一、红霉素的结构改造（论文文献综述）
刘兰兰[1]（2021）在《红霉素生物合成调控因子SACE＿1409的功能研究》文中提出糖多孢红霉菌产生的次级代谢产物—红霉素,是一种对革兰氏阳性菌有强大抗菌作用的大环内酯类抗生素,基因工程改造红霉素高产菌株是提高其产量的重要途径之一,其中通过调控因子的改造可有效提高红霉素的发酵产率。本实验室在糖多孢红霉菌中组合改造Tet R家族转录调控因子（Tet R-family transcriptional regulators,TFRs）时发现,敲除SACE＿3986或过表达SACE＿7301,均可提高红霉素产量,然而二者组合改造后红霉素产量不升反降,表明这两种TFRs间具有负协同效应。基于转录组分析等实验,已鉴定出它们共同效应靶基因SACE＿1409,也编码一种TFR,但其在糖多孢红霉菌中的调控机理有待深入研究。为了确定SACE＿1409是否与红霉素的生物合成有关,利用染色体片段同源重组技术,在A226中构建了SACE＿1409基因缺失的突变株ΔSACE＿1409,研究发现ΔSACE＿1409的红霉素A产量较A226提高52.35%。进一步在ΔSACE＿1409中回补SACE＿1409后,发现红霉素A产量可以回复至A226水平,而缺失SACE＿1409并不影响糖多孢红霉菌形态分化和菌体生长。这些结果表明,SACE＿1409与红霉素产量呈负相关。为了揭示SACE＿1409对红霉素生物合成的调控机制,通过荧光定量PCR技术（Real-time quantitative PCR,q RT-PCR）分别比较A226和ΔSACE＿1409在培养24 h与48 h时的红霉素合成基因簇的转录水平。结果显示,相比于A226,ΔSACE＿1409中红霉素生物合成的结构基因ery A1、ery CI、ery BI、ery BIII、ery BIV、ery K、ery BVI和抗性基因erm E的转录水平均有不同程度的上调。进一步利用凝胶迁移实验（Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA）探究SACE＿1409对红霉素合成基因簇的调控模式,结果发现SACE＿1409蛋白可特异性结合红霉素合成基因簇内所有的启动子区域,这表明SACE＿1409直接抑制红霉素的生物合成。为了探究SACE＿1409是否调控邻近基因SACE＿1408（Ara C家族转录调控因子）的转录,通过q RT-PCR和EMSA分析发现SACE＿1409直接抑制SACE＿1408的转录表达。进而构建了SACE＿1408基因的缺失突变株ΔSACE＿1408,发酵结果显示其红霉素A产量较A226下降80.29%,SACE＿1408可能是正向调控红霉素生物合成的因子。以上结果表明,SACE＿1409可通过直接抑制红霉素合成基因簇以及邻近基因SACE＿1408的转录表达,负调控红霉素的生物合成。先前已发现SACE＿1409直接受到SACE＿7301的转录抑制,本论文进一步研究了SACE＿1409对SACE＿7301的调控作用。q RT-PCR分析显示,SACE＿1409缺失并不影响SACE＿7301的转录,同时EMSA分析发现SACE＿1409也不能结合SACE＿7301的启动子区域,表明SACE＿1409并不能转录调控SACE＿7301。为了从遗传水平研究SACE＿1409和SACE＿7301对红霉素产量的协同效应,在ΔSACE＿1409中过表达p SET152-3×7301,结果显示,与ΔSACE＿1409相比,ΔSACE＿1409/p SET152-3×7301中红霉素A产量上升了25.69%,红霉素合成基因簇内基因转录水平也有明显提高。由此可见,SACE＿1409是SACE＿7301的下游调控因子之一,且它们的组合改造对红霉素生物合成具有增效的协同作用。先前已发现SACE＿1409间接受到SACE＿3986的转录抑制,本论文进一步研究了SACE＿1409对SACE＿3986的调控作用。通过q RT-PCR和EMSA分析结果表明SACE＿1409直接负调控SACE＿3986基因表达。进一步从遗传水平研究了SACE＿1409和SACE＿3986对红霉素产量的协同效应,在ΔSACE＿1409中抑制SACE＿3986基因,发现ΔSACE＿1409/p SETd Cas9-3986较ΔSACE＿1409红霉素A产量上升了51.25%,说明二者的组合改造对红霉素的产量具有增效调控效应。由此可见,SACE＿1409与SACE＿3986能够相互调控,且它们组合改造后对红霉素产量具有增效的协同作用。基于以上研究,在红霉素高产菌株WB中初步构建了其中两个TFRs组合改造的突变株,即在WBΔ1409的基础上过表达p SET152-3×7301,所获得的菌株WBΔ1409/p SET152-3×7301,其红霉素A产量较WB和WBΔ1409分别提高了34.07%和12.14%,说明二者组合改造的增效作用在红霉素高产菌株中也同样适用。综上所述,本论文研究了SACE＿1409对红霉素生物合成的影响及其机制,特别是分别揭示了其与SACE＿7301和SACE＿3986的协同调控关系,并进行了基于SACE＿1409的红霉素高产菌株遗传改造。本研究为深入认识红霉素生物合成调控因子间的协同调控作用奠定基础,有助于通过系统改造糖多孢红霉菌调控元件进一步提高红霉素产量和产率。
秦银辉[2]（2020）在《新型N-11,C-12,C-13和C-9位芳烷基克拉霉素半合成衍生物的设计、合成及生物活性评价》文中提出大环内酯类抗生素通常是以14～16元内酯环为母核,在母核的不同位置连接着甲基、乙基、羟基、羰基和糖基等各种取代基,是一种性质比较稳定的弱碱性物质。大环内酯类抗生素不但对各种敏感菌和耐药菌表现出优异的体内和体外抗菌作用,而且还具有良好的药代动力学性质,如生物利用度高、血药浓度高、达峰时间短、半衰期长等。因此大环内酯类抗生素是目前临床上最常用的抗生素之一,它们主要用于治疗金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌等革兰阳性菌引起的各种感染。大环内酯类抗生素的结合位点位于细菌核糖体的23S rRNA中,可以和此处的G2057、A2058、A2059、G2505、A2062和U790等碱基发生结合并堵塞新生肽释放通道,同时促进短酰基肽tRNA与核糖体的解离,使肽链的延长过程终止,从而抑制细菌蛋白质合成,最终使大环内酯类抗生素表现出抗菌活性。大环内酯类抗生素的耐药性通常是由结合位点修饰或突变、主动外排和酶灭活产生的,23S rRNA甲基化修饰、核糖体RNA突变、核糖体蛋白质变异、细菌外排泵的主动外排和基于酶机制的耐药是大环内酯类抗生素最常见的几种耐药机制。自从第一个大环内酯类抗生素苦霉素于1950年发现以来,大环内酯类抗生素的发展已经历经了四代。第一代到第四代大环内酯类抗生素的发展历程表明:（1）从最初的体内酸不稳定性,副作用大（如红霉素）发展到具有优良的药代动力学性质,如体内稳定性好、生物利用度高、组织浓度高和半衰期长等（如克拉霉素和阿奇霉素）;（2）从最初的抗菌谱窄,抗耐药菌活性差（如红霉素、克拉霉素和阿奇霉素等）发展到对各种呼吸道病原体的抗菌活性越来越强,尤其对于erm基因介导的MLSB型和mef基因介导的M型耐药菌表现出强烈的抗菌作用（如泰利霉素、喹红霉素和索利霉素）。以上取得的巨大进步和成功为有效缓解细菌耐药性问题带来了希望。大环内酯类抗生素的研发历程表明得到新型大环内酯母核和引入芳烷基侧链的结构改造是研发出新型抗菌药的主要途径和方法。我们基于“片段切割和结合”的设计策略,首先将克拉霉素的14元内酯环通过氧化反应开环,接着引入适当的芳烷基侧链,最后经酯化反应重新构建新型15元内酯环。我们得到的新型15元内酯环母核,其立体构象会发生一定程度的变化以有利于与细菌核糖体的结合。各种芳烷基侧链也可以灵活的引入到内酯环上,它们可以与细菌核糖体23S rRNA结构域Ⅱ发生结合。因此,我们设计、合成了 5个系列共计103个N-11,C-12,C-13和C-9位芳烷基克拉霉素半合成衍生物,并对它们的抗菌活性、杀菌活性、杀菌动力学和细胞毒性进行了测定和评价。我们使用肉汤微量稀释法测定A、B、C、D和E系列化合物的最低抑菌浓度（MIC）,以克拉霉素和阿奇霉素作为对照,对它们的抗菌活性进行评价,结果如下所示:1.抗敏感菌活性:对于敏感型S.aureus3,ATCC2592C和D系列化合物表现出优异的抗菌活性,其中化合物49b、491和49v（属于D系列）表现出最强的抗菌活性（MIC≤0.25μg/mL）,与克拉霉素相当（MIC≤0.25μg/mL）;对于B.subtilis ATCC9372,A、C和D系列化合物表现出极强的抗菌活性,其中C系列化合物中的36g、36h和36j（MIC ≤ 0.25 μg/mL）和D系列化合物中的49b、49d、49f、491和49v（MIC≤0.25μg/mL）表现出最强的抗菌活性,与克拉霉素（MIC≤0.25 μg/mL）相当;对于E.coli ATCC25922和P.aeruginosa ATCC27853,所有的目标化合物和克拉霉素均表现出较弱的抗菌活性。综上所述,化合物49b、491和49v在所有的目标化合物中表现出最强的抗菌作用,对于敏感型S.aureus ATCC25923 和 B.subtilis ATCC9372表现出优异的抗菌活性（MIC≤0.25 μg/mL）。此外,对于E.coli ATCC25922和P.aeruginosa ATCC27853,这三个化合物的抗菌活性与克拉霉素相比也表现出一定的提高。2.抗耐药菌活性:A、B、C和D系列化合物中均有多个化合物对耐药菌表现出强烈的抗菌作用。对于耐药型P.aureus ATCC3 1007,A系列化合物中的11g（MIC=4 μg/mL）表现出最强抗菌活性,比克拉霉素（MIC>256μg/mL）提高了 64 倍;对于耐药型S.aureus ATCC43300,化合物 11g（MIC=4μg/mL）和 B系列化合物中的20m（MIC=4μg/mL）抗菌作用最强,比克拉霉素（MIC>256μg/mL）提高了 64倍;对于ermB耐药型S.pneumoniaeB1,A系列化合物中的11d、11f 和 11g（MIC=8 μg/mL）、B 系列化合物中的 20m 和 20n（MIC=8μg/mL）和C系列化合物中的36m和36n（MIC=8 μg/mL）具有最强的抗菌活性,比克拉霉素（MIC>256 μg/mL）提高了 32倍;对于mefA+ermB耐药型S.pneumoniae AB11,化合物 11g（MIC=4μg/mL）和 36m（MIC=4μg/mL）具有最强的抗菌活性,比克拉霉素（MIC=128μg/mL）提高了 32倍;对于耐药型S.pyogenes 1,A系列化合物中的11e-g（MIC=8 μg/mL）、B系列化合物中的20m和 20n（MIC=8μg/mL）和 C 系列化合物中的 36k、36m 和 36n（MIC=8 μg/mL）表现出最强的抗菌活性,其活性比克拉霉素（MIC=256 μg/mL）提高了 32倍。综上所述,化合物 11f、11g、20m、20n、36m 和 36n 对于耐药型S.aureus ATCC31007、耐药型S.aureus ATCC43300、ermB 耐药型S.pneumoniae B 1、mefA+ermB 耐药型S.pneumoniae AB11和耐药型S.pyogenes 1均表现出强力和均衡的抗菌活性（MIC=4～8 μg/mL）,具有抗菌谱广的优点。