一、内耳相关性BDNF和NT-3的研究进展（论文文献综述）
曾友根[1]（2020）在《NSC联合OEC移植对SNHL模型大鼠耳蜗细胞凋亡的研究》文中提出目的:本研究通过观察NSCs和OECs联合移植对SNHL模型大鼠耳蜗细胞神经营养因子,凋亡及抗凋亡蛋白因子表达影响,探讨细胞移植对SNHL损伤耳蜗细胞保护作用的部分机制。方法:（1）细胞培养:选取胎鼠作为移植细胞组织来源,对NSCs和OECs培养、形态观察及鉴定。（2）动物造模:采用庆大霉素对大鼠进行SNHL造模,将筛选出符合要求的大鼠随机分为实验组和对照组,每组10只,实验组予NSCs和OECs联合移植,对照组予输注人工外淋巴液代替细胞移植。（3）细胞移植:将荧光标记的NSCs和OECs通过圆窗植入耳蜗内,术后记录各组大鼠体重变化,检测大鼠ABR听力阈值变化和听觉耳动反射阈值,并采集样本检测。（4）耳蜗切片HE染色。（5）耳蜗免疫荧光染色检测移植后NSCs和OECs荧光标记物。（6）TUNEL法检测凋亡细胞阳性细胞数和MOD值。（7）免疫组织化学法检测神经营养因子及凋亡免疫阳性细胞。（8）Western-blot法检测样本BDNF、NT-3和Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达影响。结果:（1）细胞培养鉴定结果:NSCs染色鉴定标记物呈nestin阳性,OECs染色鉴定标记物呈p75NTR阳性,培养获得了纯度较高的细胞。（2）听觉耳动反射检测结果:实验组大鼠耳廓反射阈值改善,耳廓抖动变化增强,对照组改变不明显。（3）ABR阈值变化结果:与对照组比较,实验组在1周后ABR阈值变化不明显（P>0.05）,在2周后实验组ABR阈值变化升高（P<0.05）。（4）耳蜗免疫荧光染色结果:实验组移植后NSCs标记分化的细胞部分能表达神经元细胞标志物Nestin,OECs标记分化的细胞分能表部达OECs标志物p75NTR,对照组耳蜗未发现荧光标记的细胞。（5）HE染色结果:对照组见内、外毛细胞变性坏死,SGCs部分坏死,核萎缩,损伤明显,细胞空泡样变性,密度降低,排列疏松混乱不齐,实验组整体病理损伤减低。（6）TUNEL阳性细胞数检测结果:与对照组比较,实验组TUNEL阳性细胞数明显减少（P<0.05）,细胞凋亡指数占比减少,MOD值减少（P<0.05）。（7）免疫组化检测结果:与对照组比较,实验组BDNF和NT-3阳性细胞数及IOD值明显增多（P<0.05）,同时抗凋亡因子Bcl-2阳性细胞数及IOD值升高,促凋亡因子Bax、Caspase-3阳性细胞数及IOD值减少（P<0.05）。（8）Western-blot检测结果:与对照组比较,实验组耳蜗组织样本中BDNF、NT-3,Bcl-2蛋白表达水平升高,Bax、Caspase-3蛋白表达水平降低（P<0.05）。结论:（1）NSC联合OEC移植对SNHL大鼠耳蜗具有保护作用,能减轻耳蜗细胞的损伤。（2）NSC联合OEC移植可能通过调节神经营养因子的表达水平而参与了耳蜗细胞的保护过程。（3）NSC联合OEC移植可能通过上调抗凋亡蛋白Bcl-2,下调凋亡蛋白Bax、Caspase-3表达路径而参与了对SNHL耳蜗细胞凋亡的保护机制。
李玉琳[2]（2019）在《脉冲电磁场激励骨髓间充质干细胞修复脊髓损伤的实验研究》文中提出【目的】脊髓损伤（Spinal cord injury,SCI）是一种严重的创伤性疾患,会导致肢体感觉和运动功能障碍,致残率较高。目前,细胞移植治疗是脊髓损伤领域研究的热点。然而细胞移植治疗仍面临着很多的困难,如移植细胞在脊髓损伤局部的存活率低;在损伤后抑制性微环境中种子细胞的分化和迁移能力较差;免疫排斥反应以及伦理学问题等。本研究拟探讨不同强度的脉冲电磁场（Pulsed electromagnetic fields,PEMF）对骨髓间充质干细胞（Bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs）生物学活性的影响,并观察PEMF激励的BMSCs移植到SCI大鼠体内的治疗效果,并进一步探讨其潜在的生物学机制。【方法】1.体外实验:从Wistar大鼠体内提取、分离、纯化、培养BMSCs,并采用流式细胞技术进行细胞鉴定;观察不同强度PEMF对BMSCs活性、增殖能力的影响,选择最佳的激励强度;于细胞培养48h内分别采用25,50,75,100Hz（每天1次,每次1h,连续干预1-9天）干预强度进行细胞刺激,观察不同强度刺激下,细胞的活性、增殖能力情况,选择最佳的激励强度;采用Western-blot技术观察不同强度、不同刺激时长的PEMF激励BMSCs后,细胞分泌神经营养因子的水平。2.体内实验:采用Impactor model-Ⅱ打击器建立Wistar大鼠脊髓损伤模型,将大鼠随机分为4组,包括A组:实验对照组（行单纯椎板切除术）;B组:单纯损伤组（行脊髓损伤造模）;C组:BMSCs移植组（移植未经PEMF刺激的BMSCs治疗）、D组:OBMSCs（Optimal BMSCs）移植组（移植高活力BMSCs治疗）;将高活力的BMSCs移植入脊髓损伤大鼠体内,通过免疫组织化学方法观察移植的细胞在脊髓损伤局部的填充状态、活性、增殖能力情况,观察其对脊髓损伤局部组织学修复作用。并探索PEMF影响BMSCs存活、增殖能力与p75NTR-Trk信号通路的相关性;应用BBB评分评价大鼠运动功能恢复情况。数据采用统计学软件SPSS 18.0进行分析,数据以均数±标准差（Mean±SD）形式表示,显着性差异使用ANOVA testing计算,P<0.05被认为具有统计学意义。【结果】1.本实验完成对BMSCs的提取、分离、纯化、培养及鉴定。BMSCs的免疫表型为:CD29,CD90为阳性,CD34,CD45为阴性,符合BMSCs的表型特征,并且细胞中无造血系统的细胞污染;2.50Hz强度的PEMF,每天刺激1h,持续9天,BMSCs的活性明显高于25Hz、75Hz及100Hz组,本研究将50Hz,1h/d,9d作为最佳的激励强度,制备高活力种子细胞;体外实验WB检测结果发现,PEMF激励后的骨髓间充质干细胞BDNF及NGF的表达水平显着高于对照组（p<0.05）,NT-3的表达水平有上升趋势,与对照组比较差异无统计学意义（p>0.05）;3.体内实验发现,OBMSCs组大鼠SCI损伤局部脊髓空洞的面积显着小于对照组（p<0.05）,且NF200阳性面积显着高于对照组（p<0.05）,GFAP阳性面积显着低于对照组（p<0.05）;WB检测结果发现,OBMSCs组BDNF的表达水平显着高于对照组（p<0.05）,同时OBMSCs组NGF的表达水平呈上升趋势,较对照组差异无统计学意义（p>0.05）;在细胞移植3周后,OBMSCs组大鼠BBB功能评分显着高于对照组（p<0.05）;WB检测结果发现,OBMSCs组的p75NTR、TrkA、TrkB及TrkC表达水平显着高于对照组（p<0.05）,差异均具有统计学意义。【结论】本研究成功分离培养了BMSCs,PEMF在50Hz,1h/d,持续刺激9d的激励强度下,BMSCs表达最高的生物学活性,并表达高水平的BDNF和NGF。将高活力的BMSCs移植到大鼠SCI模型后,大鼠损伤局部脊髓空洞形成明显减少,且促进了神经元的存活和神经营养因子的表达,减少了胶质瘢痕的形成,同时大鼠运动功能得到了显着的改善。此外,OBMSCs组p75NTR、TrkA、TrkB及TrkC的表达显着增高,这可能提示了OBMSCs移植修复SCI的潜在信号通路和调控机制。
