 1.1.3 端粒和端粒酶的功能 |
| 1.1.4 端粒和端粒酶的研究应用 |
| 1.1.5 端粒酶的测定 |
| 1.2 基于生物传感器的检测方法 |
| 1.2.1 生物传感器的检测原理 |
| 1.2.2 电化学生物传感器检测 |
| 1.2.3 荧光生物传感器检测 |
| 1.2.4 其他生物传感器检测 |
| 1.3 核酸纳米结构在检测中的应用 |
| 1.3.1 核酸纳米结构的可控组装 |
| 1.3.2 核酸纳米结构在体外生物传感中的应用 |
| 1.3.3 核酸纳米结构在细胞内成像中的应用 |
| 1.4 本课题的研究意义 |
| 第2章 基于金纳米粒子的端粒酶直接电化学生物传感 |
| 2.1 背景介绍 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 材料和化学品 |
| 2.2.2 细胞培养和端粒酶提取 |
| 2.2.3 凝胶电泳 |
| 2.2.4 AuNPs的制备和表征 |
| 2.2.5 工作电极预处理和实验条件优化 |
| 2.2.6 端粒酶延伸和AuNPs捕获 |
| 2.2.7 电化学测量 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 端粒酶活性测定的原理 |
| 2.3.2 AuNPs图像和实验优化 |
| 2.3.3 使用凝胶电泳检测端粒酶活性 |
| 2.3.4 生物传感器构建的表征 |
| 2.3.5 端粒酶活性的量化 |
| 2.3.6 传感器的评估 |
| 2.4 结论 |
| 第3章 基于比率型电化学传感策略的端粒酶活性超灵敏检测 |
| 3.1 背景介绍 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验材料和试剂 |
| 3.2.2 二硫键的还原反应 |
| 3.2.3 细胞培养和端粒酶提取 |
| 3.2.4 端粒酶活性检测过程 |
| 3.2.5 电化学测量 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 端粒酶检测的原理 |
| 3.3.2 电极修饰过程的表征 |
| 3.3.3 比率传感器的表征 |
| 3.3.4 端粒酶活性的检测 |
| 3.3.5 端粒酶抑制剂的分析 |
| 3.3.6 不同细胞系端粒酶活性分析 |
| 3.4 结论 |
| 第4章 基于荧光共振能量转移和DNA纳米探针的比率型传感器用于端粒酶活性分析 |
| 4.1 背景介绍 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 材料和化学品 |
| 4.2.2 DNA四面体的制备 |
| 4.2.3 细胞培养及端粒酶的提取 |
| 4.2.4 凝胶电泳实验 |
| 4.2.5 DNA探针的毒性检测 |
| 4.2.6 端粒酶活性的体外定量 |
| 4.2.7 原位成像 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 传感原理 |
| 4.3.2 检测体系的适用性 |
| 4.3.3 检测体系的荧光定性分析 |
| 4.3.4 DNA纳米探针的毒性分析 |
| 4.3.5 荧光信号的浓度优化 |
| 4.3.6 端粒酶活性的体外分析 |
| 4.3.7 特异性调查 |
| 4.3.8 细胞内成像 |
| 4.4 结论 |
| 第5章 基于miRNA触发的DNA酶步行器用于端粒酶活性的逻辑门传感检测 |
| 5.1 背景介绍 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 实验试剂和材料 |
| 5.2.2 AuNPs和MnO_2的合成 |
| 5.2.3 AuNPs探针和DNA酶的预处理 |
| 5.2.4 细胞培养和端粒酶提取 |
| 5.2.5 端粒酶和miRNA的体外检测和分析 |
| 5.2.6 检测体系的特异性和毒性测定 |
| 5.2.7 共聚焦荧光显微镜的细胞内成像 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 实验原理 |
| 5.3.2 检测体系的荧光表征 |
| 5.3.3 反应条件的优化 |
| 5.3.4 端粒酶和miRNA体外传感检测 |
| 5.3.5 检测体系的评估 |
| 5.3.6 细胞毒性实验 |
| 5.3.7 目标物的共聚焦成像 |
| 5.4 总结 |
| 第6章 基于核酸四面体和荧光探针介导的端粒酶与MiR-21的检测和细胞内成像 |
| 6.1 背景介绍 |
| 6.2 实验部分 |
| 6.2.1 化学试剂和仪器 |
| 6.2.2 TDNs-Flare探针的制造 |
| 6.2.3 细胞培养和端粒酶提取 |
| 6.2.4 端粒酶和miR-21的体外评估 |
| 6.2.5 TDNs-Flare探针的细胞特异性和毒性测定 |
| 6.2.6 共聚焦荧光显微镜的细胞内成像 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 TDNs-Flare探针检测端粒酶和miR-21的原理 |