根据以上抗菌活性结果,我们对A-E系列化合物的构效关系总结如下:（1）芳烷基侧链连接在15元内酯环的C-13位对提高目标化合物的抗敏感菌活性效果最好,N-11位次之,C-12位最差;（2）增加芳烷基侧链和15元内酯环之间的距离可以提高目标化合物的抗敏感菌活性;（3）与目标化合物相比,克拉霉素对耐药菌几乎没有活性,说明芳烷基侧链是提高目标化合物抗耐药菌活性的必需基团;（4）芳烷基侧链在内酯环的连接位置会使A-E系列化合物表现出活性差别。当芳烷基侧链连接在N-11、C-12或C-13位时,这有利于提高目标化合物的抗耐药菌活性。但是当连接在C-9位时对耐药菌的活性基本丧失;（5）当芳烷基侧链末端连接的基团是给电子基、吸电子基或无取代基时,以给电子基中的烷基对提高化合物的抗耐药菌活性贡献最大。同时烷基链越长,抗耐药菌活性越强,当达到5个碳原子长度时,抗耐药菌活性最强。我们选择A系列化合物中的11f和11g、B系列化合物中的20m和20n、C系列化合物中的36k、36m和36n和D系列化合物中的49g,测定它们对mefA+ermB耐药型S.pneumoniae AB11的最低杀菌浓度（MBC）。研究表明它们均是通过抑制细菌的生长而发挥抗菌活性。此外,还测定了 C系列化合物中的36g、36h和36j和D系列化合物中的49b、491和49v对敏感型S.aureus ATCC25923的MBC值。研究结果表明它们也是通过抑菌机制发挥抗菌作用。为了进一步了解它们的杀菌动力学性质,我们绘制了化合物11g和36k对mefA+ermB耐药型S.pneumoniae AB11的时间杀菌曲线。研究结果表明化合物11g在高于或等于1 MIC浓度时,0-12小时表现出一定程度的杀菌作用,并且具有浓度和时间依赖性,在12-24小时则表现出优良的抑菌作用。同样,化合物36k也表现出与11g类似的杀菌动力学性质。综上所述,所测试的化合物均是优良的抑菌剂。选择C系列化合物中的36g、36h和36j和D系列化合物中的49b、491和49v,以克拉霉素作为对照,使用MTT法测定了它们对人乳腺癌细胞MCF-7的毒性。研究结果表明上述化合物对敏感型S.aureus ATCC25923和B.subtilis ATCC9372的抗菌活性是有效的,可以排除毒性因素。对四代大环内酯类抗生素的研发历程的充分认识,其作用机制和耐药机制的深刻理解,以及对其结构修饰和活性之间关系的精准把握,这些均为我们采用“片段切割和结合”设计策略奠定了坚实的基础。我们以克拉霉素为原料,以改变大环内酯母核结构和引入芳烷基侧链等设计策略,设计、合成了 5个系列的新型N-11,C-12,C-13和C-9位芳烷基克拉霉素半合成衍生物。在抗菌活性评价中发现多个具有优良抗菌活性的化合物,例如化合物11g（MIC=4μg/mL）对mefA+ermB耐药型S.pneumoniae AB11的抗菌活性显着,明显优于克拉霉素（MIC=128μg/mL）,可作为先导化合物进一步研究。在此基础上,我们对所有目标化合物进行了合理的构效关系分析和总结,发现了内酯环、芳烷基侧链类型、芳烷基侧链在内酯环上的连接位置和连接位置手性碳的构型与抗菌活性之间的相互关系,为进一步的结构优化提供了理论依据。因此,上述研究结果有助于今后发现更多具有全新结构类型的大环内酯类衍生物以应对日益严重的细菌耐药性问题。
刘永[3]（2019）在《应用CRISR-Cas9在红色糖多孢菌进行基因编辑重构生物合成基因簇的研究》文中进行了进一步梳理红霉素A（Erythromycin A,ErA）是红色糖多孢菌在次级代谢过程中合成产生的一类大环内酯类抗生素,具有日益增长的临床应用需求。因此,利用基因工程技术改造宿主菌,获得高产菌株,提高其工业产量仍是其研究的重中之重。随着新型基因组编辑技术的发展,改造合成基因簇、调控基因表达等干扰策略越来越受到研究人员的重视。红色糖多孢菌属于高GC含量的放线菌,基于传统的同源双交换原理的基因编辑技术效率低、操作周期长,严重限制了红色糖多孢菌基因改造的进程。对于红霉素A等次级代谢产物产量的提高则需要一种更为高效的基因编辑工具。CRISPR-Cas9系统广泛应用于许多物种的基因编辑,在放线菌属的天蓝色链霉菌中已经有基于CRISPR-Cas9的基因编辑技术,但是红色糖多孢菌中缺乏有效的CRISPR-Cas9编辑工具。本研究应用CRISPR-Cas9高效基因编辑系统对红色糖多孢菌进行基因工程改造,包括敲入组成型强启动子、定点整合增加前体合成的酶,CRISPRi优化代谢流,构建并筛选得到红霉素A高产工业菌株。本研究率先开发了应用于红色糖多孢菌的CRISPR-Cas9基因编辑技术。主要研究内容如下:应用CRISPR-Cas9系统编辑红色糖多孢菌基因组。温敏性质粒骨架上构建PermE启动子驱动的Cas9表达模块;并用Pj23119和PkasO启动子驱动sgRNA的转录,构建由特定sgRNA引导的靶向性CRISPR-Cas9编辑系统。结果表明,应用CRISPR-Cas9基因编辑系统,由单一sgRNA引导的编辑效率为13%,利用双sgRNA靶向的编辑效率提高到65%,并成功应用于无痕敲除indA（SACE1229）。在工业菌株Ab（HP）中敲除SACE1765,使得红霉素产量提高了 12.7%。利用此技术,通过在SACE0712敲入PermE-Flag-egfp,激活了野生菌中的红霉素生物合成基因簇中的部分基因,使得红霉素产量增加了 80.3%。双向启动子Pj23119-PkasO敲入提高红霉素产量。通过mCherry报告基因系统检测红霉素生物合成基因簇的启动子强度,选取SACE0720（eryBIV）-SACE0721（eryAI）间隔区作为靶标调控区域,在Ab（HP）中利用CRISPR-Cas9双sgRNA方法敲入组合的双向启动子Pj23119-PkasO,显着增强红霉素生物合成基因eryBIV和eryAI的转录水平（基因转录水平分别提高了32和79倍）,激活了红霉素生物合成基因簇。该重组菌株的红霉素产量随之提高了 58.3%。CRISPRi技术干扰基因表达。选择aceA和sdhA作为靶点,利用定点突变的dCas9构建的CRISPRi技术抑制靶基因的表达,结合温度调控sdhA的抑制强度,使得红霉素产量进一步增加了15.1%。应用CRISPR-Cas9在红色糖多孢菌中重构生物合成基因簇。利用双sgRNA靶向敲除红霉素工业高产菌Ab（HP）中的红霉素合成基因簇（ery BGC,49491 bp）,得到AbΔery菌株。该菌株具有提供甲基丙二酰辅酶A和丙酰辅酶A的潜力,有助于将红色糖多孢菌改造为以甲基丙二酰辅酶A和丙酰辅酶A为前体的其他次级代谢产物异源合成的底盘细胞。本研究构建了有效的红色糖多孢菌的CRISPR-Cas9基因编辑技术。基于温敏性质粒的基因编辑框架,有利于多个基因重复多次的遗传操作;基于CRISPR-Cas9的基因组编辑系统,利用双sgRNA靶向、插入双向强启动子等策略,成功通过红色糖多孢菌的基因编辑和优化改造,提高了红霉素的产量。利用CRISPR-Cas9系统敲除红霉素生物合成基因簇,构建的底盘菌株,具有应用于异源合成甲基丙二酰辅酶A和丙酰辅酶A等为前体的重要次级代谢产物的潜力。
刘丽星[4]（2018）在《阿奇霉素的合成工艺研究》文中研究说明阿奇霉素是第一个含氮杂原子的15元大环内酯类抗生素,是红霉素二代衍生物的典型代表。具有独特的药代动力学性质和广谱抗菌活性,广泛应用于临床。通过查阅、分析相关文献,确定了阿奇霉素的合成路线,并对其关键步骤进行改进,探索出一条操作简单的工艺路线。以硫氰酸红霉素为原料,经过肟化、贝克曼重排制得红霉素A6,9-亚胺醚（中间体-2）;经还原、水解得到9-脱氧-9a-氮杂-9a-高红霉素关键中间体（中间体-3）;再通过与甲酸,甲醛甲基化得阿奇霉素,反应总收率为55%～60%,纯度为98%以上。重排反应过程中直接以硫氰酸红霉素肟为原料,在丙酮-水体系中0～5℃与对甲苯磺酰氯反应制备红霉素6,9-亚胺醚,操作简单,收率为85%左右。0～5℃,红霉素6,9-亚胺醚经硼氢化钾在p H为6.0～9.0范围内还原,连续多次酸解,中和制备9-脱氧-9a-氮杂-9a-高红霉素。提高了还原剂利用率,控制了硼酸酯的逆反应,减少不必要的分离过程,得到高质量的9-脱氧-9a-氮杂-9a-高红霉素可直接用于制备阿奇霉素。此外,本论文剖析了药典中有关物质的来源,合成了工艺过程中可能出现的杂质,为阿奇霉素的质量控制提供依据。所得中间体,产品的结构均经过核磁共振1H NMR和HPLC确证,阿奇霉素纯度符合欧洲药典EP8.0的标准,产品为稳定的药用阿奇霉素二水合物晶体。
洪铭[5]（2017）在《13C标记实验辅助的红霉素工业生产菌代谢机制分析》文中认为红霉素是一种重要的的大环内酯类广谱抗生素,它具有重要的应用价值。红色糖多孢菌是红霉素的主要工业生产菌。尽管红色糖多孢菌的基因组测序已经完成,在菌株基因改造和发酵过程培养工艺优化等方面开展了大量研究,但由于对红色糖多孢菌胞内代谢机制的了解不清楚,造成基因改造与发酵工艺优化相互脱节。新构建的菌株,往往需要从头开始优化培养工艺。在优化过程中发现的线索,又难以直接用于指导下一轮的基因改造。这些问题的存在,导致难于高效提高红霉素产量。本论文首先建立了适用于红色糖多孢菌代谢研究的13C分析平台,包括代谢模型的构建、胞内代谢物可靠获取方法、胞内代谢物浓度及同位素丰度精确分析方法。然后利用该分析平台,初步探讨了添加脯氨酸对红色糖多孢菌代谢的影响,深入分析了正丙醇的代谢机制,找出有可能提高红霉素产量的基因改造靶点,并通过新菌株的构建,验证了基因改造靶点的有效性。首先,建立了红色糖多孢菌代谢物组分析方法。比较并验证了各种胞内代谢物的提取方法的有效性,并通过对红霉素发酵过程中的胞内代谢物浓度的变化进行分析,发现了红霉素合成与胞内代谢物浓度之间的关系。研究结果表明液氮研磨法适合于胞内辅酶A类物质和磷酸糖的提取;沸乙醇法适合于胞内有机酸的提取。胞内代谢浓度分析的结果表明,S.erythraea在从生长期进入稳定期的过程中,TCA循环和EMP的途径的活力都在下降。比红霉素A合成速率与高甲基丙二酰辅酶A和丙酰辅酶A以及许多其它代谢物的浓度是正相关的。丙酰辅酶A的浓度下降是影响红霉素合成的重要原因。此研究使得研究人员可以对S.erythraea在工业发酵过程中的代谢特点进行定量分析。其次,建立并验证了红色糖多孢菌胞内代谢物13C同位素信息分析平台。根据无干扰和信号强的原则挑选出了合适于分析氨基酸13C同位素信息的GC-MS碎片,从而得到可靠的氨基酸同位素信息分析方法。一对多法适合于有机酸同位素信息测定。采用一对一法测定得到的磷酸糖标准品的同位素信息与理论值非常接近,说明磷酸糖测定方法是可靠的。辅酶A类物质标准品同位素信息测定结果表明,一对多法有更高的准确度,而单级SIM（single ion monitoring）法有更好的灵敏度,且两种方法测定结果与理论值都很接近。20%[U-13C]glucose标记实验中,氨基酸、有机酸、磷酸糖和辅酶A的相关方法测定得到的同位素标记信息与理论值都很接近,该结果验证了所构建的同位素信息测定方法在红色糖多孢菌中的有效性。再次,构建用于S.erythraea的13C标记实验方法、平台。包括构建S.erytraea的核心碳代谢网络、代谢反应的原子迁移式、细胞合成反应以及一些代谢物的同位素信息分析方法。通过上述平台的构建,我们对葡萄糖和脯氨酸的胞内代谢进行了定量分析。我们发现葡萄糖ED途径代替了 EMP途径进行葡萄糖代谢。