桂飞[3]（2019）在《Neuritin对长爪沙鼠耳蜗螺旋神经节损伤的保护作用》文中研究说明目的:耳蜗螺旋神经节（spiral ganglion neurons,SGNs）能够将毛细胞接收到的声音信号传递至听觉中枢并产生听力,其数量和功能对于维持正常听功能具有重要意义。受限于有限的再生能力,SGNs损伤后很难自发再生并恢复原有功能,各种神经营养因子在此过程中发挥重要作用。神经突起生长因子Neuritin是一种与神经可塑性密切相关的神经营养因子,本课题组前期研究发现其在促进毛细胞转分化再生方面具有重要作用,并可保护神经纤维免于毛细胞缺失所致的继发性损伤,说明其在维持SGNs存活及功能方面具有潜在重要作用。基于上述研究基础,本研究旨在利用长爪沙鼠筛选并建立耳蜗螺旋神经节特异性损伤所致的感音神经性耳聋模型,探究其在保护受损耳蜗SGNs,修复受损听神经功能中的作用,为SGNs缺失导致的感音神经性耳聋的防治提供新的研究策略和科学依据。方法:1、取不同发育时期的耳蜗组织,用qPCR和WB方法,从分子水平检测Neuritin的表达变化;冰冻切片后,用免疫荧光法,检测Neuritin的表达定位,明确Neuritin在长爪沙鼠耳蜗发育各阶段的表达变化。2、选择3种耳毒性药物（卡那霉素和呋塞米联用、新霉素、哇巴因）造模,通过ABR检测和组织形态学分析,筛选并鉴定出长爪沙鼠耳蜗SGNs特异性损伤的耳聋模型,并探究耳聋发生发展过程中Neuritin的表达变化,明确其表达与该耳聋模型的相关性。3、组织水平,建立乳鼠Corti组织的体外培养体系,使用哇巴因损伤SGNs的同时加入不同浓度的Neuritin蛋白,探究其对受损耳蜗SGNs的保护作用。动物水平,利用方法2中确定的损伤模型,经圆窗滴注不同剂量的Neuritin蛋白,通过ABR检测和组织水平分析,综合评价Neuritin对受损听功能的修复效果。结果:1、检测发现,Neuritin在长爪沙鼠耳蜗不同发育阶段均有表达,胚胎期第20天（E20）表达量较低,出生后1-56天（P1-56）表达持续升高;其表达主要分布于SGNs和Corti器区域。2、不同药物建模结果显示,仅低浓度哇巴因（1mM）可引起耳蜗SGNs特异性缺失,且伴听力阈值显着上升,最终选定此条件进行损伤模型的建立;进一步研究发现,损伤后耳蜗中Neuritin表达下调,表明Neuritin的表达与该模型具有相关性,且呈负相关。3、体外研究显示,Neuritin（16μg/mL）组和Neuritin（32μg/mL）组每100μm2 SGNs的数量分别为13.2±1.2和16±2.6,显着高于损伤组的7.3±2.2;每100μm神经纤维的数量分别为8.2±1.1和11.6±1.5,也显着高于损伤组的4.6±1.1,且排列更为整齐;各组毛细胞均不受影响。动物水平结果显示,在哇巴因损伤的同时经圆窗滴注Neuritin蛋白可促进部分听功能的恢复,表现为Neuritin（16μg）组高频区16kHz和32kHz听力阈值分别为32.5±8.9dB,61.3±3.5 dB,显着低于损伤组的48.3±16.0 dB,85±5.5 dB;Neuritin（32μg）组高频区8kHz、16kHz和32kHz听力阈值分别为25±10.7 dB,31.3±9.9 dB,55±5.3dB,均显着低于损伤组。组织形态学检测显示,Neuritin处理组中耳蜗中底回螺旋神经节细胞及神经纤维的数量较损伤组显着增多,与功能检测的结果一致。结论:1、Neuritin在长爪沙鼠耳蜗发育过程中均有表达,尤其在幼年至成年阶段,且主要表达在耳蜗SGNs及Corti区域;2、低浓度哇巴因（1mM）诱导的长爪沙鼠耳蜗SGNs特异性缺失模型,为本研究选定的最佳动物模型,在该模型中Neuritin的表达与SGNs的损伤呈负相关关系;3、体外和体内研究表明,Neuritin剂量依赖性地维持了受损长爪沙鼠耳蜗螺旋神经节细胞及神经纤维的数量及排列,有效促进了高频损伤区域的听功能恢复。
刘骁[4]（2019）在《OTOF基因突变所致耳聋患者来源iPSC的建立与基因矫正》文中认为耳聋是世界性公共卫生问题。耳蜗毛细胞和听神经损伤或功能异常引起的感音神经性聋（sensorineural hearing loss,SNHL）是造成不可逆性听力损失的主要疾病。助听器和人工耳蜗植入技术虽然可以在一定程度上补偿听力,但是,对于SNHL疾病本身,仍然缺乏理想的对因治疗方法。诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPSC）技术可将多种体细胞进行重编程,使其具有与胚胎干细胞相似的分化潜能。iPSC在一定条件下体外可定向分化为听祖细胞、毛细胞样细胞及螺旋神经节神经元（spiral ganglion neurons,SGN）样细胞,可移植回体内,取代原有损伤或功能异常细胞。这项技术为SNHL的治疗提供了新思路。基因缺陷是先天性重度和极重度SNHL主要致病因素。利用基因编辑技术可对有明确基因缺陷的SNHL患者来源iPSC进行基因矫正。因此,诱导性多能干细胞技术和基因编辑技术的结合似乎使这类SNHL的生物治疗成为可能。听神经病谱系障碍（auditory neuropathy spectrum disorder,ANSD 或称为听神经病）是一类听力学表现为耳声发射和/或耳蜗微音电位正常,但听性脑干反应引不出或明显异常的特殊类型SNHL。OTOF基因突变是先天性ANSD的常见病因。利用基因编辑技术对ANSD患者来源iPSC中突变的OTOF基因进行矫正,可成为ANSD干细胞移植治疗和基因治疗研究的重要途径。