| 6.3.2 TDNs-Flare探针的结构和光学表征 |
| 6.3.3 端粒酶和miR-21的体外检测 |
| 6.3.4 检测方法的稳定性和细胞毒性 |
| 6.3.5 TDNs-Flare探针用于原位成像 |
| 6.4 结论 |
| 第7章 论文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与其他研究成果 |
（7）肾细胞癌组织中hTERT启动子甲基化水平与其临床病理意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 人TERT启动子甲基化水平及其与肾细胞癌病理特征的关系研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 人hTERT启动子甲基化水平等影响肾细胞癌预后的多因素分析 |
| 前言 |
| 对象与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 综述 肾癌DNA甲基化研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 附英文文章 |
（8）功能核酸在恶性肿瘤诊疗中的应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 功能核酸 |
| 1.2.1 核酸适体 |
| 1.2.2 脱氧核酶 |
| 1.3 纳米材料在生物医学中的应用 |
| 1.3.1 MnO_2纳米材料 |
| 1.3.2 介孔硅纳米材料 |
| 1.4 本研究论文的构想 |
| 第2章 化学基团修饰的核酸适体用于蛋白质特异性标记研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 试剂与仪器 |
| 2.2.2 化合物的合成 |
| 2.2.3 DNA合成和纯化 |
| 2.2.4 3’端醛基基团修饰的DNA合成 |
| 2.2.5 F-羧基基团修饰的DNA合成 |
| 2.2.6 醛基基团修饰底物的PATCL反应 |
| 2.2.7 F-羧基基团修饰底物的PATCL反应 |
| 2.2.8 细胞培养 |
| 2.2.9 流式细胞仪检测实验 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 PAT指导的蛋白质-核酸适体交联反应原理 |
| 2.3.2 PAT中连接linker的优化 |
| 2.3.3 PAT中醛基基团的选择性考察 |
| 2.3.4 F-羧基基团修饰的核酸适体构建与选择性考察 |
| 2.3.5 化学基团修饰的核酸适体与靶细胞的结合情况考察 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 F碱基修饰DNA的细胞内在化性能研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 试剂与仪器 |
| 3.2.2 F碱基亚磷酰胺单体的合成 |
| 3.2.3 DNA合成 |
| 3.2.4 质谱分析 |
| 3.2.5 荧光检测 |
| 3.2.6 琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.2.7 细胞培养 |
| 3.2.8 流式细胞仪检测 |
| 3.2.9 荧光共聚焦显微成像实验 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 氟碱基亚磷酰胺单体 |
| 3.3.2 F6-MB的形成与构象转换分析 |
| 3.3.3 F6-hairpin和 F6-hairpin/cDNA的细胞内在化分析 |
| 3.3.4 F6-ds DNA和 F12-ss DNA的细胞内在化分析 |
| 3.3.5 疏水性F碱基的配对诱导保护效应 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 基于级联放大反应的纳米探针用于细胞内端粒酶活性放大检测 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 试剂与仪器 |
| 4.2.2 MnO_2纳米片制备 |
| 4.2.3 荧光检测 |
| 4.2.4 体外酶切检测 |
| 4.2.5 催化发卡结构形成 |
| 4.2.6 琼脂糖凝胶电泳实验 |
| 4.2.7 CAR纳米系统的构建 |
| 4.2.8 细胞培养 |
| 4.2.9 细胞提取物获取 |
| 4.2.10 细胞提取物中端粒酶活性检测 |
| 4.2.11 流式细胞仪检测实验 |
| 4.2.12 荧光共聚焦显微成像实验 |
| 4.2.13 细胞毒性检测 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 CAR纳米探针构建 |
| 4.3.2 DNAzyme-CHA级联反应分析 |
| 4.3.3 CAR纳米探针的构建与表征 |
| 4.3.4 CAR纳米探针的细胞内在化 |