13C代谢通量分析的结果表明培养基中添加脯氨酸后,胞内代谢通量分布发生较大变化,最终降低了菌体代谢负担,促进菌体生长。接着,利用13C标记实验平台找到了工业发酵过程中正丙醇氧化代谢的通路,并对关键靶点进行代谢改造,最终使得红霉素的产量提高了 47%。正丙醇在代谢网络中可能通过两条途径（途径Ⅰ和途径Ⅱ）进行氧化分解代谢。利用[1-13C]丙酸钠进行同位素标记实验,结果表明正丙醇的碳骨架可以通过途径Ⅰ进入TCA循环进行氧化分解代谢,而由于缺乏丙二酰辅酶A脱羧酶的活性,正丙醇不能通过途径Ⅱ进行氧化分解代谢。通过对两个关键靶点（mutB和sucC）的基因敲除都能阻断正丙醇通过途径Ⅰ进行的分解代谢,并且不影响红霉素的合成。对工业菌株S.erythraea E3的相关靶点进行敲除成功构建出工程菌S.erythraea E3-AmutB和S.erythraea E3-AsucC。在摇瓶中,S.erythraeaE3-△mutB的和S.erythraea E3-AsucC的红霉素产量分别是原始菌株的2.23倍和1.25倍。构建的基因工程菌S.erythraea E3-AmutB的和S.erythraeaE3-AsucC的红霉素对正丙醇得率也由原始菌株的0.22分别提高到了 0.48和0.27（g/g）。这些结果说明S.erythraeaE3-AmutB更适合于红霉素的生产。胞内代谢通量分析的结果表明S.erythraea E3-△mutB中代谢反应“甲基丙二酰辅酶A→琥珀酰辅酶A”并未完全终止,而正丙醇向TCA循环转化率从原始菌株的73.1%下降到了 29.8%。本论文在工业菌株的基础上构建的工程菌有望在工业规模提高红霉素的产量和正丙醇的转化率,从而提高工业生产红霉素的效率并降低成本,提高中国红霉素产业的竞争力。最后,采用高通量实验方法和氮磷调控策略设计并系统优化了用于红霉素高效合成的合成培养基。根据菌体生长和红霉素合成的可能需求,设计的初始培养基中含有38种物质。采用高通量实验方法进行单组分删除实验和Plackett-Burman实验将组分数量减少一半,并对各组分浓度进行优化。然后,在5L发酵罐水平上通过对菌体生长的规律进行分析,发现了菌体的二次生长现象,以及不同氨基酸的选择性消耗的时序规律。通过氮磷调控策略,将氨基酸组分再次减少,并得到了最佳的初始磷浓度。最终优化出的合成培养基中红霉素的效价为1380mg/L,比过去研究红色糖多孢菌所采用的合成培养基提高了 17倍,为进一步深入阐述红霉素的代谢机理打下了良好基础。
田竞超[6]（2017）在《新型抗耐药菌红霉素的设计和合成》文中研究指明大环内酯类药物广泛应用于治疗临床上的重度感染疾病,伴随着其在临床上的广泛应用,细菌耐药性问题日益严重。因此,对大环内酯类抗生素的位点修饰,再更深入的研究核糖体与大环内酯的作用机制上,找到新的作用靶标或作用靶标,已经是众多科学研究工作者的研究重点。本课题组根据以往的构效关系,设计了一系列化合物,并初次涉及了有关喹诺酮类的反应,为以后的课题研究提供了新的思路和方向。论文中设计的化合物的化学修饰的位点主要在C-2位,C-3位,C-6位,C-9位和C-11,12位,其中C-11和C-12位主要为碳酸酯五元环。为了研究偶联含氨基的的芳香基团修饰对大环内酯的影响,结合C-2位的氟化,设计了2-F酮内酯化合物9。为了研究C-3位差向以及位于细菌核糖体中多个结合位点的相互作用对抗菌活性的影响。设计了C-3位差向酰内酯和C-9位连接芳香侧链形成“双靶点”结合模式的化合物11和C-3位差向酰内酯和C-6位连接芳香侧链形成“双靶点”结合模式的化合物19。同时还设计了C-6位和C-9形成“双靶点”结合模式的化合物。C-3位进行氟喹诺酮修饰时具有较好活性,设计了C-3位连接氟喹诺酮,并对C-9位进行结构修饰,期望筛选出具有较好抗菌活性的化合物。路线中的重要中间体7和25合成采用了不同于以往的合成路线,新的路线减少了反应步骤,提高了产率,由大约42%提高到52%-56%。合成路线中还涉及了无水要求极高的反应和化合物极性较大的化合物的分离,为以后类似实验提供了理论指导。已进行的活性测试的化合物结果显示,结构上含有2-F和C-9位含氨基吡啶的化合物9对肺炎链球菌,金黄色葡萄球菌,化脓链球菌,卡他莫拉菌和流血嗜血杆菌均表现出较为突出的抗菌活性。化合物11和19的抗菌活性低于克拉霉素和泰利霉素,尽管其在结构上形成了2-F、3-epi-OR和C-6位的双侧链结构或3-epi-OR和C-9位的双侧链结构。因此可推测出C-3的差相有损于抗菌活性。
汪淑文[7]（2017）在《聚酮类化合物红霉素及抗霉素的碳骨架改造研究》文中进行了进一步梳理由微生物和植物产生的聚酮类化合物种类繁多,数目庞大,是一大类生物活性优良的天然产物,目前已经成为新药开发的重要来源。其特殊的化学结构和生物合成机制,为合理化修饰生物合成途径获得结构类似物以及建立天然产物类似物库奠定了遗传和生物化学基础。红霉素是临床上广泛使用的用于治疗革兰氏阳性细菌感染的大环内酯类抗生素。其致敏性低,成药性好等特点使得它在临床抗菌药物中占据了极其重要的地位,由于红霉素复杂的化学结构和在利用化学修饰进行结构改造上的局限性,基于生物合成途径改造的组合生物合成方法已经成为目前对红霉素进行结构改造获得新型红霉素衍生物最为有效的方法。本文以红霉素高产菌S.erythraea HL3168为研究对象,以通过AT置换向红霉素聚酮碳骨架中引入新型侧链为目的,探索了通过PEG介导的原生质体转化、接合转移向该株红霉素高产菌中转入外源基因的可能性。最终建立了该高产菌稳定的遗传操作系统。并以此为基础利用CRISPR/Cas9技术介导的基因编辑构建得到了 eryAⅢ基因缺失的突变株。此外,通过对其基因文库的构建和后期筛选修复得到了包含有6-dEB生物合成基因簇的粘粒,并在该粘粒上添加了 AntEV350G以提高CCR的选择性,通过回补实验证实了该粘粒的完整性,在此基础上,将来源于聚酮化合物Splenocin（SPN）生物合成基因簇中具有宽泛底物选择性的SpnD-AT模块通过置换引入红霉素的生物合成途径中,结合AT与上下游两侧linker区域的相互作用,通过打靶构建了包含四种不同置换区域的粘粒:1)只置换AT结构域;2)置换上游linker区域（KS-AT linker）、AT 以及下游 linker 区域（ATPost-linker）;3)置换上游 linker区域（KS-AT linker）和 AT;4)置换 AT 和下游 linker 区域（AT Post-linker）。将其导入eryAⅢ基因缺失的突变株构建四种置换突变株,通过后续喂养实验希望向红霉素结构中引入不同的活泼官能团或芳香环侧链,对红霉素碳骨架进行结构改造获得一系列具有活泼官能团的新型化合物。通过最终产生衍生物的效率来确定最佳的置换方式,并以此为基础建立科学的AT置换理论。天然抗霉素（Antimycin,ANT）是通过聚酮合酶和非核糖体肽聚酶的杂合体系合成的,具有显着的生物活性。在本课题组前期对抗霉素的研究中发现了首例来源于苯丙氨酸的芳香性延伸单元并阐明了其生物合成机制,本课题以抗霉素原始产生菌Streptomyces sp.NRRL 2288为研究对象,借助前期的工作基础,以进一步的发展其它氨基酸引入聚酮碳骨架中的新方法为目的,通过对其β-氧化途径的阻断构建了烯酯酰水合酶（fadB）缺失的突变株,在此基础上,通过喂养5-氯戊酸发现目的产物氯丙基取代的Antimycin类似物的产量有明显提高。进一步证实了在阻断了 β-氧化途径的体系中,5-氯戊酸形成α,β-不饱和的酰基辅酶A后无法在进行后续的降解,有利于被CCR蛋白识别转化成相应的延伸单元。同时还初步尝试了喂养赖氨酸,鸟氨酸,甲硫氨酸相应的氧化脱羧降解产物。这为后续构建Ligase和烯醇还原酶基因强化表达的重组菌株提供了基础,也为基于AntE的晶体结构对其催化活性进行优化,针对一些没有活性或活性欠佳的底物对AntE进行定向改造以获得催化活性提高的突变蛋白提供了指导。
芦晨阳[8]（2016）在《井冈霉素和盐霉素的高产机理与改造》文中进行了进一步梳理微生物的次级代谢产物一般在细胞指数生长后期或者稳定期开始合成,它们具有多种生物活性,在医疗健康、农牧业生产等领域发挥着重要作用。负责细胞生长的初级代谢和负责代谢产物合成的次级代谢之间存在密切关系,次级代谢所需的前体、能量和还原力来源于初级代谢,而初级代谢本身同样会消耗这些前体、能量和还原力用于细胞生长。以多组学的数据分析为基础,阐明抗生素的高产机理,弱化初级代谢途径,削弱或减缓细胞生长速率,缩短次级代谢产物的发酵周期,全面提高次级代谢产物的产量是本论文研究的重点。第一部分“弱化初级代谢提高抗生素产量”的改造策略井冈霉素是应用范围最广的农用抗生素之一,主要用来防治水稻纹枯病,同时也是治疗Ⅱ型糖尿病的药物阿卡波糖和伏格列波糖的合成前体,具有很高的经济附加值。通过对井冈霉素产生菌吸水链霉菌井冈变种5008（Streptomyces hygroscopicus var.jinggangensis 5008）（产量3-5 g/L）及其衍生的高产菌株TL01（产量20-30 g/L）的比较基因组学分析,我们旨在阐明井冈霉素的高产机理,进而指导其产量的进一步提升。5008和TL01全基因组精细图谱的分析发现,TL01中存在总计300 kb的三个大片段区域的缺失,每个区域的单独缺失对产量提高均有贡献,而组合缺失突变株产量达到TL01的80%,是井冈霉素高产的关键因素。而随着井冈霉素产量的逐步提高,菌体生物量却表现出逐渐下降的趋势,暗示生物量和井冈霉素产量之间存在负相关。据此我们提出了“弱化初级代谢可以提高抗生素产量”的假说,推断大片段的缺失弱化了菌体的初级代谢,削弱或减缓了菌体的生长,将更多的代谢流用于井冈霉素的生物合成,促进井冈霉素产量的提高。基于此假说,我们对区域Det-I和Det-Ⅲ中的120个基因进行了排查,找到了参与初级代谢过程的结构基因和调控基因shjg115、shjg1601、shjg1609和shjg1617,它们的缺失使得产量均有不同程度的提高、生物量有不同程度的降低。此外,代谢组的数据分析发现,在6-磷酸葡萄糖节点上代谢流的分配进一步的趋向于磷酸戊糖途径（PPP）,而糖酵解途径（EMP）和三羧酸循环（TCA）中的碳流量下降,这进一步支持了我们提出的“弱化初级代谢可以提高抗生素产量”的假说。为了验证该假说的普适性,我们在红色糖多孢菌属、链霉菌属和小单胞菌属的抗生素产生菌中对糖酵解途径和三羧酸循环中多个催化步骤的同功基因进行了敲除,扰动初级代谢,减缓细胞生长,成功实现了红霉素A、林可霉素A和庆大霉素C组分产量的提高。此外,在阿维菌素高产菌株阿维链霉菌76-5中组合缺失柠檬酸合成酶基因、琥珀酰辅酶A合成酶基因和琥珀酸脱氢酶基因,突变株产量提高了0.77 g/L,增幅达到52%。但是进一步弱化初级代谢减少生物量,产量反而锐减,暗示着一定的生物量积累是抗生素高产的重要前提。另外,转录芯片数据分析发现线型质粒pSHJG1在TL01中整体呈现低表达趋势,推断pSHJG1与井冈霉素的合成没有正相关性,可以被进一步消除,降低产生菌基因组的复杂性。质粒消除突变株中井冈霉素及其前体效氧胺的产量均有大幅提高,但是生物量下降,而生物合成基因簇的转录量保持不变。随后我们在pSHJG1中确定了和初级代谢相关的结构基因,使用valA基因启动子在突变株中进行基因回补,发现基因pshjg1.69和pshjg1.72的回补使得井冈霉素产量和生物量均恢复到接近出发菌株的水平。无论是初级代谢的弱化还是线型质粒的消除,它们都能够弱化或者减缓细胞生长,进而促进抗生素产量的提高。