此外,OTOF基因突变ANSD患者来源iPSC本身也可作为细胞模型,在体外模拟ANSD发病过程,用于OTOF基因突变致病机制的研究。因此,本文将报告1例OTOF基因突变ANSD病例,将该病例患者来源的成纤维细胞重编程为iPSC,并尝试利用CRISPR/Cas9技术对iPSC中OTOF基因突变进行矫正。论文分为以下三个部分。第一部分,报告1例ANSD病例。经分子诊断明确,该例ANSD是由于OTOF基因复合杂合突变（c.2122C>T/c.519 7G>A,NM194248）所致。该病例接受了Nucleus CI24 Contour Advance人工耳蜗植入手术。术中及术后开机时神经电反应遥测（neural response telemetry,NRT）结果显示,所有22个耳蜗内电极导联均可引出明确的电刺激诱发复合动作电位（electrically.evoked compound action potential,ECAP）波形。与7例年龄和听力损失严重程度相近的典型SNHL病例的NRT结果比较,发现该ANSD病例术中ECAP阈值（t-NRT值）与典型SNHL病例接近,但术后开机时t-NRT值相对较低。提示OTOF基因突变ANSD病例听神经功能完成,术后开机时可能听神经敏感性更高。第二部分,构建OTOF基因突变ANSD病例患者来源iPSC。通过将五个关键转录因子:OCT3/4,SOX2,KLF4、L-MYC和LIN28,导入患者来源成纤维细胞,诱导其重编程,最终得到碱性磷酸酶染色阳性、表达多能干细胞特异性标志基因和蛋白、具有体外三胚层分化潜能、符合国际公认标准的iPSC。经Sanger测序验证,获得的iPSC基因型为OTOF基因复合杂合突变（c.2122C>T/c.5197G>A）。采用单层贴壁法在体外将iPSC向SGN样细胞诱导分化,获得的细胞表达SGN特异性标志基因和蛋白,提示获得的iPSC具有定向诱导分化为内耳细胞的潜能,是体外模拟ANSD发病过程及研究OTOF基因突变致病机制的理想细胞模型。第三部分,利用CRISPR/Cas9介导同源重组修复对iPSC中OTOF基因突变进行矫正。通过CRISPR/Cas9打靶载体与单链寡核苷酸（single-stranded donor oligonucleotide,ssODN）同源重组模板共转染、药物筛选、挑单克隆、Sanger测序与酶切验证,最终得到2株OTOF基因c.2122C>T位点被纯合矫正的iPSC。对8个有较高脱靶概率的位点进行检测,未发现脱靶。CRISPR/Cas9技术对患者来源iPSC中OTOF基因特定突变位点进行精确修复具有可行性,可成为ANSD基因治疗的新途径。总之,OTOF基因突变ANSD病例的听神经功能完整,是人工耳蜗植入手术治疗的理想适应症。OTOF基因突变ANSD患者来源iPSC可体外定向分化内耳细胞,用于模拟ANSD发病过程及OTOF基因突变致病机制的研究。利用CRISPR/Cas9技术可实现对iPSC中OTOF基因突变的精确修复,使得这类ANSD病因治疗成为可能。
曾华沙[5]（2018）在《利用CRISPR/Cas9技术建立OSBPL2基因敲除耳聋巴马小型猪模型》文中研究指明背景:耳聋是一种常见的感知性障碍疾病。据统计,全世界3.6亿人受到不同程度耳聋的困扰,约1/1000的新生儿为耳聋患儿,遗传性耳聋占一半以上。其中,非综合征型耳聋（NSHL）约占遗传性耳聋的70%。在本课题组的前期研究中,首次在一个中国遗传性耳聋大家系中定位和克隆了一个新的常染色体显性NSHL（DFNA67）相关致病基因OSBPL2,其编码的氧化固醇结合蛋白样蛋白2（oxysterol binding protein like-2 protein）与氧化固醇结合蛋白（Oxysterol binding protein,OSBP）具有较高同源性,属于OSBP相关蛋白（OSBP-related proteins,ORPs）家族成员。ORP家族是一类与氧化固醇具有高度亲和力的受体蛋白,在细胞内的脂质合成、转运及信号转导过程中发挥重要作用。本研究将利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建OSBPL2突变的耳聋巴马小型猪模型,进一步探索OSBPL2突变的致聋机制。目的:采用CRISPR/Cas9技术建立猪胎儿成纤维细胞（PFFs）OSBPL2敲除的细胞系;以OSBPL2敲除的PFFs细胞系作为体细胞核移植的供体,采用体细胞核移植和胚胎移植技术构建OSBPL2基因缺陷的巴马小型猪模型;在模型动物水平验证基因型与表型的相关性,探讨OSBPL2功能缺陷以及合并高脂饮食干预的条件下血脂参数、听力学和内耳形态学的变化规律。方法:（1）人和猪的OSBPL2基因的生物信息学分析:比对人和猪的OSBPL2基因的序列,采用生物信息学方法对猪与人的OSBPL2基因进行共线性和同源性分析;采用Chou-Fasman算法和Swiss Model在线工具预测并分析人与猪OSBPL2蛋白的二级结构和三级结构。（2）OSBPL2敲除PFFs细胞系的构建:设计合成靶向猪OSBPL2基因第5、6外显子的单导向RNA（single guide RNA,sg RNA）,构建CRISPR/Cas9打靶质粒,将重组质粒与具有Neo抗性基因的p CMVtd-Tomato质粒共转染入巴马猪胎儿原代PFFs中,使用遗传霉素G418筛选,获得单克隆细胞,以单克隆细胞的基因组为模板,PCR扩增后进行TA克隆,测序验证单克隆细胞的基因型,筛选OSBPL2双等位基因敲除的单克隆细胞系。（3）OSBPL2敲除的巴马小型猪模型的构建:采用体细胞核移植和胚胎移植技术,获得OSBPL2缺陷的巴马猪小型模型,提取小猪耳组织的基因组DNA,PCR扩增后进行TA克隆后测序,鉴定OSBPL2敲除巴马小型猪的基因型,Western blotting检测巴马小型猪组织中OSBPL2蛋白的表达,免疫组化对OSBPL2在巴马小型猪耳蜗组织中的表达进行定位。（4）听力学与内耳形态学分析:听性脑干反应（ABR）定期检测猪的听力阈值变化;耳蜗组织经石蜡包埋、切片,采用HE染色观察耳蜗形态学变化。（5）血脂生化分析:对基因敲除的巴马猪断奶,另购买5头相同月龄野生型巴马猪,正常饲料喂养一月后分敲除组（KO-C:4头）、敲除-高脂组（KO-H:4头）和野生型高脂组（WT-H:5头）,分别圈养。定期检测总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）水平,同时观察主动脉和冠状动脉的动脉粥样硬化斑块的形成。结果:（1）猪与人的OSBPL2基因及其侧翼序列存在高度共线性,二者氨基酸序列一致性达88%,蛋白同源性较高。