| 4.3.5 CAR纳米探针对HeLa中端粒酶活性检测 |
| 4.3.6 CAR纳米探针对单个HeLa中端粒酶活性检测 |
| 4.3.7 CAR纳米探针对不同细胞系中端粒酶活性的评估 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 双蛋白驱动的可激活式纳米光敏剂用于肿瘤特异性治疗 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 试剂与仪器 |
| 5.2.2 MSN合成 |
| 5.2.3 介孔二氧化硅表面氨基化修饰 |
| 5.2.4 PcC4-MSN制备 |
| 5.2.5 PcC4-MSN-O1 制备 |
| 5.2.6 细胞培养 |
| 5.2.7 细胞提取物的获得 |
| 5.2.8 双蛋白响应实验 |
| 5.2.9 细胞毒性实验 |
| 5.2.10 光动力治疗实验 |
| 5.2.11 瘤内注射后的活体成像 |
| 5.2.12 瘤内注射后的活体光动力治疗 |
| 5.2.13 静脉注射后的活体/离体荧光成像 |
| 5.2.14 静脉注射后的活体光动力治疗 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 白蛋白对PcC4 聚集体的解聚作用分析 |
| 5.3.2 PcC4-MSN-O1 的制备和分析 |
| 5.3.3 PcC4-MSN-O1 对端粒酶和白蛋白的响应分析 |
| 5.3.4 PcC4-MSN-O1 的光动力治疗分析 |
| 5.3.5 PcC4-MSN-O1 在活体内光动力治疗分析 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录A 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 致谢 |
（9）新型核酸纳米载体的设计及在肿瘤细胞成像和药物递送中的应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号与缩写 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 癌症的诊断与治疗 |
| 1.1.1 癌症的诊断 |
| 1.1.2 癌症的治疗 |
| 1.1.3 癌症的诊疗一体化 |
| 1.2 经典的核酸结构单元用于设计纳米载体 |
| 1.2.1 核酸适配体 |
| 1.2.2 脱氧核酶 |
| 1.2.3 分子信标 |
| 1.2.4 双链探针 |
| 1.3 金纳米颗粒 |
| 1.3.1 金纳米颗粒的理化性质 |
| 1.3.2 金纳米颗粒分布、代谢性质和毒理研究 |
| 1.3.3 金纳米颗粒在癌症诊疗中的应用研究 |
| 1.4 核酸纳米载体在癌症诊断和治疗中的研究进展 |
| 1.4.1 具有荧光特性的核酸纳米探针用于肿瘤细胞成像 |
| 1.4.2 核酸纳米载体在药物递送中的研究 |
| 1.4.3 基于核酸纳米载体的癌症诊疗一体化研究 |
| 1.5 本论文解决的科学问题及研究内容 |
| 参考文献 |
| 第二章 内源性刺激响应核靶向的纳米载体用于细胞内mRNA成像及药物递送 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 试剂和仪器 |
| 2.2.2 凝胶电泳实验 |
| 2.2.3 金纳米颗粒(AuNPs)的合成及AuNP-mRS-DSs的制备 |
| 2.2.4 金纳米颗粒表面mRS-DS的修饰量考察 |
| 2.2.5 特异性考察 |
| 2.2.6 杂交实验 |
| 2.2.7 细胞系及细胞培养 |
| 2.2.8 细胞内荧光成像实验 |
| 2.2.9 qRT-PCR对MRP1 mRNA进行分析 |
| 2.2.10 细胞摄取 |
| 2.2.11 阿霉素插入实验 |
| 2.2.12 细胞存活率考察 |
| 2.2.13 统计学分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 DNA序列设计的可行性验证 |
| 2.3.2 AuNP-mRS-DSs的表征 |
| 2.3.3 金纳米颗粒表面mRS-DS的修饰量及AuNP-mRS-DSs的特异性考察 |
| 2.3.4 AuNP-mRS-DSs的选择性考察 |
| 2.3.5 细胞内荧光成像 |
| 2.3.6 细胞摄取 |
| 2.3.7 纳米载体的载药量考察 |
| 2.3.8 细胞存活率考察 |
| 2.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 多功能分子信标修饰的金纳米颗粒作为纳米载体用于活细胞内耐药相关mRNA的协同抑制及原位成像 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 试剂和仪器 |
| 3.2.2 凝胶电泳实验 |
| 3.2.3 金纳米颗粒(AuNPs)的合成及MBs-AuNP的制备 |
| 3.2.4 金纳米颗粒表面分子信标的修饰量考察 |
| 3.2.5 可行性与稳定性实验 |