由于放线菌初级代谢途径和细胞生长息息相关,而且相对大的基因组中普遍存在多个同功基因,因此弱化初级代谢以提高抗生素产量的策略更具有普适性。第二部分盐霉素产生菌基因组解析及定向高产改造盐霉素是聚醚类抗生素的典型代表,由于具有治疗鸡球虫病的活性,在畜牧业被广泛使用。最近发现它也具有潜在的杀灭肿瘤干细胞的活性。盐霉素发酵过程表现出很强的豆油利用偏好性,且产量会随着豆油浓度的提高而增加,工业发酵水平达到70 g/L以上。但是迄今为止,对其高产机理和豆油利用偏好性产生的原因尚不知晓。盐霉素产生菌白色链霉菌DSM 41398（Streptomyces albus DSM41398）的全基因组精细图谱由本实验室测定,其线型染色体全长8,384,669 bp,无线型质粒存在。和其他常见链霉菌基因组的比较分析发现,DSM 41398中参与脂代谢的基因比例和数量是最高的,与豆油分解和β氧化相关基因总数达到48个,且其中基因fadD、acd、paa、fadJ和fadA均表现出豆油诱导表达的现象;而与此相反,参与碳水化合物代谢的基因比例是最低的,这暗示着菌株具有内在的强化的脂代谢能力和弱化的糖代谢能力,与其特殊的豆油偏好性表型恰好吻合。除了盐霉素生物合成基因簇以外,DSM 41398的染色体中还存在其他9个I型PKS/PKS-NRPS生物合成基因簇,其中7个是活跃表达的,它们可能会和盐霉素生物合成竞争前体,不利于盐霉素的产生。对7个活跃表达的基因簇进行逐个敲除后发现,除了PKS-5,其他基因簇的中断都有助于盐霉素产量不同程度的提高,其中PKS-NRPS-2和PKS-6的缺失突变株产量提高最为显着,分别提高了8.5倍和2.67倍,但是它们的组合缺失突变株的产量却不能被进一步提升。通过LC-MS/MS进行了胞内辅酶A的定量分析,我们发现组合缺失突变株中,前体丙二酰辅酶A和甲基丙二酰辅酶A的浓度均比单独缺失突变株的高,但是乙基丙二酰辅酶A的浓度基本保持不变,由此成为产量进一步提高新的限制因素。通过超量表达了巴豆酰辅酶A还原酶基因ccr,我们有效提高了乙基丙二酰辅酶A的胞内浓度,并最终将组合缺失突变株的盐霉素产量提高至6.6 g/L,达到了出发菌株的10倍左右。在高产菌株中我们使用同样的检测手段和改造策略,也实现了盐霉素产量的进一步提升。综上所述,本论文通过基因组学、转录组学、代谢组学的手段,解析了井冈霉素和盐霉素的高产机理,并定向改造高产菌株,得到了产量进一步提高的衍生菌株。此外,本论文中提出的“弱化初级代谢提高抗生素产量”,“线型质粒消除”和“基于定量的前体工程改造”等策略可以为其他抗生素的高产改造提供一定的借鉴。
陈单丹,吴杰群,刘文[9]（2015）在《以生物合成为基础的红霉素A的产量提高和结构改造》文中研究说明红霉素A是一种广谱大环内酯类抗生素,在临床上应用广泛。其生物合成包括由聚酮合酶催化的十四元环骨架形成,以及羟基化、糖基化、甲基化后修饰。基于对红霉素A生物合成机制的认识,可以对产生菌种进行定向的遗传操作,达到产量提高和结构改造等目的。本文综述了近年来在红霉素A高产菌株改造和化学结构衍生方面所取得的研究进展,为相关研究人员提供参考。
陈勇[10]（2013）在《基于碳氮磷利用速率动态调控的红霉素基因工程菌发酵过程优化及红霉素微观代谢研究初步探索》文中进行了进一步梳理目前,我国红霉素发酵生产过程中存在红霉素发酵单位不高、有效组分红霉素A含量较低以及发酵液粘度高的问题,严重影响我国红霉素原料药在国际市场的竞争力,是红霉素生产亟待解决的问题。本课题以红霉素A组分优势的红霉素基因工程菌为对象,采用多尺度参数相关分析方法系统研究了红霉素发酵过程调控规律,在此基础上形成了基于碳氮磷动态调控的红霉素基因工程菌发酵优化策略,成功实现了同时降低发酵液粘度和有效提高红霉素A的目标。首先,采用新型速效有机氮源替代玉米浆,解决了红霉素工业生产中因玉米浆质量不稳定引起的产量波动的问题。优化后的发酵培养基在25吨罐规模下,红霉素产量比对照组提高了21.7%。发酵过程数据分析表明,新型速效有机氮源提高了胞外淀粉酶和蛋白酶的活力,增强了发酵过程的OUR水平。胞外氨基酸和有机酸数据表明采用新型速效有机氮源的胞外前体氨基酸（谷氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸和亮氨酸）浓度较高,而胞外有机酸（丙酮酸、丙酸、琥珀酸、柠檬酸和乙酸）浓度较低。菌丝形态和发酵液流变特性数据表明新型速效有机氮源刺激了菌丝的伸长进而引起发酵液稠度指数K的增加。其次,基于糖醇利用规律,建立了动态调控的红霉素基因工程菌发酵过程底物补加新工艺,并采用宏观代谢流定量计算方法分析了工业复合培养基下不同葡萄糖和正丙醇补加速率比例下的代谢流量分布。基于多参数相关性分析结果建立了依据RQ补糖和依据溶氧和残醇进行补醇的补加工艺,使红霉素产量提高了8.3%。进一步建立了基于总碳相等的动态调控葡萄糖和正丙醇补加速率的策略,红霉素产量达到了12491U/ml。宏观代谢流计算结果表明优化葡萄糖和正丙醇的比率可以提高红霉素合成前体丙酰-CoA（2.147 mmol/（g·day））和甲基丙二酰-CoA （1.708 mmol/（g·day））的代谢流量,进而增加流向红霉素的代谢流量。同时发现有45%-77%的正丙醇流向TCA循环,为同位素标记实验研究正丙醇代谢机制和代谢工程菌种改造提供了新的研究切入点。能量代谢分析表明,降低葡萄糖补加速率引起的较低ATP水平并没有限制红霉素的合成,而较高的NADPH则有利于红霉素的合成。再次,采用氮磷调控策略大幅度降低了发酵液粘度和葡萄糖消耗速率。通过控制硫酸铵的浓度使发酵液粘度和葡萄糖消耗速率分别降低了18.2%和61.6%,而红霉素的产量没有受到影响。通过理性调节磷酸盐、黄豆饼粉和硫酸铵的浓度使红霉素A产量提高了8.7%,实现了同时维持较低发酵液粘度和较低葡萄糖消耗速率的优势。初步阐明了高浓度铵离子通过抑制胞外蛋白酶活性来降低黄豆饼粉有机磷的释放,进而使铵离子缓慢利用的现象。表明菌体可以优先利用无机铵盐和无机磷而非有机氮源快速生长。较高硫酸铵浓度下,菌球的形成是发酵液粘度降低的重要原因。胞外丙酸和琥珀酸的积累表明在新工艺下较高的正丙醇消耗速率可能增加了甲基丙二酰-CoA和丙酰-CoA的浓度,进而增加了流向红霉素的代谢流量。硝酸铵虽然同样可以降低发酵液粘度和葡萄糖消耗速率,但是其诱导色素生成引起红霉素产量降低。最后,发现有机氮源中磷含量对红霉素发酵具有重要的影响。通过采用磷含量低的有机氮源可以降低发酵后期的溶磷水平。在对数生长期补加无机磷后,发酵过程OUR明显从较低水平回升到较高水平,红霉素产量大幅提升。因此,提出了采用磷含量低的氮源降低后期有机氮源中的磷释放速率,并结合补加无机磷提高发酵初期菌体生长速率的调控策略。在新策略下红霉素产量提高了20.9%。此外,在前期宏观代谢流计算发现正丙醇除作为红霉素合成前体外仍有部分流向TCA循环的基础上,采用[1-13C]丙酸钠为标记底物初步揭示了正丙醇经琥珀酸流向丙酮酸的代谢机制,打破了固有正丙醇只作为红霉素前体的设想。实现了正丙醇代谢去向探究在宏观代谢流分析研究基础上的微观代谢验证。在筛选用于同位素标记实验的合成培养基的过程中发现脯氨酸是红色糖多孢菌快速生长的关键氨基酸,并采用全标记葡萄糖和自然标记脯氨酸为标记底物阐明了脯氨酸经谷氨酸进入中心代谢并最终生成丙酮酸的途径。同位素标记实验平台的建立为进一步深入研究红霉素微观代谢和调控机理奠定了基础。
二、红霉素的结构改造（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、红霉素的结构改造（论文提纲范文）
（1）红霉素生物合成调控因子SACE＿1409的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 红霉素及糖多孢红霉菌 |
| 1.2 红霉素的生物合成途径 |
| 1.3 红霉素生物合成调控因子的研究进展 |
| 1.4 放线菌调控因子调控抗生素生物合成的复杂性 |
| 1.4.1 单个调控因子调控抗生素的生物合成 |
| 1.4.2 多个调控因子协同调控抗生素的生物合成 |
| 1.5 放线菌协同调控抗生素的生物合成 |
| 1.6 选题意义与研究内容 |
| 1.6.1 选题意义 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 第二章 实验材料与实验方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 引物表 |
| 2.1.3 培养基配方 |
| 2.1.4 实验试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 抑菌活性检测 |
| 2.2.2 PCR反应 |
| 2.2.3 DNA片段的回收与纯化 |
| 2.2.4 酶切与连接 |
| 2.2.5 大肠杆菌相关实验 |
| 2.2.6 菌株的活化与保存 |
| 2.2.7 原生质体的制备 |
| 2.2.8 原生质体的转化 |
| 2.2.9 糖多孢红霉菌的发酵与红霉素萃取 |
| 2.2.10 HPLC检测红霉素A的产量 |
| 2.2.11 糖多孢红霉菌生物量的测定以及形态分析 |
| 2.2.12 蛋白的表达与纯化 |
| 2.2.13 EMSA实验 |
| 2.2.14 糖多孢红霉菌总RNA的提取 |
| 2.2.15 qRT-PCR(Real-time Quantitative PCR) |
| 2.2.16 生物信息学分析 |
| 第三章 SACE_1409对红霉素生物合成的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 ΔSACE_1409突变株的构建 |
| 3.2.1 pUCTSR-Δ1409敲除载体的构建 |
| 3.2.2 ΔSACE_1409突变株的筛选 |
| 3.3 SACE_1409系列菌株的红霉素产量分析 |
| 3.3.1 ΔSACE_1409的抑菌能力分析 |
| 3.3.2 ΔSACE_1409中红霉素产量分析 |
| 3.3.3 ΔSACE_1409中SACE_1409基因的回补 |
| 3.4 ΔSACE_1409突变株形态分化与生物量分析 |
| 3.4.1 ΔSACE_1409突变株的形态分化分析 |
| 3.4.2 ΔSACE_1409突变株的生物量分析 |
| 3.5 SACE_1409对红霉素生物合成基因的调控机制 |
| 3.5.1 红霉素生物合成基因簇转录水平分析 |
| 3.5.2 SACE_1409与簇内启动子的EMSA分析 |
| 3.6 SACE_1409调控其邻近基因SACE_1408影响红霉素生物合成 |
| 3.6.1 SACE_1409对自身及邻近基因SACE_1408转录水平的影响 |
| 3.6.2 SACE_1409与自身及邻近基因SACE_1408的EMSA分析 |
| 3.6.3 SACE_1408的功能初探 |
| 3.7 本章小结 |
| 第四章 SACE_1409与SACE_7301的协同调控关系 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 ΔSACE_1409中SACE_7301的转录变化 |
| 4.3 SACE_1409蛋白对P_(SACE_7301)的EMSA分析 |
| 4.4 SACE_1409与SACE_7301协同调控关系 |
| 4.4.1 ΔSACE_1409/3×7301菌株的构建 |