且两者蛋白二级结构具有近似等量的α螺旋,β折叠以及β转角结构,蛋白三维建模结构相似度高,均含有严格保守的OSBP指纹特征基序“EQVSHHPP”。（2）根据猪的OSBPL2基因序列,设计合成针对OSBPL2第5、6外显子的两对sg RNAs,构建两个打靶质粒,转染巴马猪原代PFFs细胞。经T7EN1酶系统鉴定,剪切效率分别为11.4%（第5外显子）和0%（第6外显子）,用靶向第5外显子的质粒筛选冻存的细胞克隆35个,最终鉴定获得双等位基因突变的细胞克隆19个,基因突变效率为54.29%。（3）采用体细胞核移植和胚胎移植技术,共移植受体猪8头（8月龄长白猪）,怀孕3头。其中一头在怀孕37天时,剖出37天大的胎猪14只,制备原代PFFs细胞,鉴定其基因型全部为OSBPL2双等位基因敲除;另两头怀孕足月,分别自然生产4头与6头小猪（其中一头四肢与口唇畸形,当天处死取材）,鉴定基因型均为双等位基因敲除,且与相应供体的细胞基因型相符;Western blotting检测显示,克隆小猪的脑、肾组织未检测到OSBPL2蛋白的表达。OSBPL2在巴马小型猪的耳蜗中主要表达定位在螺旋神经节、血管纹和基底膜中。（4）出生的克隆猪在断奶一月后定期进行听力学检测。与同月龄的野生型巴马小型猪的听力阈值（4060 d B SPL）相比,KO-C组与KO-H组小猪均呈现渐进性的听力损失,且KO-H组的听力下降尤为明显（4月龄时,听力阈值均在100 d B SPL以上,表现为重度耳聋）。耳蜗HE染色未发现明显的内耳组织形态学改变。（5）KO-C组与KO-H组的小猪均出现肥胖表型,且血脂参数异常,特别是KO-H组的TC和LDL升高明显;苏丹染色显示KO-H组的胸主动脉和腹主动脉可见明显的斑块,而WT-H组和KO-C组的相应动脉未见明显病变。结论:采用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建得OSBPL2基因敲除的巴马小猪模型,并表现出血脂参数异常和听力损失双重表型。且高脂饮食干预加速耳聋表型的发生。本研究为进一步探索OSBPL2的功能及其突变致病效应奠定了良好基础,为脂代谢紊乱与听力损失的相关性提供了实验证据,并为遗传性耳聋的预防与诊疗奠定了理论基础。
胡海霞[6]（2017）在《Efr3a敲减减轻耳蜗螺旋神经元退化变性的研究》文中研究说明目的:探索Efr3a基因敲减能否减轻小鼠耳蜗螺旋神经元及耳蜗神经末梢的退化变性,并初步探索其作用机制。方法:首先以8-10周Efr3a基因敲减（Efr3a KD）及其同窝野生型（WT）小鼠为研究对象,采用卡那霉素联合呋塞米给药破坏其耳蜗毛细胞,取给药后不同时间点行ABR检测,应用耳蜗基底膜铺片免疫荧光染色及半薄切片甲苯胺蓝染色对两组小鼠耳蜗毛细胞、螺旋神经元（SGNs）及其神经末梢（ANFs）进行计数并比较,同时采用透射电镜观察SGNs及ANFs超微结构变化,测量SGN胞体面积、圆度以及胞质内脂褐素面积比例以比较两组小鼠SGN退化变性程度;以同龄Efr3a KD、Efr3a转基因（Efr3a OE）以及WT小鼠作为动物模型,ABR方法检测2,6,8,10,12,14月龄小鼠的听功能变化,分别采用免疫荧光染色及半薄切片计数比较三组小鼠6,10,14月龄耳蜗毛细胞及SGN密度的变化及差异。最后采用real time PCR,RT-PCR以及Western Blotting检测并比较成年Efr3a KD小鼠及同窝WT小鼠耳蜗内神经营养因子NGF、BDNF、NT-3及其受体Trk A、Tkr B、Trk C的表达量。结果:Efr3a基因敲减并未影响成年小鼠在各个频率的ABR阈值,在给药后5d,所有小鼠的听阈在各个频率均明显升高,在8k Hz及12k Hz,Efr3a KD小鼠的ABR阈值较WT小鼠低;给药后30d及60d时,Efr3a KD小鼠耳蜗SGNs及ANFs的损失程度较同窝WT小鼠明显为轻。随着给药后时间的延长,SGN核周体面积及圆度逐渐降低,胞质内脂褐素样物质面积比例逐渐增加。2月龄时,Efr3a KD、Efr3a OE以及WT小鼠ABR阈值无明显差异,至10及12月龄时,Efr3a KD小鼠ABR阈值明显低于WT及Efr3a OE小鼠;10月龄、14月龄时,Efr3a KD小鼠的SGN残存数和密度明显高于WT及Efr3a OE小鼠。分子生物学检测显示,神经营养因子BDNF、NT-3及Trk B在mRNA及蛋白表达水平均较同窝WT小鼠明显为高。结论:Efr3a基因敲减能减轻耳蜗螺旋神经元及其神经末梢的退化变性,其机制有可能与增高了一些神经营养因子及其受体的表达有关。
朱光洁[7]（2017）在《Pou4f3基因突变小鼠的模型建立及听力学机制研究》文中提出[目的]POU4F3基因突变可引起人类DFNA15非综合征型遗传性耳聋,是临床较为常见的渐进性语后聋。目前该疾病的临床病理机制仍不清楚,亦无有效的预防及靶向性疗法。本课题完全模拟首次发现的犹太裔DFNA15耳聋家系的基因突变序列构建Pou4f3变小鼠模型,明确DFNA15遗传性聋的病理组织学及分子生物学发病机制,为该种疾病的防治及临床药物疗法奠定实验研究基础。[方法]利用转基因敲入技术构建Pou4f3二个外显子末端8个碱基对缺失的突变小鼠,对纯化背景后经基因型鉴定明确三种基因型小鼠（纯合突变型Pou4f3△/△、杂合突变型Pou4f3△/+及野生型对照Pou4f3/+）进行了一般外观及行为学观察、听功能及前庭功能检测、内耳组织病理学分析、下游靶基因的检测及应用突变后正调控的靶基因拮抗剂药物进行治疗研究。在前期对5周至17月龄小鼠行听功能检测的基础上又主要分析了 I波幅值的变化并且将突变小鼠听功能随年龄变化趋势同临床资料进行比较;完善小鼠的内耳组织学病理表型分析。应用免疫荧光及免疫印迹方法完善内耳组织下游基因的蛋白水平检测。同时依据其分子致病机制,进行了靶向性药物的动物实验研究,分析给药前后的听功能及内耳组织分子生物学变化。[结果]将小鼠ABR阈值与DFNA15犹太裔H耳聋家系患者临床资料对比,结果显示:Pou4f3△/+小鼠随着年龄增长,ABR阈值呈进行性缓慢增长,与耳聋家系中患者的纯音测听阈值升高进程基本一致,该听功能检测结果反应本实验中构建的小鼠模型能够比较贴切地模拟人类DFNA15疾病。内耳组织形态学观察可见Pou4f3△/+耳蜗内毛细胞静纤毛融合、异常增生延长;外毛细胞局部缺失,纤毛束较正常变稀疏。同时透射电镜中内外毛细胞中均出现线粒体水肿、空泡化现象。我们还检测到Pou4f3△/+耳蜗Espin的表达较对照组异常增多。