| 3.2.6 细胞系及细胞培养 |
| 3.2.7 细胞内荧光成像 |
| 3.2.8 MDR1 mRNA、MRP1 mRNA和BCRP mRNA的相对表达水平分析 |
| 3.2.9 Western blotting实验 |
| 3.2.10 阿霉素插入实验 |
| 3.2.11 细胞毒性实验 |
| 3.2.12 统计学分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 DNA序列设计的可行性验证 |
| 3.3.2 MBs-AuNP的表征 |
| 3.3.3 金纳米颗粒表面分子信标的修饰量考察 |
| 3.3.4 可行性及稳定性考察 |
| 3.3.5 细胞内荧光成像 |
| 3.3.6 MBs-AuNP对细胞内耐药相关mRNA和蛋白水平的影响 |
| 3.3.7 纳米载体的载药量考察 |
| 3.3.8 细胞存活率实验 |
| 3.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第四章 端粒酶特异性的DNAzyme驱动的DNA walker作为纳米载体用于活细胞内端粒酶活性分析及药物递送 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 试剂和仪器 |
| 4.2.2 凝胶电泳实验 |
| 4.2.3 金纳米颗粒(AuNPs)的制备 |
| 4.2.4 tsDNA-AuNP的制备及其表面底物发卡修饰量的考察 |
| 4.2.5 细胞培养及HeLa细胞提取液的制备 |
| 4.2.6 HeLa细胞提取液中端粒酶活性检测 |
| 4.2.7 tsDNA-AuNP的稳定性考察 |
| 4.2.8 细胞内端粒酶活性的成像分析 |
| 4.2.9 TERT mRNA的相对表达水平分析 |
| 4.2.10 端粒酶抑制剂的筛选 |
| 4.2.11 阿霉素插入实验 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 DNA序列设计的可行性验证 |
| 4.3.2 tsDNA-AuNP的表征 |
| 4.3.3 tsDNA-AuNP的可行性和稳定性考察 |
| 4.3.4 行走链与底物发卡修饰比例的考察 |
| 4.3.5 tsDNA-AuNP检测性能的考察 |
| 4.3.6 细胞内端粒酶活性分析的条件优化 |
| 4.3.7 不同细胞内端粒酶活性分析 |
| 4.3.8 端粒酶抑制剂的筛选 |
| 4.3.9 纳米载体的载药量考察 |
| 4.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 博士期间发表论文 |
| 附录 |
| 附件 |
（10）基于网络药理学方法研究附子理中汤治疗晚期胃癌的作用机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 1 文献研究 |
| 1.1 中医病因病机 |
| 1.2 西医发病机制 |
| 1.3 晚期胃癌的中西医治疗概述 |
| 1.4 附子理中汤对晚期胃癌的作用 |
| 2 数据分析与成果讨论 |
| 2.1 资料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 晚期胃癌的中西医治疗进展 |
| 1 中西医对晚期胃癌的认识 |
| 1.1 中医病因病机 |
| 1.2 西医发病机制 |
| 2 中西医治疗晚期胃癌 |
| 2.1 中医治疗 |
| 2.2 西医治疗 |
| 2.3 中西医联合治疗 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、恶性肿瘤与端粒 端粒酶相关关系的研究进展（论文参考文献）
- [1]端粒长度与端粒酶：环境致癌物接触的早期生物标志物[J]. 刘宇,胡贵平,贾光. 中国职业医学, 2021
- [2]人端粒酶逆转录酶hTERT鉴别乳腺良恶性肿瘤的Meta分析[D]. 唐铃丰. 重庆医科大学, 2021(01)
- [3]免疫调节和雄激素在IPF中的作用及吡非尼酮的临床安全性评估[D]. 方楚玲. 北京协和医学院, 2021(02)
- [4]外周血白细胞端粒长度与端粒酶活性对非小细胞肺癌患者预后的影响[D]. 刘德豪. 承德医学院, 2021(01)
- [5]端粒与端粒酶研究在肺癌中的临床应用前景与挑战[J]. 韩森,马旭,方健. 中国肺癌杂志, 2021(01)
- [6]基于新型无酶生物传感体系的端粒酶及miRNA检测成像技术的研究[D]. 孟凡渝. 中国科学技术大学, 2020(01)
- [7]肾细胞癌组织中hTERT启动子甲基化水平与其临床病理意义[D]. 郑建波. 山东大学, 2020(01)
- [8]功能核酸在恶性肿瘤诊疗中的应用研究[D]. 白华荣. 湖南大学, 2020(02)
- [9]新型核酸纳米载体的设计及在肿瘤细胞成像和药物递送中的应用研究[D]. 刘晓亭. 山东大学, 2020(08)
- [10]基于网络药理学方法研究附子理中汤治疗晚期胃癌的作用机制[D]. 熊佳惠. 广西中医药大学, 2020(02)