| 4.4.2 SACE_1409与SACE_7301组合改造对红霉素产量的影响 |
| 4.4.3 SACE_1409与SACE_7301组合改造对红霉素合成基因簇转录的影响 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 SACE_1409与SACE_3986的协同调控关系 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 ΔSACE_1409中SACE_3986的转录变化 |
| 5.3 SACE_1409蛋白对P_(SACE_3986)的EMSA分析 |
| 5.4 SACE_1409与SACE_3986组合调控关系 |
| 5.4.1 抑制载体p SETd Cas9-3986的构建 |
| 5.4.2 ΔSACE_1409/p SETd Cas9-3986菌株的构建 |
| 5.4.3 SACE_1409与SACE_3986组合调控对红霉素产量的影响 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 基于SACE_1409的红霉素高产菌株改造 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 WBΔ1409工业菌株的改造 |
| 6.2.1 WBΔ1409工业菌株的构建 |
| 6.2.2 WBΔ1409工业菌株中红霉素产量分析 |
| 6.3 WBΔ1409/3×7301工业菌株的改造 |
| 6.3.1 WBΔ1409/3×7301工业菌株及其对照菌株的构建 |
| 6.3.2 WBΔ1409/3×7301工业菌株中红霉素产量分析 |
| 6.4 本章小结 |
| 第七章 结论与展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
（2）新型N-11,C-12,C-13和C-9位芳烷基克拉霉素半合成衍生物的设计、合成及生物活性评价（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 前言 |
| 第一节 大环内酯类抗生素概述 |
| 1. 第一代大环内酯类抗生素 |
| 2. 第二代大环内酯类抗生素 |
| 3. 第三代大环内酯类抗生素 |
| 4. 第四代大环内酯类抗生素 |
| 第二节 大环内酯类抗生素的作用机制 |
| 第三节 大环内酯类抗生素的耐药机制 |
| 1. 23S rRNA甲基化修饰 |
| 2. 核糖体RNA突变 |
| 3. 核糖体蛋白质变异 |
| 4. 细菌外排泵的主动外排 |
| 5. 基于酶机制的耐药 |
| 第四节 大环内酯类抗生素的研究进展 |
| 1. 酮内酯类 |
| 2. 酰内酯类 |
| 3. 4"-OH修饰物类 |
| 4. 2,3-烯内酯类 |
| 5. 5-O-脱氧糖胺修饰物类 |
| 第五节 小结 |
| 第二章 11-N-(4-芳基-1H-1,2,3-三氮唑)-9(S)-羟基克拉霉素衍生物的设计、合成及生物活性评价 |
| 第一节 基于大环内酯类天然产物和半合成衍生物的设计策略 |
| 第二节 A系列化合物的设计 |
| 1. A系列化合物的设计策略 |
| 2. A系列化合物的化学结构 |
| 第三节 A系列化合物的合成 |
| 1. 试剂和仪器 |
| 2. 合成路线及操作步骤 |
| 第四节 A系列化合物的生物活性评价 |
| 1. A系列化合物的抗菌活性测定方法 |
| 2. 体外抗菌活性结果和构效关系 |
| 3. 杀菌活性评价 |
| 4. 杀菌动力学研究 |
| 5. 模拟对接和分析 |
| 第五节 小结 |
| 第三章 12-(4-芳基-1H-1,2,3-三氮唑)-9(S)-羟基克拉霉素衍生物的设计、合成及生物活性评价 |
| 第一节 B系列化合物的设计 |
| 1. B系列化合物的设计策略 |
| 2. B系列化合物的化学结构 |
| 第二节 B系列化合物的合成 |
| 1. 试剂和仪器 |
| 2. 合成路线及操作步骤 |
| 第三节 B系列化合物的结构确证 |
| 第四节 B系列化合物的生物活性评价 |
| 1. B系列化合物的抗菌活性测定方法 |
| 2. 体外抗菌活性结果和构效关系 |
| 3. 杀菌活性评价 |
| 第五节 小结 |
| 第四章 13-(芳基-1H-1,2,3-三氮唑)-9(S)-羟基克拉霉素衍生物的设计、合成及生物活性评价 |
| 第一节 C系列化合物的设计 |
| 1. C系列化合物的设计策略 |
| 2. C系列化合物的化学结构 |
| 第二节 C系列化合物的合成 |
| 1. 试剂和仪器 |
| 2. 合成路线及操作步骤 |
| 第三节 C系列化合物的生物活性评价 |
| 1. C系列化合物的抗菌活性测定方法 |
| 2. 体外抗菌活性结果和构效关系 |
| 3. 杀菌活性评价 |
| 4. 杀菌动力学研究 |
| 5. 细胞毒性测定 |
| 6. 模拟对接和分析 |
| 第四节 C系列化合物进一步优化设计D系列化合物 |
| 1. D系列化合物的设计策略 |
| 2. D系列化合物的化学结构 |
| 第五节 D系列化合物的合成 |
| 1. 试剂和仪器 |
| 2. 合成路线及操作步骤 |
| 第六节 D系列化合物的生物活性评价 |
| 1. D系列化合物的抗菌活性测定方法 |
| 2. 体外抗菌活性结果和构效关系 |
| 3. 杀菌活性评价 |
| 4. 细胞毒性测定 |
| 第七节 小结 |
| 第五章 2',9(S)-二芳基-3-羰基克拉霉素衍生物的设计、合成及生物活性评价 |
| 第一节 E系列化合物的设计 |
| 1. E系列化合物的设计策略 |
| 2. E系列化合物的化学结构 |
| 第二节 E系列化合物的合成 |
| 1. 试剂和仪器 |
| 2. 合成路线及操作步骤 |
| 第三节 E系列化合物的生物活性评价 |
| 1. E系列化合物的抗菌活性测定方法 |
| 2. 体外抗菌活性结果和构效关系 |
| 第四节 小结 |
| 第六章 A、B、C、D和E系列化合物的抗菌活性和构效关系 |
| 第一节 A、B、C、D和E系列化合物的抗菌活性结果 |
| 第二节 A、B、C、D和E系列化合物的抗菌活性总结 |
| 第三节 A、B、C、D和E系列化合物的构效关系 |
| 第七章 总结与展望 |
| 第一节 总结 |
| 1. A、B、C、D和E系列化合物的制备 |
| 2. A、B、C、D和E系列化合物的抗菌活性 |
| 3. 杀菌活性 |
| 4. 杀菌动力学 |
| 5. 细胞毒性 |
| 第二节 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间科研成果及奖励情况 |
| 附录 化合物及代表性中间体谱图 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（3）应用CRISR-Cas9在红色糖多孢菌进行基因编辑重构生物合成基因簇的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 CRISPR-Cas分类 |
| 1.2 CRISPR-Cas9系统组成元件 |
| 1.3 CRISPR-Cas9作用机制 |
| 1.4 CRISPR-Cas9系统的应用 |
| 1.4.1 CRISPR-Cas9在疾病相关研究中的应用 |
| 1.4.2 CRISPR-Cas9在合成生物中的应用 |
| 1.4.3 CRISPR-Cas9技术应用的拓展 |
| 1.5 放线菌中应用CRISPR-Cas9研究现状 |
| 1.5.1 放线菌中生物合成基因簇是基因编辑靶标 |
| 1.5.2 红色糖多孢菌与红霉素生物合成 |
| 1.6 研究的目的和意义 |
| 第2章 应用CRISPR-Cas9实现红色糖多孢菌基因编辑 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 技术路线 |
| 2.3 实验材料 |
| 2.3.1 菌种和质粒 |
| 2.3.2 实验试剂及试剂盒 |
| 2.3.3 实验仪器 |
| 2.3.4 培养基及缓冲液 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 实验用菌种培养 |
| 2.4.2 生长曲线与红霉素产量测定 |
| 2.4.3 红色糖多孢菌基因编辑载体选择 |
| 2.4.4 表达Flag-egfp融合蛋白的温敏质粒构建 |
| 2.4.5 sgRNA分析设计及合成 |
| 2.4.6 Cas9基因编辑质粒构建 |
| 2.4.7 热激转化及阳性克隆筛选 |
| 2.4.8 Cas9蛋白表达及纯化 |
| 2.4.9 构建SACE_1765 Indel载体 |
| 2.4.10 构建双sgRNA靶向无痕敲除indA载体 |
| 2.4.11 构建PermE-egfp敲入到SACE_0712载体 |
| 2.4.12 制备红色糖多孢菌原生质体 |
| 2.4.13 PEG-3350介导质粒转化原生质体及重组菌筛选 |
| 2.4.14 测序分析基因组上的敲入序列 |
| 2.4.15 QPCR分析 |
| 2.4.16 SDS-PAGE及Western blot分析 |
| 2.4.17 荧光显微镜检测 |
| 2.4.18 敲除/敲入效率计算 |
| 2.5 结果与讨论 |
| 2.5.1 红霉素检测方法确定 |
| 2.5.2 温敏复制子pSG5控制Flag-egfp融合表达 |
| 2.5.3 位点特异性靶向sgRNA确定 |
| 2.5.4 Cas9-sgRNA敲除SACE_1765 |
| 2.5.5 使用双sgRNA靶向indA提高敲除效率 |
| 2.5.6 启动子PermE敲入激活下游基因转录 |
| 2.5.7 分析比较敲除敲入的效率 |
| 2.6 小结 |
| 第3章 应用CRISPR-Cas9敲入双向启动子激活红霉素合成基因簇 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 技术路线 |
| 3.3 实验材料 |
| 3.3.1 菌种和质粒 |
| 3.3.2 实验试剂 |
| 3.3.3 仪器与耗材和引物 |
| 3.3.4 培养基及缓冲液 |
| 3.4 实验方法 |
| 3.4.1 分析红霉素生物合成基因簇启动子 |
| 3.4.2 PkasO-Pj23119组合双向启动子检测 |
| 3.4.3 构建双向启动子敲入载体 |
| 3.4.4 双向启动子敲入载体转化Ab原生质体 |
| 3.4.5 筛选Ab::PkasO-Pj23119重组菌 |
| 3.4.6 双向启动子敲入重组菌QPCR |
| 3.4.7 双向启动子敲入后的红色糖多孢菌全蛋白SDS-PAGE |
| 3.4.8 双向启动子敲入重组菌发酵产物分析 |
| 3.5 结果与讨论 |
| 3.5.1 Pery启动子强度确定 |
| 3.5.2 sfGFP相mCherry表达 |
| 3.5.3 组合的双向启动子测序结果 |
| 3.5.4 双向启动子驱动两侧的荧光蛋白同时表达 |
| 3.5.5 双向启动子敲入重组菌分析 |
| 3.5.6 双向启动子敲入重组菌测序结果 |
| 3.5.7 生物活性法筛选DBPs KI重组菌 |
| 3.5.8 双向启动子敲入重组菌cDNA定量及转录水平结果 |