同时应用了 Espin的抑制剂对二乙氨基苯甲醛（DEAB）行2月龄Pou4f3△/+小鼠听力挽救实验,结果显示给予抑制剂后听功能下降减缓,耳蜗组织Espin的表达较对照给药组下降。[结论]通过听功能检测,本研究中构建的Pou4f3△/+小鼠能够作为人类DFNA15疾病的良好的动物模型,有助于对该疾病发病机制及防治疗法的深入研究。研究发现Pou4f3△/+小鼠内外毛细胞纤毛及线粒体的形态异常,从而可能影响内外毛细胞对声音处理及传输的功能,导致了渐进性的听功能下降,为DFNA15提供可能的内耳形态学病理机制。进一步研究表明由于转录因子POU4F3突变,影响下游Espin的表达,进而可能导致内毛细胞出现纤毛融合、异常增生延长,是引起听功能下降的重要成因。Espin的抑制剂对二乙氨基苯甲醛对Pou4f3△/+小鼠听功能的挽救为临床实施靶向性药物开发与研究奠定坚实的基础。同时本研究构建的Pou4f3△/+小鼠为人类DFNA15疾病筛选得到更好的靶向性治疗药物研究提供了理想的动物模型。
蒋凤[8]（2016）在《BDNF及NT-3的混合液对耳蜗螺旋神经节细胞的影响》文中进行了进一步梳理[目的]建立选择性损伤耳蜗螺旋神经节细胞（Spiral Ganglion Cells,SGCs）的动物模型,研究耳蜗SGCs受损后脑源性神经生长因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）、神经营养因子-3（Neurotrophin-3,NT-3）及其两者的混合液对耳蜗SGCs的保护作用,对比三者保护作用的异同,观察细胞密度、形态的变化以及对细胞器的影响。为临床上寻找有效保护螺旋神经节细胞的药物提供依据。[方法]将听力正常的雄性蒙古沙鼠随机分成A、B、C、D四组。A组的左耳圆窗膜滴注人工外淋巴液,右耳滴注80umol/L哇巴因,建立选择性损伤耳蜗SGCs的动物模型。在滴注哇巴因的基础上于B、C、D组的蒙古沙鼠左右耳圆窗膜上再滴注人工外淋巴液或BDNF溶液或NT-3溶液或两者的混合液,缝合切口,饲养7天后处死,立即取出耳蜗,制作病理切片进行HE染色,对比观察同组别左耳和右耳耳蜗I型螺旋神经节细胞的数目和形态的改变,对耳蜗SGCs计数并进行统计学分析；制作电镜切片,在透射电镜下观察细胞的超微结构。[结果]形态学观察发现：哇巴因组与人工外淋巴液组比较,耳蜗SGCs形态变化较大,细胞器明显受损；在滴注哇巴因的基础上,再滴注BDNF或NT-3或两者的混合液后,耳蜗SGCs损伤的程度较哇巴因组明显减轻,而且滴注两者的混合液比单独滴注BDNF或NT-3的耳蜗SGCs的形态更完整。统计学发现：D1组（即哇巴因-人工外淋巴液组）和D2组（即哇巴因-BDNF+NT-3组）的相同R管区的SGCs密度比较,P值均小于0.05,差异有统计学意义,且D1<D2。[结论]于蒙古沙鼠耳蜗圆窗膜滴注80μmol/L的哇巴因可导致耳蜗SGCs及其神经纤维的损伤：出现细胞肿胀或固缩,胞浆空泡化,细胞核固缩或溶解,神经突缩短或断裂,有髓神经纤维的髓鞘溶解或空泡化。BDNF和NT-3的混合液对哇巴因损伤后的耳蜗SGCs具有一定的保护作用,形态学观察发现,其保护作用较单独使用BDNF或NT-3时更显着。
刘武夷[9]（2014）在《神经营养素-3对兔桡骨骨折愈合影响的观察》文中认为目的：通过对三组家兔桡骨骨折模型骨折愈合速度、程度与NT-3（神经营养素-3）在骨折断端的含量表达变化的观察,明确NT-3是否利于骨折的愈合,为骨科临床应用提供实验依据。方法：选用新西兰兔72只,随机分为三大组,每组24只（n=24）,分别为A组（骨折+盐水注射组）、B组（骨折+NT-3注射组）、C组（脑外伤伴骨折+盐水注射组）。各组在建立骨折模型后分别于术后即时、24h、第3日、第6日在大腿外侧股四头肌处予以注射,于第1、2、3、4周在每大组中随机抽取一小组（n=6）抽取耳源静脉血液检测碱性磷酸酶（ALP）含量,抽血后随即处死动物（第3、4周在动物处死前予以X线拍片）。动物处死后切取骨折断端组织,分别予以HE染色观察骨痂愈合程度,免疫组织化学染色观察NT-3在断端间的表达变化,所得数据用SPSS17.0软件进行分析后统计学处理。结果：1.X片观察：术后第3周骨折部位愈合程度对比C组快于B组,A组最慢,术后第4周此表现更明显。2.碱性磷酸酶：三组含量随周数递增,A组趋势平缓,B、C组增幅较大,以C组明显,组间对比有统计学意义（p<0.05）。3.HE染色镜下观察：A组表现为一般的骨折愈合过程,B组反应性增生明显,骨组织形成过程加快,而C组骨折愈合过程最快。4.免疫组织化学染色法分析：A组的NT-3阳性面积率及OD值在于骨折后数周内,整体表现较为平稳。B组的NT-3阳性面积率及OD值在骨折第1周时最高,随周数递减。C组的NT-3阳性面积率及OD值于骨折后第3周时为高峰。组间比较：第1W组间比较B组最高,与AC两组比有统计学意义（p<0.05）,而AC组间比较无统计学意义（p>0.05）,第2、3W两两比较有统计学意义（p<0.05）,从均值可以看出A<B<C。第4WA、B组间没有统计学意义（p>0.05）,其他组间有统计学意义（p<0.05）。结论：NT-3对兔骨折的愈合有促进作用。
王美兰[10]（2014）在《NT-3对哇巴因损伤耳蜗螺旋神经节细胞后的影响》文中提出目的：建立畦巴因选择性损伤蒙古沙鼠耳蜗螺旋神经节细胞的动物模型,在此基础上研究耳蜗螺旋神经节细胞损伤后,神经营养因子-3对耳蜗螺旋神经节细胞的保护作用,并研究探讨其神经保护作用机理。方法：将听力正常的雄性蒙古沙鼠,手术暴露圆窗膜,用80umol/L哇巴因滴注于蒙古沙鼠耳蜗圆窗膜上,建立选择性损伤螺旋神经节细胞的动物模型。在成功建模的基础上于蒙古沙鼠圆窗膜上滴注神经营养因子-3（15ug/ml）,稳定7天后处死,立即取出耳蜗,制作病理切片进行HE染色,观察Ⅰ型螺旋神经节细胞数目、形态的改变,并用人工计数法采用SPSS17.0软件进行统计学分析；制作电镜切片,在透射电镜下观察细胞的超微结构,分析神经营养因子-3对Ⅰ型螺旋神经节细胞的保护作用。结果：本实验用哇巴因成功建立了选择性损伤螺旋神经节细胞的动物模型,发现哇巴因对Ⅰ型螺旋神经节细胞有明显的损伤作用,损伤部位主要位于细胞膜周围髓鞘组织、细胞核及线粒体,哇巴因组细胞计数较人工外淋巴液组明显减少（P<0.05）；神经营养因子-3对Ⅰ型螺旋神经节细胞的细胞膜周围髓鞘组织、线粒体及细胞核均有保护作用,在保护组细胞计数明显高于对照组（P<0.05）。结论：哇巴因损伤蒙古沙鼠Ⅰ型螺旋神经节细胞后,经圆窗膜滴注神经营养因子-3（NT-3）对Ⅰ型螺旋神经节细胞有一定的保护作用。对于临床上寻找保护耳蜗听神经细胞的有效药物及给药途径具有重要的价值。