| 3.5.9 双向启动子敲入使红霉素生物合成基因簇转录水平上调 |
| 3.5.10 红霉素生物合成基因簇激活重组菌全蛋白带型分析 |
| 3.5.11 红霉素生物合成基因簇激活对次级代谢产物影响分析 |
| 3.5.12 红霉素生物合成基因簇激活菌株工业培养基摇瓶发酵确定产量 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 基于CRISPR调控基因表达策略优化代谢流 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 技术路线 |
| 4.3 实验材料 |
| 4.3.1 菌种和质粒 |
| 4.3.2 实验试剂 |
| 4.3.3 仪器耗材 |
| 4.4 实验方法 |
| 4.4.1 Cas9定点突变为dCas9 |
| 4.4.2 dCas9温敏载体构建 |
| 4.4.3 靶向抑制的CRISPRi载体构建 |
| 4.4.4 CRISPRi质粒转化原生质体 |
| 4.4.5 靶基因抑制重组菌筛选 |
| 4.4.6 CRISPRi重组菌QPCR分析 |
| 4.4.7 CRISPRi重组菌发酵产物分析 |
| 4.4.8 构建绿光开关载体 |
| 4.4.9 构建CRISPRa载体 |
| 4.5 结果与讨论 |
| 4.5.1 pKE-dCas9-sgRNA质粒验证 |
| 4.5.2 CRISPRi质粒验证 |
| 4.5.3 CRISPRi质粒sgRNA测序 |
| 4.5.4 抑制aceA,sdhA |
| 4.5.5 靶向抑制效果比较 |
| 4.5.6 过表达前体供应的酶菌株确定 |
| 4.5.7 CRISPRi以及过表达丙酰-CoA羧化酶对产量影响分析 |
| 4.5.8 绿光调控红色糖多孢菌基因表达 |
| 4.5.9 CRISPRa质粒测序结果及后期应用可行性分析 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 应用CRISPR-Cas9技术重构次级代谢途径 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 技术路线 |
| 5.3 实验材料 |
| 5.3.1 菌种和质粒 |
| 5.3.2 实验试剂 |
| 5.3.3 仪器耗材 |
| 5.4 实验方法 |
| 5.4.1 ery BGC的靶向sgRNA选择 |
| 5.4.2 ery BGC敲除载体构建 |
| 5.4.3 敲除ery BGC质粒转化原生质体 |
| 5.4.4 筛选AbΔery重组菌 |
| 5.4.5 AbΔery红霉素生物活性分析 |
| 5.4.6 构建次级代谢途径重构的外源基因表达菌株 |
| 5.4.7 次级代谢途径重构菌的外源基因QPCR分析 |
| 5.4.8 HPLC检测发酵产物 |
| 5.5 结果与讨论 |
| 5.5.1 红霉素生物合成基因簇靶向sgRNA确定 |
| 5.5.2 敲除红霉素生物合成基因簇的载体验证 |
| 5.5.3 敲除红霉素生物合成基因簇载体分析 |
| 5.5.4 Ab△ery单克隆筛选 |
| 5.5.5 Ab△ery测序确定红霉素生物合成基因簇敲除成功 |
| 5.5.6 敲除ery BGC使红霉素合成能力丧失 |
| 5.5.7 次级代谢途径重构 |
| 5.6 小结 |
| 第6章 总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 展望 |
| 6.3 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录1 博士期间已发表论文 |
| 附录2 质粒序列 |
| 附录3 靶点基因编辑后测序 |
（4）阿奇霉素的合成工艺研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 大环内酯类抗生素的简介 |
| 1.2 红霉素的简介 |
| 1.3 红霉素的结构改造过程简介 |
| 1.3.1 红霉素的早期结构改造 |
| 1.3.2 第二代红霉素类抗生素 |
| 1.4 阿奇霉素的简介 |
| 1.4.1 阿奇霉素化学结构、抗菌机制及抗菌谱 |
| 1.4.2 阿奇霉素临床应用 |
| 1.5 本章小结 |
| 第2章 阿奇霉素合成工艺路线的选择 |
| 2.1 阿奇霉素的合成方法 |
| 2.1.1 肟化反应 |
| 2.1.2 重排反应 |
| 2.1.3 还原反应 |
| 2.1.4 甲基化反应 |
| 2.2 拟合成路线 |
| 第3章 制备阿奇霉素的工艺条件研究 |
| 3.1 硫氰酸红霉素肟(中间体-1)的合成 |
| 3.1.1 肟化反应原理 |
| 3.1.2 主要药品及仪器 |
| 3.1.3 影响反应过程的因素考察 |
| 3.1.4 硫氰酸红霉素肟化反应结果 |
| 3.2 红霉素A6,9-亚胺醚(中间体-2)的合成 |
| 3.2.1 重排反应机理 |
| 3.2.2 主要药品及仪器 |
| 3.2.3 二氯甲烷~水体系中重排反应研究 |
| 3.2.4 丙酮~水体系红霉素肟重排反应研究 |
| 3.2.5 硫氰酸红霉素肟重排反应结果 |
| 3.3 9-脱氧-9a-氮杂-9a-高红霉素(中间体-3)合成的研究 |
| 3.3.1 还原反应机理 |
| 3.3.2 主要药品及仪器 |
| 3.3.3 影响反应过程的因素考察 |
| 3.3.4 红霉素A6,9-亚胺醚还原反应结果 |
| 3.4 阿奇霉素及其二水合物的合成研究 |
| 3.4.1 甲基化反应机理 |
| 3.4.2 主要仪器与试剂 |
| 3.4.3 影响甲基化反应过程的因素考察 |
| 3.4.4 影响阿奇霉素二水合物制备过程的因素考察 |
| 3.4.5 阿奇霉素及其二水合物制备结果 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 阿奇霉素稳定性实验及工艺流程图 |
| 4.1 硫氰酸红霉素肟的制备 |
| 4.2 红霉素A6,9-亚胺醚的制备 |
| 4.3 9-脱氧-9a-氮杂-9a-高红霉素的制备 |
| 4.4 阿奇霉素及其二水合物的制备 |
| 4.5 阿奇霉素合成工艺流程图 |
| 4.5.1 中间体-1合成工艺流程图 |
| 4.5.2 中间体-2合成工艺流程图 |
| 4.5.3 中间体-3合成工艺流程图 |
| 4.5.4 阿奇霉素合成工艺流程图 |
| 4.6 本章小结 |
| 第5章 阿奇霉素有关物质合成研究 |
| 5.1 阿奇霉素有关物质的简介 |
| 5.2 阿奇霉素有关物质来源分析 |
| 5.2.1 肟化反应 |
| 5.2.2 重排反应 |
| 5.2.3 还原/酸解反应 |
| 5.2.4 甲基化反应 |
| 5.2.5 红霉素A制备阿奇霉素过程中可能出现的杂质 |
| 5.3 阿奇霉素有关物质的合成 |
| 5.3.1 杂质Q的制备 |
| 5.3.2 杂质R的制备 |
| 5.3.3 杂质I的制备 |
| 5.3.4 杂质G的制备 |
| 5.3.5 杂质J的制备 |
| 5.3.6 杂质H的制备 |
| 5.3.7 杂质L的制备 |
| 5.3.8 杂质F的制备 |
| 5.3.9 杂质A的制备 |
| 5.3.10 杂质S的制备 |
| 5.4 本章小结 |
| 结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间所发表的论文 |
| 致谢 |
（5）13C标记实验辅助的红霉素工业生产菌代谢机制分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 红霉素及其生产菌 |
| 1.1.1 红霉素理化性质及结构 |
| 1.1.2 红霉素的抑菌机制和应用范围 |
| 1.1.3 红霉素的主要工业生产菌 |
| 1.2 红霉素A的生物合成途径 |
| 1.2.1 前体的合成 |
| 1.2.2 红霉素A的生物合成 |
| 1.3 同位素标记实验技术的发展 |
| 1.3.1 同位素标记实验技术简介 |
| 1.3.2 稳定同位素标记实验的发展 |
| 1.3.3 稳定同位素标记技术在当前的主要应用 |
| 1.4 微生物代谢物组分析技术研究进展 |
| 1.4.1 微生物代谢物组分析简介 |
| 1.4.2 代谢物组分析过程中的细胞培养方法 |
| 1.4.3 代谢物组分析过程中的快速取样技术 |
| 1.4.4 微生物代谢反应的灭活方法发展 |
| 1.4.5 胞内代谢物提取方法 |
| 1.4.6 代谢物的测定方法的发展 |
| 1.5 红色糖多孢菌基因工程改造 |
| 1.6 高通量筛选技术简介 |
| 1.7 本课题的研究内容与意义 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 培养基 |
| 2.1.3 溶液配置 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 斜面培养 |
| 2.2.2 摇瓶种子培养 |
| 2.2.3 摇瓶发酵培养 |
| 2.2.4 5L发酵罐培养 |
| 2.3 实验设备及试剂 |
| 2.3.1 发酵设备 |
| 2.3.2 其他设备 |
| 2.4 检测方法 |
| 2.4.1 菌浓测定 |
| 2.4.2 葡萄糖和总糖测定 |
| 2.4.3 豆油浓度测定 |
| 2.4.4 正丙醇浓度 |
| 2.4.5 红霉素测定 |
| 2.4.6 胞外代谢物收集 |
| 第3章 S.erythraea代谢物组分析方法的建立 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌种 |
| 3.2.2 发酵培养基 |
| 3.2.3 发酵和检测方法 |
| 3.2.4 代谢物浓度测定方法 |
| 3.2.5 ~(13)C同位素全标记内标的制备 |
| 3.2.6 辅酶A类物质提取 |
| 3.2.7 胞内磷酸糖的提取 |
| 3.2.8 胞内有机酸提取 |
| 3.2.9 回收率测定方法 |
| 3.3 胞内代谢物提取方法的优化结果 |
| 3.3.1 菌体生长和取样 |
| 3.3.2 辅酶A类物质提取方法验证 |
| 3.3.3 磷酸糖提取方法验证 |
| 3.3.4 有机酸提取方法验证 |
| 3.4 红霉素A合成过程中的代谢物组分析 |
| 3.4.1 5L发酵罐中菌体生长和红霉素合成情况 |
| 3.4.2 红霉素发酵过程中代谢物组分析 |
| 3.4.3 丙酰辅酶浓度与比红霉素合成速率之间的关系 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 红色糖多孢菌胞内代谢物~(13)C标记信息分析方法的建立 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌种 |
| 4.2.2 培养基 |
| 4.2.3 培养方法 |
| 4.2.4 LC-MS/MS测定有机酸、磷酸糖和辅酶A类物质的基本设置 |
| 4.2.5 GC-MS设置 |
| 4.2.6 菌体蛋白氨基酸同位素信息测定 |
| 4.2.7 LC-MS/MS测定同位素信息的方法 |
| 4.2.8 胞内有机酸、磷酸糖和辅酶A类物质提取方法 |
| 4.2.9 天然标记信息校正 |
| 4.2.10 标准品的理论同位素分布信息计算 |
| 4.2.11 FL(Fractional labeling)计算方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 GC-MS测定氨基酸同位素信息方法的建立 |
| 4.3.2 LC-MS/MS测定有机酸、磷酸糖和辅酶A类物质和的同位素信息方法结果分析 |
| 4.3.3 同位素信息分析方法的在红色糖多孢菌中的验证 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 S.erythraea葡萄糖与脯氨酸代谢分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌种 |
| 5.2.2 合成培养基 |
| 5.2.3 同位素信息分析方法 |
| 5.2.4 丙酮酸的位置同位素异构体分布计算方法 |
| 5.2.5 代谢通量分析 |
| 5.2.6 ~(13)C标记比例(FL)的计算 |
| 5.2.7 ~(13)C同位素标记实验 |
| 5.3 S.erythraea核心碳代谢网络模型的构建 |
| 5.3.1 S.erythraea核心碳代谢网络 |
| 5.3.2 S.erythraea代谢反应的原子迁移式 |
| 5.3.3 菌体合成反应 |
| 5.4 S.erythraea葡萄糖代谢分析 |
| 5.4.1 葡萄糖代谢过程中1号位标记的~(13)C在代谢途径中的去向 |
| 5.4.2 S. erythraea葡萄糖代谢分析结果 |
| 5.5 S.erythraea脯氨酸代谢分析 |
| 5.5.1 不同氨基酸对S.erythraea生长的影响 |
| 5.5.2 脯氨酸对于核心碳代谢的影响 |
| 5.5.3 验证~(13)C代谢通量分析的可靠性 |
| 5.5.4 脯氨酸对S. erythraea核心碳代谢的影响 |
| 5.5.5 ATP和辅酶代谢 |
| 5.5.6 脯氨酸代谢去向分析 |
| 5.5.7 脯氨酸对能荷的影响 |
| 5.6 本章小结 |
| 第6章 基于S.erythraea正丙醇代谢去向改造的基因工程菌构建及其对代谢的影响 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 菌种 |
| 6.2.2 发酵培养基 |
| 6.2.3 菌体培养和检测方法 |
| 6.2.4 辅酶A类物质同位素信息分析方法 |
| 6.2.5 [1-~(13)C]丙酸钠标记实验 |
| 6.2.6 代谢通量计算方法 |
| 6.2.7 发酵过程中主要参数计算方法 |
| 6.2.8 制备E.coli的感受态细胞 |
| 6.2.9 E.coli感受态细胞的转化 |
| 6.2.10 核酸电泳以及回收纯化 |
| 6.2.11 DNA酶切和连接操作 |
| 6.2.12 PCR操作 |
| 6.2.13 PCR产物的纯化和质粒的抽提操作 |
| 6.2.14 S.erythraea E3菌株孢子的复苏和制备 |
| 6.2.15 S.erythraea总DNA的提取方法 |
| 6.2.16 测定S.erythraea E3对抗生素Kana、Apr和Tsr的天然抗性浓度 |
| 6.2.17 S. erythraea与E.coli的属间结合转移操作 |
| 6.2.18 挑选S.erythraea接合子 |
| 6.2.19 PCR扩增物测序前操作 |
| 6.3 红霉素发酵与正丙醇消耗 |
| 6.3.1 正丙醇代谢去向分析 |
| 6.4 S.erythraea E3菌株代谢改造 |
| 6.4.1 敲除S.erythraea E3中甲基丙二酰辅酶A变位酶基因 |
| 6.4.2 敲除S.erythraea E3中琥珀酰辅酶A合成酶基因(sucC) |
| 6.5 代谢改造对红霉素合成的影响 |
| 6.5.1 代谢改造菌株在摇瓶中的发酵特性研究 |
| 6.6 E3和E3-△mutB在5L发酵罐红霉素发酵过程中的宏观和微观代谢差异分析 |
| 6.6.1 E3和E3-△mutB发酵过程中宏观代谢参数分析 |
| 6.6.2 E3-AmutB发酵过程中的代谢通量分析 |
| 6.7 本章小结 |
| 第7章 高通量优化红霉素合成培养基 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 材料与方法 |
| 7.2.1 菌种 |
| 7.2.2 红霉素生物检测培养基 |
| 7.2.3 48孔板培养 |
| 7.2.4 5L罐培养与培养基 |
| 7.2.5 单组分删除实验 |
| 7.2.6 Plackett-Burman实验设计 |
| 7.2.7 高通量生物法测定红霉素效价 |
| 7.3 应用高通量方法优化用于红霉素发酵的合成培养基 |
| 7.3.1 单组分删除实验结果 |
| 7.3.2 采用Plackett-Burman实验方法初步优化各组分浓度 |
| 7.4 利用氮、磷调控策略在5L罐中进一步优化合成培养基组分 |
| 7.5 优化的合成培养基与前期实验采用的合成培养基对比 |
| 7.6 本章小结 |
| 第8章 结论与展望 |
| 8.1 结论 |
| 8.2 创新点 |
| 8.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间主要成果 |
| 附录Ⅰ |
| 附录Ⅱ |
| 附录Ⅲ |
| 附录Ⅳ |
| 附录Ⅴ |
| 附录Ⅵ |
| 附录Ⅶ |
| 附件 |
（6）新型抗耐药菌红霉素的设计和合成（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 大环内酯类抗生素的作用机制 |
| 1.2 细菌对大环内酯类抗生素的耐药机制 |
| 1.3 大环内酯类抗生素的结构改造 |
| 第2章 研究意义和选题设计 |
| 2.1 研究目的和意义 |
| 2.2 选题设计 |
| 第3章 化合物的制备 |
| 3.1 实验仪器和试剂 |
| 3.2 实验分析及化合物鉴定 |
| 3.3 合成路线设计和实验讨论 |
| 3.4 化合物的制备 |
| 第4章 构效关系分析 |
| 4.1 体外活性测试 |
| 4.2 体外测试结果 |
| 4.3 结果分析 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文与研究成果清单 |
| 致谢 |
| 附录 |
（7）聚酮类化合物红霉素及抗霉素的碳骨架改造研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1. 引言 |
| 1.1 聚酮类化合物 |
| 1.1.1 聚酮合成酶分类 |
| 1.1.2 延伸单元的种类及合成 |
| 1.2 聚酮类化合物的改造 |
| 1.2.1 PKS模块中结构域的组合生物合成 |
| 1.2.2 聚酮类化合物的后修饰 |
| 1.3 红霉素及其衍生物 |
| 1.3.1 红霉素结构及其生物合成途径 |
| 1.3.3 红霉素类衍生物 |
| 1.4 天然抗霉素的结构及生物合成途径 |
| 1.5 研究的主要内容与意义 |
| 1.5.1 红霉素聚酮碳骨架改造的研究内容与意义 |
| 1.5.2 抗霉素聚酮碳骨架改造的研究内容与意义 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 质粒 |
| 2.1.3 实验所用引物及序列 |
| 2.1.4 培养基和化学试剂 |
| 2.1.5 生化试剂及测序 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大肠杆菌质粒的提取 |
| 2.2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.2.3 大肠杆菌感受态细胞的转化 |
| 2.2.4 PCR反应体系与条件 |
| 2.2.5 PCR targeting |
| 2.2.6 接合转移 |
| 2.2.7 原生质体的制备与转化 |
| 2.2.8 基因敲除 |
| 2.2.9 发酵、喂养及检测条件 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 红霉素高产菌S.erythraea HL3168遗传操作系统的建立 |
| 3.1.1 原生质体的转化 |
| 3.1.2 结合转移系统 |
| 3.1.3 S.erythraea HL3168遗传操作系统的确定与优化 |
| 3.2 红霉素高产菌S.erythraea HL3168)ΔeryAⅢ)突变株的构建 |
| 3.2.1 自杀型、CRISPR/Cas9技术介导敲除载体在S.erythraea HL3168系统中敲除效率的的考察 |
| 3.2.2 复制子的考察 |
| 3.2.3 用于S.erythraea系统基因敲除载体的优化 |
| 3.3 红霉素高产菌S.erythraea HL3168 AT置换突变株的构建 |
| 3.3.1 AT置换策略的分析 |
| 3.3.2 CoA-ligase的考察 |
| 3.3.3 置换突变株的构建 |
| 3.4 S.erythraea HL3168及其突变株的发酵与喂养 |
| 3.4.1 6-脱氧红霉内酯生物合成基因簇的回补 |
| 3.4.2 突变株的发酵及喂养 |
| 3.5 抗霉素原始产生菌株的代谢工程改造 |
| 3.5.1 β-氧化途径的阻断 |
| 3.6 抗霉素突变株的发酵与喂养 |
| 3.6.1 以5-氯戊酸为底物的喂养实验 |
| 3.6.2 尝试以三种氨基酸脱羧氧化降解产物为底物的喂养实验 |
| 4 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）井冈霉素和盐霉素的高产机理与改造（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一篇 “弱化初级代谢提高抗生素产量”的改造策略 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 井冈霉素的研究现状 |
| 1.1.1 井冈霉素的生物合成研究进展 |
| 1.1.2 井冈霉素的发酵工程研究进展 |
| 1.1.3 井冈霉素产生菌组学研究进展 |
| 1.2 放线菌高产菌株代谢工程改造概述 |
| 1.2.1 阿维菌素高产菌株代谢工程改造 |
| 1.2.2 红霉素高产菌株代谢工程改造 |
| 1.2.3 匹马霉素高产菌株代谢工程改造 |
| 1.2.4 克拉维酸高产菌株代谢工程改造 |
| 1.2.5 林可霉素高产菌株代谢工程改造 |
| 1.3 研究的内容和目的 |
| 1.3.1 研究内容 |
| 1.3.2 研究目的 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 研究中所用菌株 |
| 2.2 研究中所用质粒 |
| 2.3 研究中所用引物 |
| 2.4 研究中所用培养基 |
| 2.5 研究中所用试剂和缓冲液 |
| 2.6 实验方法 |
| 第三章 “弱化初级代谢提高抗生素产量”假说的提出和验证 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.2.1 三个大片段缺失起关键贡献 |
| 3.2.2 大片段缺失突变株产量和生物量变化呈负相关 |