二、内耳相关性BDNF和NT-3的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、内耳相关性BDNF和NT-3的研究进展（论文提纲范文）
（1）NSC联合OEC移植对SNHL模型大鼠耳蜗细胞凋亡的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要操作仪器 |
| 2.1.4 主要溶剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 组织来源、细胞提取和培养 |
| 2.2.2 NSCs的传代培养 |
| 2.2.3 OECs培养 |
| 2.2.4 NSCs的鉴定及细胞纯度的计算 |
| 2.2.5 OECs的鉴定及细胞纯度的计算 |
| 2.2.6 细胞活力测定 |
| 2.2.7 细胞冻存 |
| 2.2.8 细胞复苏 |
| 2.3 动物实验及样本检测 |
| 2.3.1 实验动物 |
| 2.3.2 主要试剂 |
| 2.3.3 主要仪器 |
| 2.3.4 主要试剂配制 |
| 2.3.5 庆大霉素耳毒性大鼠模型的建立方法 |
| 2.3.6 实验动物分组及给药 |
| 2.3.7 ABR检测大鼠听力阈值 |
| 2.3.8 听觉耳动反射检测 |
| 2.3.9 制作切片 |
| 2.3.10 切片染色 |
| 2.3.11 耳蜗免疫荧光染色 |
| 2.3.12 TUNEL法(原位切口末端标记法)检测凋亡细胞 |
| 2.3.13 免疫组织化学法检测神经营养因子及凋亡免疫阳性细胞 |
| 2.3.14 Western-blot法检测样本BDNF、NT-3和Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达 |
| 2.4 统计方法 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 细胞的形态观察及鉴定 |
| 3.1.1 NSCs的培养观察及鉴定 |
| 3.1.2 OECs的培养观察和鉴定 |
| 3.2 各组大鼠体重变化结果 |
| 3.3 大鼠听觉耳动反射检测阈值结果 |
| 3.4 各组大鼠ABR阈值变化结果 |
| 3.5 HE染色结果 |
| 3.6 耳蜗免疫荧光染色观察结果 |
| 3.6.1 耳蜗荧光标记NSC结果 |
| 3.6.2 荧光标记OEC观察结果 |
| 3.7 TUNEL法检测凋亡细胞结果 |
| 3.7.1 各组TUNEL阳性细胞数比较 |
| 3.7.2 各组MOD值比较 |
| 3.8 免疫组化检测结果 |
| 3.9 Western-blot检测各组蛋白表达水平结果 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 实验性感音神经性耳聋动物模型的制备与机制探究 |
| 4.2 神经营养因子减轻SNHL内耳神经损伤后相关机制 |
| 4.2.1 BDNF对 SGNs的保护作用机制探究 |
| 4.2.2 NT-3对SGNs的保护作用机制探究 |
| 4.3 细胞移植抑制耳蜗损伤细胞凋亡机制探索 |
| 4.3.1 Caspase结构、功能与促耳蜗细胞凋亡机制探究 |
| 4.3.2 Bcl-2 结构、功能和抗耳蜗细胞凋亡机制探析 |
| 4.3.3 细胞联合移植激活Bcl-2,抑制Caspase、Bax表达路径保护损伤耳蜗细胞探究 |
| 4.4 细胞联合移植上调神经营养因子,抑制细胞凋亡 |
| 4.5 神经性耳聋常见病因概述 |
| 4.6 神经性耳聋治疗方法概述 |
| 4.7 关于NSC和 OEC的取材、培养与鉴定探究 |
| 4.7.1 NSC的组织取材和分离 |
| 4.7.2 NSC的培养和鉴定方法选择 |
| 4.7.3 OECs的组织取材和分离 |
| 4.7.4 OECs的培养与鉴定选择 |
| 第5章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（2）脉冲电磁场激励骨髓间充质干细胞修复脊髓损伤的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、骨髓间充质干细胞分离和培养 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验材料和器械 |
| 1.1.2 实验方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 细胞形态观察 |
| 1.2.2 BMSCs细胞流式细胞仪鉴定 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 间充质干细胞的特点 |
| 1.3.2 骨髓间充质干细胞的分离和培养 |
| 1.3.3 骨髓间充质干细胞的应用 |
| 1.4 小结 |
| 二、PEMF激励BMSCs制备高活力种子细胞 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 选择最佳脉冲电磁场强度 |
| 2.2.2 观察干预后神经营养因子表达水平 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 脉冲电磁场在医学领域的应用 |
| 2.3.2 神经营养因子的生物学作用 |
| 2.4 小结 |
| 三、高活力BMSCs移植修复脊髓损伤的实验研究 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 行为学观察 |
| 3.2.2 组织学修复情况 |
| 3.2.3 WB检测结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 脊髓损伤的机制探讨 |
| 3.3.2 细胞移植治疗SCI相关机制 |
| 3.4 小结 |
| 四、高活力BMSCs移植修复脊髓损伤的机制研究 |
| 4.1 对象和方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 观察各组p75NTR-Trk蛋白表达水平 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 附录 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）Neuritin对长爪沙鼠耳蜗螺旋神经节损伤的保护作用（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 研究的目的及意义 |
| 1.2 国内外研究的现状 |
| 1.3 研究的主要内容 |
| 1.4 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 主要试剂耗材 |
| 2.3 主要仪器设备 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 引物的设计 |
| 2.4.2 耳蜗样本的制备 |
| 2.4.3 蛋白质免疫印迹(Western Blot) |
| 2.4.4 荧光定量PCR检测 |
| 2.4.5 耳蜗冰冻切片的制备 |
| 2.4.6 Neuritin在不同发育阶段长爪沙鼠耳蜗中表达免疫组织化学染色检测 |
| 2.4.7 听性脑干反应(ABR)检测 |
| 2.4.8 感音神经性耳聋的建立 |
| 2.4.9 给予外源性Neuritin干预处理方法 |
| 2.4.10 统计学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 重组人神经突起神经生长因子在不同发育阶段长爪沙鼠耳蜗中的表达 |
| 3.1.1 Neuritin在长爪沙鼠耳蜗不同发育阶段中的表达 |
| 3.1.2 Neuritin在成年长爪沙鼠耳蜗中免疫荧光染色定位 |
| 3.2 神经性耳聋动物模型的建立及重组人神经突起生长因子在耳聋发展过程中的表达变化 |
| 3.2.1 长爪沙鼠的正常听功能检测 |
| 3.2.2 卡那霉素和呋塞米联用全身给药造模后鉴定结果 |
| 3.2.3 新霉素经圆窗局部给药造模后鉴定结果 |
| 3.2.4 哇巴因经圆窗局部给药造模后鉴定结果 |
| 3.2.5 哇巴因损伤后长爪沙鼠耳蜗Neurtin的表达变化 |
| 3.3 重组人Neuritin对长爪沙鼠耳蜗螺旋神经节细胞损伤保护作用的研究 |
| 3.3.1 重组人Neuritin对受损耳蜗螺旋神经节细胞的保护作用(体外) |
| 3.3.2 重组人Neuritin对受损耳蜗螺旋神经节细胞的保护作用(体内) |
| 4 讨论 |
| 4.1 神经营养因子的表达变化 |
| 4.2 特异性SGNs受损的神经性耳聋模型的建立及鉴定 |
| 4.3 Neuritin与哇巴因引起神经性耳聋的相关性 |
| 4.4 重组人Neuritin蛋白量效关系的确立 |
| 4.5 神经营养因子对耳蜗螺旋神经节的保护作用 |
| 4.6 重组人Neuritin对听功能保护作用的探讨 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
（4）OTOF基因突变所致耳聋患者来源iPSC的建立与基因矫正（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩写表 |
| 1 前言 |
| 2 第一部分: OTOF墓因突变所致听神经病谱系障碍1例报告 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 病例报告 |
| 2.3 人工耳蜗神经反应遥测 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 第二部分: OTOF基因突变所致听神经病谱系障碍患者来源IPSC的建立 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 第三部分: OTOF基因突变IPSC的基因矫正 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附件 |
| 作者简历 |
| 在读期间发表的文章 |
（5）利用CRISPR/Cas9技术建立OSBPL2基因敲除耳聋巴马小型猪模型（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验仪器与材料 |
| 1.1 实验仪器 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验材料 |
| 1.4 实验试剂配制 |
| 2 实验方法与步骤 |
| 2.1 人/猪OSBPL2生物信息学分析 |
| 2.2 OSBPL2敲除巴马小型猪成纤维细胞系的建立 |
| 2.3 OSBPL2敲除巴马小型猪模型建立 |
| 2.4 OSBPL2敲除巴马小型猪表型检测 |
| 结果 |
| 1 人/猪OSBPL2生物信息学分析 |
| 1.1 人/猪OSBPL2基因同线性及氨基酸同源性分析 |
| 1.2 人/猪OSBPL2蛋白二级与三级结构分析 |
| 2 OSBPL2 敲除PFFS单克隆细胞系的构建 |
| 2.1 猪OSBPL2基因敲除靶点序列的验证 |
| 2.2 CRISPR/Cas9 针对猪OSBPL2 基因打靶质粒的构建 |
| 2.3 OSBPL2 敲除巴马小型猪PFFs的筛选及基因型鉴定 |
| 3 OSBPL2敲除巴马小型猪模型建立 |
| 3.1 OSBPL2敲除巴马小型猪基因型鉴定 |
| 3.2 OSBPL2的组织学表达水平检测 |
| 4 OSBPL2敲除巴马小型猪表型检测 |
| 4.1 听力学检测 |
| 4.2 耳蜗组织的形态学分析 |
| 4.3 血脂参数统计 |
| 4.4 动脉血管苏丹Ⅲ染色 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附件 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（6）Efr3a敲减减轻耳蜗螺旋神经元退化变性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 绪论 |
| 第一部分 :Efr3a基因敲减小鼠感音性耳聋动物模型的构建 |
| 1 引言 |
| 2 仪器与材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 第二部分 :Efr3a基因敲减能减轻耳蜗毛细胞破坏后诱发的螺旋神经元及耳蜗神经末梢的退化变性 |
| 1 引言 |
| 2 仪器与材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 第三部分 :Efr3a基因敲减能减轻老年性耳聋小鼠耳蜗螺旋神经元的退化变性 |