| 3.2.3 Det-Ⅰ 和 Det-Ⅲ 区域关键基因的鉴定 |
| 3.2.4 大片段缺失突变株代谢物组分析 |
| 3.2.55008 及TL01 的定向高产改造 |
| 3.3 小结 |
| 第四章 多种抗生素产生菌株初级代谢的弱化改造 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.2.1 红霉素产生菌Saccharopolyspora erythraea NRRL2338 改造 |
| 4.2.2 林可霉素产生菌Streptomyces lincolnensis LC-G改造 |
| 4.2.3 庆大霉素产生菌Micromonospora echinospora ATCC15838 改造 |
| 4.2.4 阿维菌素产生菌Streptomyces avermitilis76-5 改造 |
| 4.3 小结 |
| 第五章 链霉菌线型质粒pSHJG1 的功能研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 结果与讨论 |
| 5.2.1 TL01 中线型质粒pSHJG1 整体呈现低表达 |
| 5.2.2 线型质粒消除策略的建立和完善 |
| 5.2.3 线型质粒消除提高井冈霉素产量 |
| 5.2.4 线型质粒pSHJG1 中关键基因的确认 |
| 5.2.5 线型质粒 p HZ228 消除提高抗生素 FR008/杀念菌素产量 |
| 5.3 小结 |
| 第二篇 盐霉素产生菌基因组解析及定向高产改造 |
| 第六章 文献综述 |
| 6.1 盐霉素的研究现状 |
| 6.1.1 盐霉素的生物合成研究进展 |
| 6.1.2 盐霉素的发酵工程研究进展 |
| 6.2 PKS常用辅酶A类前体研究现状 |
| 6.2.1 丙二酰辅酶A(malonyl-CoA) |
| 6.2.2 甲基丙二酰辅酶A((2S)-methylmalonyl-CoA) |
| 6.2.3 乙基丙二酰辅酶A((2S)-ethylmalonyl-CoA) |
| 6.2.4 氯代乙基丙二酰辅酶A(chloroethylmalonyl-CoA) |
| 6.2.5 其他辅酶A类前体 |
| 6.3 研究内容 |
| 6.3.1 研究内容 |
| 第七章 实验材料与方法 |
| 7.1 研究中所用菌株 |
| 7.2 研究中所用质粒 |
| 7.3 研究中所用引物 |
| 7.4 研究中所用培养基 |
| 7.5 实验方法 |
| 第八章 白色链霉菌DSM41398 基因组完整图谱构建和解析 |
| 8.1 前言 |
| 8.2 结果与讨论 |
| 8.2.1 S.albus DSM41398 全基因组完整图谱的构建 |
| 8.2.2 S.albus DSM41398 全基因组的基本特征 |
| 8.2.3 S.albus DSM41398 中次级代谢生物合成基因簇的功能预测 |
| 8.2.4 参与盐霉素合成的前体代谢网络重构 |
| 8.2.5 S.albus DSM41398 豆油利用偏好性研究 |
| 8.3 小结 |
| 第九章 前体浓度微调整促进盐霉素产量提高 |
| 9.1 前言 |
| 9.2 结果与讨论 |
| 9.2.1 PKS生物合成基因簇的生物信息学分析 |
| 9.2.2 PKS生物合成基因簇的转录量分析 |
| 9.2.3 竞争基因簇中断促进产量提高 |
| 9.2.4 组合缺失突变株产量没有进一步的提高 |
| 9.2.5 乙基丙二酰辅酶A的供应是新的限速步骤 |
| 9.2.6 编码巴豆酰辅酶A还原酶基因的鉴定 |
| 9.2.7 超量表达ccr基因促进组合缺失突变株产量进一步提高 |
| 9.2.8 超量表达ccr基因促进高产菌株产量进一步提高 |
| 9.3 小结 |
| 第十章 总结与展望 |
| 10.1 总结 |
| 10.2 本研究的创新点 |
| 10.3 工作展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间的研究成果 |
（9）以生物合成为基础的红霉素A的产量提高和结构改造（论文提纲范文）
| 1 红霉素A的生物合成机制 |
| 2 以生物合成为基础的红霉素A的产量提高研究 |
| 3 以生物合成为基础的红霉素A的结构改造研究 |
| 3.1 大环内酯骨架的结构改造 |
| 3.1.1 Ⅰ型PKS功能域水平上的遗传操作 |
| 3.1.2 Ⅰ型PKS模块水平上的遗传操作 |
| 3.2 后修饰途径中糖基单元的结构改造 |
| 4 总结 |
（10）基于碳氮磷利用速率动态调控的红霉素基因工程菌发酵过程优化及红霉素微观代谢研究初步探索（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 红霉素概述 |
| 1.1.1 红霉素的结构与理化性质 |
| 1.1.2 红霉素的功能与应用 |
| 1.1.3 红霉素市场分析 |
| 1.2 红霉素的生物合成途径 |
| 1.2.1 6-脱氧红霉内酯的合成 |
| 1.2.2 6-脱氧红霉内酯后修饰形成红霉素A |
| 1.2.3 红霉素前体的合成 |
| 1.3 红霉素发酵工艺研究进展 |
| 1.4 红霉素基因改造进展 |
| 1.4.1 红霉素生物合成的基因 |
| 1.4.2 红霉素基因改造研究进展 |
| 1.5 红霉素合成过程的代谢调节研究进展 |
| 1.6 微生物发酵过程优化技术研究进展 |
| 1.7 代谢流分析技术研究进展 |
| 1.8 课题研究背景、意义及主要内容 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌种 |
| 2.1.2 培养基 |
| 2.1.3 实验器材与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 培养方法 |
| 2.2.2 检测方法 |
| 第3章 红霉素基因工程菌发酵培养基氮源优化与中试放大 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 菌种 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 红霉素重组菌与生产菌的发酵性能比较 |
| 3.3.2 红霉素重组菌发酵培养基的氮源优化 |
| 3.3.3 啤酒酵母浸粉与面包酵母浸粉作为速效有机氮源的比较 |
| 3.3.4 不同速效有机氮源下的酶活和菌丝形态比较 |
| 3.3.5 酵母粉作为速效有机氮源的培养基优化 |
| 3.3.6 二级种子培养基的氮源优化 |
| 3.3.7 氮源调节工艺的25吨罐放大 |
| 3.3.8 采用酵母粉替代玉米浆对工业生产菌发酵过程的影响 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 葡萄糖和正丙醇的利用关系及补加策略对红霉素合成的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 葡萄糖补加速率对红霉素发酵过程的影响 |
| 4.3.2 基于RQ补糖和基于溶氧曲线补醇的新型底物补加策略 |
| 4.3.3 基于总碳原子相等原则的糖醇动态补加策略 |
| 4.3.4 宏观代谢流量分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 无机氮磷调控降低发酵液粘度和葡萄糖消耗 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 氮源与粘度关系考察 |
| 5.3.2 综合氮磷调节实现低粘度、低糖耗的红霉素发酵工艺 |
| 5.3.3 氮磷调节对菌体代谢的影响 |
| 5.3.4 摇瓶水平下混合无机铵盐对红霉素发酵过程的影响 |
| 5.3.5 混合无机铵盐对发酵液粘度和葡萄糖消耗速率的影响 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 不同磷含量氮源结合无机磷补加调控发酵过程磷水平 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料和方法 |
| 6.2.1 菌种 |
| 6.2.2 实验方法 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 高磷含量和低磷含量有机氮源的选择 |
| 6.3.2 降低有机氮源磷含量控制红霉素发酵后期溶磷水平 |
| 6.3.3 流加无机磷调控发酵初期磷水平 |
| 6.3.4 低浓度速效氮源结合无机磷流加对发酵过程的影响 |
| 6.3.5 降低有机氮源磷含量对生产菌发酵的影响 |
| 6.3.6 恒碳氮比流加低磷含量氮源对生产菌发酵过程的影响 |
| 6.3.7 氨基酸利用速率及其对红霉素合成的影响 |
| 6.4 本章小结 |
| 第7章 用于红霉素微观代谢研究的~(13)C同位素标记实验平台搭建和初步应用 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 材料与方法 |
| 7.2.1 菌种和培养基 |
| 7.2.2 培养方法 |
| 7.2.3 检测方法 |
| 7.3 结果与讨论 |
| 7.3.1 合成培养基的选择 |
| 7.3.2 脯氨酸和葡萄糖浓度优化 |
| 7.3.3 菌体生长和底物消耗动力学 |
| 7.3.4 同位标记实验原理与实验设计 |
| 7.3.5 全标记葡萄糖实验考察脯氨酸的代谢机理 |
| 7.3.6 代谢网络的原子迁移 |
| 7.3.7 [1-~(13)C]标记丙酸钠实验考察正丙醇的代谢机理 |
| 7.4 本章小结 |
| 第8章 结论与展望 |
| 8.1 主要结论 |
| 8.2 论文创新点 |
| 8.3 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
| 附录1 代谢网络中的碳原子迁移关系构建 |
四、红霉素的结构改造（论文参考文献）
- [1]红霉素生物合成调控因子SACE＿1409的功能研究[D]. 刘兰兰. 安徽大学, 2021
- [2]新型N-11,C-12,C-13和C-9位芳烷基克拉霉素半合成衍生物的设计、合成及生物活性评价[D]. 秦银辉. 山东大学, 2020(12)
- [3]应用CRISR-Cas9在红色糖多孢菌进行基因编辑重构生物合成基因簇的研究[D]. 刘永. 华东理工大学, 2019(01)
- [4]阿奇霉素的合成工艺研究[D]. 刘丽星. 河北科技大学, 2018(06)
- [5]13C标记实验辅助的红霉素工业生产菌代谢机制分析[D]. 洪铭. 华东理工大学, 2017(08)
- [6]新型抗耐药菌红霉素的设计和合成[D]. 田竞超. 北京理工大学, 2017(03)
- [7]聚酮类化合物红霉素及抗霉素的碳骨架改造研究[D]. 汪淑文. 武汉大学, 2017(01)
- [8]井冈霉素和盐霉素的高产机理与改造[D]. 芦晨阳. 上海交通大学, 2016(01)
- [9]以生物合成为基础的红霉素A的产量提高和结构改造[J]. 陈单丹,吴杰群,刘文. 生物工程学报, 2015(06)
- [10]基于碳氮磷利用速率动态调控的红霉素基因工程菌发酵过程优化及红霉素微观代谢研究初步探索[D]. 陈勇. 华东理工大学, 2013(08)