| 1 引言 |
| 2 仪器与材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 第四部分 :Efr3a基因敲减减轻小鼠螺旋神经元及耳蜗神经末梢退化变性的作用机制 |
| 1 引言 |
| 2.仪器与材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 综述 耳蜗螺旋神经元退化变性机制的研究现状 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（7）Pou4f3基因突变小鼠的模型建立及听力学机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1. Pou结构域及Pou4f3基因结构 |
| 2. POU4F3在人类耳科学中的研究进展(DFNA15的研究进展) |
| 3. 模式动物Pou4f3基因功能及受调控的下游靶基因研究 |
| 参考文献 |
| 第二章 人类遗传性聋DFNA15的动物模型Pou4f3~(△/+)小鼠的构建、功能学及组织形态学分析 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 转录因子Pou4f3对Espin表达调控影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 药物挽救实验 |
| 材料及方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 总结与展望 |
| 论文总结 |
| 论文创新点 |
| 论文待改进之处 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 待发表论文 |
| 致谢 |
（8）BDNF及NT-3的混合液对耳蜗螺旋神经节细胞的影响（论文提纲范文）
| 缩略词表(以字母顺序排列) |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 主要试剂及仪器 |
| 1.1.3 试剂配方 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 实验分组及处理因素 |
| 1.2.2 建立动物模型 |
| 1.2.3 标本制作方法 |
| 1.2.4 耳蜗切片制作步骤 |
| 1.2.5 统计学处理 |
| 结果 |
| 2.1 光学显微镜结果 |
| 2.1.1 耳蜗病理切片的形态学观察 |
| 2.1.2 耳蜗螺旋神经节细胞密度的比较 |
| 2.2 透射电镜结果 |
| 2.2.1 SGCs神经元的形态观察 |
| 2.2.2 SGCs有髓神经纤维的形态观察 |
| 2.2.3 SGCs细胞器的形态观察 |
| 讨论 |
| 3.1 耳蜗螺旋神经节细胞的损伤与耳聋 |
| 3.2 哇巴因与耳蜗螺旋神经节细胞 |
| 3.3 BDNF、NT-3与耳蜗螺旋神经节细胞 |
| 3.4 可能存在的问题 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（9）神经营养素-3对兔桡骨骨折愈合影响的观察（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 中英文对照缩略表 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器设备 |
| 2.2 主要溶液、试剂 |
| 2.3 试验动物及分组 |
| 2.4 试验方法 |
| 2.5 统计学分析、处理 |
| 第三章 试验结果 |
| 3.1 X线观察 |
| 3.2 碱性磷酸酶(ALP)测定 |
| 3.3 组织学观察 |
| 3.4 骨折处的NT-3阳性面积率及OD值的表达 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 脑外伤及骨折模型的建立 |
| 4.2 碱性磷酸酶(ALP)与骨折愈合的关系 |
| 4.3 血脑屏障通透性的改变以及神经营养素-3(neurotrophin 3,NT-3)的含量变化 |
| 4.4 神经营养素-3促进骨折的愈合 |
| 4.5 脑外伤后多种因子促进骨折愈合 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 攻读学位期间主要成果 |
| 致谢 |
（10）NT-3对哇巴因损伤耳蜗螺旋神经节细胞后的影响（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 第二章 实验结果 |
| 2.1 选择性损伤耳蜗螺旋神经节细胞动物模型建立的结果 |
| 2.2 NT-3对损伤的耳蜗螺旋神经节细胞的保护作用结果 |
| 第三章 讨论 |
| 结论 |
| 可能存在的问题 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
四、内耳相关性BDNF和NT-3的研究进展（论文参考文献）
- [1]NSC联合OEC移植对SNHL模型大鼠耳蜗细胞凋亡的研究[D]. 曾友根. 南昌大学, 2020(08)
- [2]脉冲电磁场激励骨髓间充质干细胞修复脊髓损伤的实验研究[D]. 李玉琳. 天津医科大学, 2019(02)
- [3]Neuritin对长爪沙鼠耳蜗螺旋神经节损伤的保护作用[D]. 桂飞. 杭州师范大学, 2019(01)
- [4]OTOF基因突变所致耳聋患者来源iPSC的建立与基因矫正[D]. 刘骁. 浙江大学, 2019(03)
- [5]利用CRISPR/Cas9技术建立OSBPL2基因敲除耳聋巴马小型猪模型[D]. 曾华沙. 南京医科大学, 2018(01)
- [6]Efr3a敲减减轻耳蜗螺旋神经元退化变性的研究[D]. 胡海霞. 上海交通大学, 2017
- [7]Pou4f3基因突变小鼠的模型建立及听力学机制研究[D]. 朱光洁. 南京大学, 2017(01)
- [8]BDNF及NT-3的混合液对耳蜗螺旋神经节细胞的影响[D]. 蒋凤. 昆明医科大学, 2016(02)
- [9]神经营养素-3对兔桡骨骨折愈合影响的观察[D]. 刘武夷. 中南大学, 2014(03)
- [10]NT-3对哇巴因损伤耳蜗螺旋神经节细胞后的影响[D]. 王美兰. 昆明医科大学, 2014(01)